嬰幼兒配方粉生產中克羅諾桿菌溯源研究

蘇秀敏,張艷,陳佳,陳進,秦明倩,甘辛,李鳳琴,楊保偉

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產品質量監督檢驗中心），陜西富平 711700；3.石家莊學院化工學院，石家莊 050035；4.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

0 引言

克羅諾桿菌（Cronobacter，原稱阪崎腸桿菌），是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，存在于淡水、土壤、污水、蔬菜、動物和人類的糞便中。克羅諾桿菌為食源性條件致病菌，對大多數人而言不致病，但對于特殊人群、尤其是早產嬰兒和免疫力低下的嬰幼兒危害極大，往往導致新生兒腦膜炎、壞死性小腸結腸炎和菌血癥，并可引起嚴重的神經系統后遺癥，甚至死亡[1]。研究表明，嬰幼兒配方乳粉是克羅諾桿菌感染嬰幼兒的主要源頭[2]。

克羅諾桿菌抗干燥能力極強，室溫下，在被污染的乳粉中存在兩年半以上依然保持活性[3]，不僅流行于嬰幼兒乳粉、甜點等食品之中，也存在于食品加工廠以及家庭環境[4-7]。在我國，已有在臨床、食品、學生宿舍和食堂環境中檢出克羅諾桿菌的報道[8]。自1961年由克羅諾桿菌引起的腦膜炎病例被首次報道后，在我國安徽阜陽引起“大頭娃娃”事件的劣質嬰幼兒配方乳粉以及相關衛生檢疫樣品中陸續檢出了該菌，并推測其主要來源于環境[9-11]。2012-2014年間，重慶、溫州、上海和四川等地也相繼報道了克羅諾桿菌污染引起的病例，對源于四川的菌株采用脈沖場凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）溯源分析后，表明污染來源于奶粉沖調環境[12-15]。因此，對克羅諾桿菌污染的全方位預防與監控尤為重要。

本研究基于陜西省兩家嬰幼兒配方粉生產企業，結合其生產工藝，采集其嬰配粉生產所用原材料到成品的所有樣品及生產環境樣品，參考國標GB 478940-2016對其中的克羅諾桿菌進行分離，對分離株進行鑒定和分型，以期追溯出克羅諾桿菌對生產造成污染的關鍵點，為制定有的放矢、切實有效的克羅諾桿菌污染防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

針對企業生產中遇到的克羅諾桿菌污染問題，2016年7月起至2017年6月，對陜西省兩個嬰幼兒配方乳粉加工廠（分別命名為YT和SF）從原料到成品及其生產環境每月采樣一次，共計1 246份，進行克羅諾桿菌污染追溯。其中YT廠采樣1 051份，SF廠采樣195份。樣品分為平皿沉降樣（P）、涂抹樣（T）、粉末樣（F）、液態樣（Y）4種類型。采樣對象主要為配方粉加工用原輔料（包括：原料羊乳、濃縮乳、低聚果糖等），成品粉，車間環境（包括：潔凈區與非潔凈區門把手、內包人員鞋底、凈化系統與潔凈車間、排風口等），加工車間設備（包括：流化床、成品傳送帶、混料罐罐體等）以及工廠周邊土壤等。樣品按照廠家+樣品類型+采樣地+平行號進行編號（例：YTF01-1）。

1.1.2 主要儀器與試劑

高速離心機，德國Eppendorf公司；培養箱，北京科偉實驗儀器有限公司；基因擴增儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；-80℃超低溫冰箱，日本三洋公司。

緩沖蛋白胨水（BPW）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、克羅諾桿菌顯色培養基等購自北京陸橋技術股份有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Maker、PCR buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2 克羅諾桿菌分離鑒定

克羅諾桿菌分離參考GB 478940-2016《食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》進行。稱取檢樣100 g（mL）加入到900 mL BPW增菌液中，36 °C培養18 h；吸取1 mL增菌液轉于10 mL mLST-Vm肉湯培養基，44 °C培養24 h；取增菌培養物1環，劃線接種于克羅諾桿菌顯色培養基平板；挑取1～5個藍綠色可疑單菌落，劃線接種于TSA平板，25 °C培養48 h；以棉簽涂抹，而后將菌體懸浮于LB-甘油（50%/50%）中，-80 °C保存，備用。

對于空氣沉降樣，將取樣用TSA瓊脂平板置于25 °C培養48 h，挑取1～5個黃色可疑菌落，分別將其劃線于克羅諾桿菌顯色培養基培養，將藍綠色菌落劃線于TSA平板培養，保存，待鑒定。

