固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚

楊東東，李實(shí)飛，林正鋒，謝文強(qiáng)，楊雪蓮，王朝政

（1.海口海關(guān)技術(shù)中心，海口 570311；2.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048；3.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海口 570228）

0 引言

乙基麥芽酚是一種增香劑，能夠顯著改善食品風(fēng)味，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1-2]，但大量攝入會危害人體健康[3]，我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嬰幼兒配方食品不得添加食用香料[4]。目前乙基麥芽酚的檢測方法主要有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]、液相色譜法[9-11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]、離子色譜法[15]、電化學(xué)法[16]、光度法[17]、拉曼光譜法[18]等。乳粉中乙基麥芽酚的檢測前處理過程多采用水相提取稀釋凈化后分析，存在檢測限較高，基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)等缺點(diǎn)[11-12]。本文采用水-醚體系對乳粉樣品進(jìn)行提取，經(jīng)堿液反萃后采用固相萃取進(jìn)行凈化和濃縮后液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，以期建立一種靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚的檢測方法，保障乳粉質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、甲酸、二氯甲烷均為色譜純，美國TEDIA公司；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉，均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；乙基麥芽酚（純度≥99%），美國Sigma公司。

HSS T3色譜柱（150×2.1 mm,2.5 μm,美國Waters公司）；C18固相萃取柱（3 mL）美國安捷倫公司；HLB固相萃取柱（3 mL）美國Waters公司；TQD超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；KQ3200DE超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；MS3渦旋儀，德國IKA公司；320 R低溫離心機(jī)，德國Hettich公司；Advantage A10超純水凈化儀，美國Millipore公司；Genevac EZ-2型溶劑蒸發(fā)工作站，英國SP Scientific公司。乳粉樣品選用一段乳粉，市售。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法

稱取2 g試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL溫度為50℃的水，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min渦旋混勻2 min，溫度40℃下超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入10.0 mL叔丁基甲醚，轉(zhuǎn)速3 000 r/min渦旋混勻3 min,再加入10 g無水硫酸鈉除水，轉(zhuǎn)速3 000 r/min渦旋混勻2 min，轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心3 min，吸取上清液5 mL轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液反萃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min渦旋混勻1 min后，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心3 min，用移液器準(zhǔn)確移取下層清液到試管中，溫度40℃下用Genevac EZ2溶劑蒸發(fā)工作站濃縮20 min以除去微量的叔丁基甲醚，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，過柱。先后加入3 mL甲醇，3 mL超純水活化固相萃取柱，然后上樣，重力過柱后，用5 mL純水淋洗，棄去淋洗液，接著用5 mL注射器抽至凈干。最后用0.9 mL甲醇洗脫，接收洗脫液后用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測定。

1.2.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm,2.5 μm,Waters）；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣體積為3 μL；柱溫為30℃；流動相：A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水，梯度洗脫程序?yàn)?～2.0 min，20%A，2.0～2.1 min，20%A～80%A，2.1～4.0 min，80%A，4.0～4.1 min，,80%A～98%A，4.1～5.0 min，98%A，5.0～6.0 min，98%A～20%A。

MS條件：電噴霧正離子源(ESI+)，毛細(xì)管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150℃，脫溶劑管度：350℃；霧化氣：150 L/hr氮?dú)猓桓稍餁猓?50 L/hr氮?dú)猓慌鲎矚猓簹鍤狻呙枘Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測模式(MRM)，具體條件見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Masslynx工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析采集分析質(zhì)譜圖，外標(biāo)法定量。試驗(yàn)結(jié)果采用平均值表示，每個試驗(yàn)平行3次，采用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本文比較了水-乙腈和水-甲醇流動相體系,發(fā)現(xiàn)以水-甲醇作為流動相時,乙基麥芽酚定量定性離子對的響應(yīng)明顯優(yōu)于水-乙腈流動相體系。并在此基礎(chǔ)上考察了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)添加甲酸后，質(zhì)譜響應(yīng)增強(qiáng)，0.05%甲酸水和0.1%甲酸水響應(yīng)無顯著差別，故最終采用甲醇-0.05%甲酸水作為流動相。配置1 μg/mL的乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)液于進(jìn)樣瓶中，采用儀器自動進(jìn)樣進(jìn)入質(zhì)譜儀，在Masslynx軟件中設(shè)置質(zhì)譜條件，并對標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行離子調(diào)諧，確定母離子(m/z為141.1)對應(yīng)的最佳質(zhì)譜條件，根據(jù)響應(yīng)穩(wěn)定、信號強(qiáng)度較高碎片確定定量離子對（141.1＞126.1）和定性離子對（141.1＞71.1）。