對于環境涂抹樣，涂抹后將棉拭子頭部用無菌剪刀剪斷，保存于裝有20 mL BPW的無菌離心管中。36℃培養18 h后，分別使用mLST-Vm肉湯、克羅諾桿菌顯色培養基和TSA分離得到疑似菌，保存、備用。

1.3 PCR鑒定

1.3.1 基因組DNA提取

用接種環蘸取保存于LB/甘油的疑似克羅諾桿菌，劃線接種于LB平板，37 °C過夜培養。挑取少量菌體，使其均勻分散于無菌蒸餾水中，100°C裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.2 PCR擴增用引物和條件

使用克羅諾桿菌特異性基因ompA擴增引物ompA-F（5’-GGATTTAACCGTGAACTTTTCC-3’）和ompA-R（5’-CGCCAGCGATGTTAGAAGA-3’）擴增ompA基因[16]，對疑似克羅諾桿菌進行PCR鑒定。PCR產物大小為469 bp。PCR擴增ompA鑒定時以ATCC29544作為陽性對照。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳

吸取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為1%。電泳結束后用凝膠成像系統進行成像，記錄結果。

1.4 脈沖場凝膠電泳分型

按照美國疾病預防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention，CDC）制定的克羅諾桿菌PFGE分型標準操作程序進行[17]。制膠、酶切、電泳和染色處理后使用BioNumerics軟件對DNA酶切圖譜進行處理及聚類分析。

1.5 數據分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行處理，用Minitab進行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

1 246份樣品中共檢出克羅諾桿菌陽性樣品14份，檢出率為1.12%，分離得到33株克羅諾桿菌。YT廠共檢出6份陽性樣品，分離得到20株克羅諾菌株；SF廠共檢出8份陽性樣品，分離得到13株克羅諾桿菌，如表1所示。

表1 克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

（續表1）

2.1.1 不同廠家克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

SF廠采集的樣品中克羅諾桿菌陽性樣品檢出率極顯著高于YT工廠（P＜0.01），見圖1。

圖1 不同廠家克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

2.1.2 不同來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

原輔料中克羅諾桿菌陽性樣品檢出率為1.03%，環境樣品中陽性樣品檢出率為1.14%，檢出率間無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表2 不同來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

原輔料中檢出的2份克羅諾桿菌陽性樣品均為乳糖粉，均來自YT工廠。12份陽性環境樣品中，7份為工廠邊土壤，3份來源于YT工廠，4份來源于SF工廠，見表3。在工作人員鞋底、后包車間、凈化系統進風口和車間陰溝環境中均檢出克羅諾桿菌陽性樣品。其中，工作人員鞋底（100.0%）克羅諾桿菌陽性樣品的檢出率顯著高于后包車間樣品（3.03%）。克羅諾桿菌陽性土壤、后包車間、凈化系統進風口和車間陰溝樣品檢出率間無顯著性差異，如表2所示。結果表明，乳糖粉、乳粉生產內外部環境中的克羅諾桿菌可能是導致該菌污染成品的重要原因之一。

表3 不同廠家來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

2.1.3 不同狀態樣品中克羅諾桿菌檢出情況

粉末樣和平皿沉降樣中克羅諾桿菌檢出率間存在顯著差異（P＜0.05），其他狀態樣品檢出率間無顯著差異，如圖2所示。液態樣中未檢出陽性樣品，粉末樣多為乳粉加工輔料，陽性樣品檢出率最高2.26%，表明乳粉生產過程中使用的粉末狀原輔料可能是導致克羅諾桿菌污染的重要原因之一。

圖2 不同狀態樣品中克羅諾桿菌檢出情況

2.1.4 不同采樣時間克羅諾桿菌檢出情況

2016到2017年間，4個季度克羅諾桿菌陽性樣品檢出率有差異，如表1所示。2016年第3季度陽性樣品檢出率最高（2.33%），第1季度和第2季度均無克羅諾桿菌陽性樣品檢出。第2季度和第3季度克羅諾桿菌檢出率有極顯著差異（P＜0.01），其他季度間樣品檢出率無顯著差異，如圖3所示。

圖3 不同季度克羅諾桿菌檢出情況

2.2 克羅諾桿菌PFGE分子分型結果

33株克羅諾桿菌Xba I酶切、PFGE電泳、BioNumerics軟件聚類分析后，共得到14種DNA指紋圖譜，菌株間相似度為85.9%～100.0%，見圖4。按92%的相似度，33株菌的基因型可以分為2個大簇、5個小簇和1個單獨的基因型，分別為IA、IB、IC、ID、IE、IF、IG、IH。IG簇內各菌株的同源性較高。盡管分離的克羅諾桿菌來源于不同廠家、不同時間、不同樣品，但卻有較高的同源性。表明該2個工廠的生產環境可能已被克羅諾桿菌污染。

圖4 33株陽性克羅諾桿菌PFGE圖譜聚類分析

3 討論

由于新生兒被克羅諾桿菌感染后死亡率很高（40%～80%）[18]，且該菌在食品加工過程中易形成生物膜，具有較強的耐熱性，因此，近年來克羅諾桿菌被廣泛關注[19-20]。對包括克羅諾桿菌在內的致病菌進行分子分型溯源，精確定位污染來源，切斷傳播途徑，可為有效應對致病菌污染、保障食品安全提供技術支持。脈沖場凝膠電泳是食源性致病菌溯源應用最廣泛的技術之一，其具有特異性高、重復性好、結果可靠等優點，已成功應用于克羅諾桿菌分型溯源研究[21-23]。

本研究中，2個嬰幼兒配方乳粉加工廠克羅諾桿菌陽性樣品檢出率為1.12%，說明2廠均有一定程度的阪崎克羅諾污染，存在潛在的危害。陳曦[20]等在貴州采集市售嬰兒配方乳粉350份，分離出21株克羅諾桿菌，污染率為6%。胡靜等[24]調查了中國6個省份嬰幼兒配方羊乳粉中克羅諾桿菌的流行情況，檢出率為2.18%。雖然該2項調查研究的對象為成品嬰幼兒配方粉，但克羅諾桿菌陽性樣品檢出率均與此次調查結果接近。

SF廠克羅諾桿菌陽性樣品檢出率（4.10%）明顯高于YT廠（0.57%），雖然這一結果可能與采樣樣本數量有關，也可能由于2個工廠生產規模不同，大型企業對原料、生產、運輸等環節管控較嚴，衛生情況較好所致[25]。SF工廠檢出的13株克羅諾桿菌中有9株來自于土壤，YT廠家檢出20株克羅諾桿菌中有12株來自于土壤，這一現象也證實了林學海等[26]關于嬰幼兒食品作為克羅諾桿菌污染途徑之一，最主要的特征是外源性，即外部環境的影響這一觀點。因此，兩個工廠均需要對生產的外部環境嚴加把控和管理。YT廠檢出的5份陽性樣品中有2份為乳糖粉，可能與該月份供貨商提供原輔料相關，提醒該企業對于原輔料的質量把關要加緊。不同季度克羅諾桿菌陽性樣品檢出率有差異，與周厚德等[25]的調查結果不一致，分析可能與采樣量差異有關。

PFGE結果表明，2016年9月和10月分離自工廠邊土壤的陽性菌株聚類后幾乎都處于一大簇，表明環境中存在的克羅諾桿菌親緣關系較近。一般而言，如菌株DNA圖譜相似性為100%，則它們屬于同一PFGE型別，基因同源性很高。本研究發現多株菌相似性為100%，表明兩個嬰幼兒配方粉加工廠家受污染的克羅諾桿菌類型相對集中。YT廠IA簇源于后包車間的一株陽性菌株（P08）與另一株源于工廠邊土壤的陽性菌株（F19）呈現高度相似性，表明其在生產過程中可能來自同一污染源。ID簇來自乳糖粉（F08）的7株菌相似度大于98%，表明分離于同一輔料的菌株具有較高同源性。IE簇中SF廠中6株菌呈現高度相似性，這些菌株均來自于2016年9月的工廠邊土壤樣本。SF廠IB簇源于工廠邊土壤的一株陽性菌株（F19）與源于車間陰溝的一株陽性菌株（T19），IH簇源于工廠邊土壤的一株陽性菌株（F19）與源于凈化系統進風口的一株陽性菌株（T18），它們兩兩之間均分別呈現出高度相似性，表明其可能存在共同的污染源或存在交叉污染。

本研究初步發現陜西省2家嬰幼兒配方粉加工廠原輔料與環境均存在不同的污染，SF廠家污染相對較嚴重。乳粉糖、工作人員鞋底、工廠邊土壤、后包車間、凈化系統進風口和車間陰溝等均可能是克羅諾桿菌污染的關鍵點。本研究可為SF和YT 2個嬰配粉生產工廠對克羅諾桿菌污染預防提供數據和理論參考，也可為其他同類食品生產廠家克羅諾桿菌防控提供依據。