2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱填料對目標(biāo)物的吸附和洗脫能力有重要的影響，本實(shí)驗(yàn)通過配制0.1 μg/mL乙基麥芽酚水溶液，經(jīng)過上柱淋洗洗脫步驟后收集洗脫液分析，考察C18柱和HLB柱對乙基麥芽酚的富集效果。結(jié)果表明C18柱回收率約為20%，HLB柱的回收率超過90%，因此本實(shí)驗(yàn)選用HLB柱作為富集凈化柱。

2.3 固相萃取柱條件的確定

由于分取的水相液體為堿性，因此本次實(shí)驗(yàn)研究不同pH值是否對固相萃取柱的富集效果有影響。試驗(yàn)用鹽酸和氫氧化鈉配制系列pH(pH 1～13)的溶液。向5 mL不同pH值水溶液中添加乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)溶液10 ng，上柱，淋洗、1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液上機(jī)分析。不同pH條件下洗脫液中的乙基麥芽酚回收率見圖1，由圖可知，在酸性及中性的條件下，HLB柱可實(shí)現(xiàn)對乙基麥芽酚的富集，在堿性條件下，HLB柱對乙基麥芽酚的富集效果十分不理想，這是由于乙基麥芽酚呈弱酸性，在堿性條件下發(fā)生離子化使其在HLB柱上的吸附變?nèi)酢Ｒ虼嗽谌〕鰤A性液體后，需要用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至酸性條件，再進(jìn)行過柱凈化。

圖1 不同pH值標(biāo)樣固相萃取回收率情況

然而，在實(shí)際樣品檢測過程中，樣品經(jīng)過前處理過程后，取出含有標(biāo)樣的堿液5 mL，經(jīng)HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0后，過柱，洗脫后回收率低于20%，于是收集過柱液、淋洗液、洗脫液分別進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過柱液和淋洗液中含有大量的乙基麥芽酚。這是由于堿液中含有微量的叔丁基甲醚，其在上樣和淋洗過程中會帶出乙基麥芽酚。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用二氯甲烷萃取除去水中微量叔丁基甲醚及通過劑蒸發(fā)工作站除去叔丁基甲醚兩種方式處理，再取水相調(diào)節(jié)pH后過柱，各階段溶液中乙基麥芽酚含量見表2，結(jié)果表明，經(jīng)過二氯甲烷萃取過后的水相在過柱時不會有乙基麥芽酚損失，但是在淋洗過程仍有大量目標(biāo)物會隨著水進(jìn)入到淋洗液中，而采用溶劑蒸發(fā)工作站除去叔丁基甲醚后，僅在洗脫液中有乙基麥芽酚，回收率超過90%，故最終實(shí)驗(yàn)選擇先用溶劑蒸發(fā)工作站除去叔丁基甲醚后再進(jìn)行固相萃取柱凈化和濃縮。在此條件下，對應(yīng)的樣品和加標(biāo)樣品譜圖見圖2。

表2 樣品過柱過程各階段溶液中乙基麥芽酚含量

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和乳粉樣品MRM圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用液質(zhì)聯(lián)用分析復(fù)雜基質(zhì)時通常存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)對液質(zhì)檢測有重要影響[19]，因此需要考察本方法的基質(zhì)效應(yīng)。以甲醇溶劑和空白基質(zhì)配制2～100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)兩條曲線的斜率計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（ME）=（1-空白基質(zhì)配制配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）×100%[20]。空白基質(zhì)配制配制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=205.01X+196.67，溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=179.53X+101.23，基質(zhì)效應(yīng)為12.5%。說明乳粉基質(zhì)對乙基麥芽酚有基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)微弱。本實(shí)驗(yàn)基質(zhì)效應(yīng)遠(yuǎn)低于寧宵等采用的凈化方法，這可能是由于本方法采用有機(jī)溶劑提取，可除去大量的水溶性物質(zhì)，大大降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 線性范圍和定量限

以空白基質(zhì)液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，（質(zhì)量濃度范圍為2.0～100 ng/mL），在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為:Y=205.01X+196.67，相關(guān)系數(shù)大于0.999。根據(jù)10倍信噪比，并計(jì)入試樣量和定容體積，計(jì)算定量限，定量限為2.0 μg/kg。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在上述確定的色譜條件和前處理?xiàng)l件下，進(jìn)行5個不同濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，其回收率與精密度見表3，從表中可以看出，乙基麥芽酚在5種不同添加水平下，其回收率都比較穩(wěn)定，在71.2%～110.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說明本方法檢測穩(wěn)定性較好。

表3 嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚加標(biāo)回收結(jié)果

3 結(jié)論

綜上所述，本文建立了固相萃取-超高效液相色譜質(zhì)譜測定嬰幼兒乳粉中乙基麥芽酚含量，前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液反萃后用溶劑蒸發(fā)工作站除去微量叔丁基甲醚后，再經(jīng)HLB固相萃取柱實(shí)現(xiàn)同步凈化和濃縮。結(jié)果表明該法具靈敏度高、檢測結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣，有望為相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。