固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中辛基酚和正辛基酚

王浩，李星，張文超，陳江龍，巴冬梅，冉令磊

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京 100094）

0 引言

辛基酚和正辛基酚是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1-2]，可引起生物的一些病變，甚至導(dǎo)致癌癥[3-9]。環(huán)境中的辛基酚和正辛基酚易通過食物鏈在體內(nèi)富集[10-11]。奶牛食用了污染的飼料后，牛奶中就可能會(huì)有辛基酚和正辛基酚殘留。目前，測定辛基酚和正辛基酚的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、液相色譜法[14-15]和液相色譜-質(zhì)譜法等[16-19]。但液相色譜法易產(chǎn)生假陽性，氣相色譜-質(zhì)譜法前處理繁瑣，不利于批量樣品的快速篩查。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對痕量殘留物質(zhì)強(qiáng)大的定性定量能力，符合當(dāng)前食品檢測追求的快速高效的要求。本研究建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中辛基酚和正辛基酚，此方法前處理簡單、靈敏度高，適用于牛奶中辛基酚和正辛基酚的準(zhǔn)確測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：配電噴霧源（ESI）和Agilent1290Ⅱ型液相色譜儀；GL-88型渦旋混合器；KQ-5200型超聲波清洗儀；N-EVAP.TM112型氮吹儀。

辛基酚、正辛基酚、辛基酚-13C6、正辛基酚-D17標(biāo)準(zhǔn)品，w≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇和氨水：均為HPLC級；牛奶樣品，購于超市；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水（≥18 MΩ·cm）；PRiME HLB固相萃取柱：200 mg/6cc，美國Waters公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg辛基酚、正辛基酚、辛基酚-13C6、正辛基酚-D17標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃保存，保存期6個(gè)月。再分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)和同位素儲(chǔ)備液，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/L的中間液，-18℃保存，有效期3個(gè)月。檢測時(shí)，根據(jù)需要配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

稱取1.00 g樣品，精確至0.01 g，置于10 mL具塞比色管中，加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL，氨水乙腈（1∶9，體積比）定容至刻度，具塞后劇烈震搖片刻，超聲提取10 min，吸取2 mL上清液，過PRiME HLB固相萃取柱，棄去前5滴，準(zhǔn)確收集1.5 mL的凈化液至1.5 mL的進(jìn)樣瓶中，氮?dú)獯蹈桑儆?.3 mL乙腈充分溶解后過0.22 μm有機(jī)濾膜，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件為色譜柱：安捷倫Poroshell 120 PFP色譜柱（2.0 mm×150 mm，5μm）；流速0.30 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣體積2 μL；流動(dòng)相為甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，體積比）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式掃描；多反應(yīng)檢測的檢測方式；干燥氣為N2；霧化氣壓力為275.8 kPa；干燥氣溫度為300℃；干燥氣流速為5 L/min；鞘氣溫度為350℃；鞘氣流速為11 L/min；毛細(xì)管電壓為3 500 V；定性離子對、定量離子對及碰撞能量如表1所示。

表1 化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

辛基酚和正辛基酚易溶于乙醇、丙酮等有機(jī)試劑,且牛奶基質(zhì)復(fù)雜，富含脂肪和蛋白質(zhì)，因此分別比較了乙醇、乙腈、丙酮和氯仿去除樣品中蛋白質(zhì)的效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈去除蛋白的效果最好，如圖1所示，因此選取乙腈為提取溶劑；辛基酚和正辛基酚都是負(fù)離子模式電離，為了提高離子化效率，本方法采用氨水乙腈(1∶9，體積比)提取樣品；分別對比了PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱、Oasis HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱、安杰爾C18（6cc/200 mg）固相萃取柱、安杰爾PCX（6cc/200 mg）固相萃取柱的凈化效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRiME HLB（6cc/200 mg）固相萃取柱效果較好，其能吸附非極性干擾物質(zhì)而不影響目標(biāo)化合物的回收率，特別是對牛奶基質(zhì)中脂肪和磷脂，去除效率高達(dá)95%以上；其余3種固相萃取柱均需要活化處理，而且提取液氮吹后會(huì)有油脂殘留，因此選取PRiMEHLB（6cc/200 mg）固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化；為了提高目標(biāo)化合物檢測靈敏度，該方法采用氮吹進(jìn)行富集，最終樣品的稀釋倍數(shù)為1.0。

圖1 乙醇、乙腈、丙酮和氯仿去除蛋白效果圖

表2 4種固相萃取柱的凈化效果 %

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本方法分別采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm,1.8 μm）、資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm,5 μm）、AgilentPoroshell120PFP色譜柱（100mm×4.6mm，2.7μm)和HypersilGOLD C18色譜柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述4款色譜柱均能有效分離辛基酚和正辛基酚，但AgilenPoroshell 120 PFP色譜柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）比亞2微米柱減小了50%的壓力，而且可以同時(shí)與0.4 MPa和0.6 MPa液相色譜相匹配，所以最終選擇Agilent Poroshell 120 PFP色譜柱（50 mm×4.6 mm,1.9 μm）。

2.2.2 色譜分離條件選擇

烷基酚類化合物自身結(jié)構(gòu)中有烷基酚，流動(dòng)相的酸堿度對于烷基酚類物質(zhì)的電離效果有不同的影響。首先分析了以甲醇作為有機(jī)相時(shí)，不同酸度水相(1‰甲酸水、水、1‰氨水)對于辛基酚和正辛基酚的峰型及分離情況；以純水為水相時(shí)辛基酚和正辛基酚的信號強(qiáng)度作為參考標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)使用1‰甲酸溶液時(shí)，兩個(gè)化合物信號基本消失，可能是因?yàn)橘|(zhì)子會(huì)抑制兩個(gè)化合物在離子源中的電離；當(dāng)使用1‰氨水溶液時(shí)，辛基酚和正辛基酚的信號分別增強(qiáng)了55%和60%，因此選擇1‰氨水作為水相。隨后分析了以1‰氨水作為水相，比較甲醇和乙腈對BPA和BPS響應(yīng)信號的影響。發(fā)現(xiàn)二者無明顯差異，考慮到甲醇在色譜柱上有更好的分離效果，因此選用甲醇和1‰氨水溶液作為方法流動(dòng)相。

為了提高檢測效率，本方法使用的流動(dòng)相為甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，v/v）進(jìn)行等度洗脫；在檢測過程中，儀器運(yùn)行的0～5 min進(jìn)廢液，5～7 min待測液再進(jìn)質(zhì)譜分析，這樣既能去除測定液中強(qiáng)極性和中等極性的雜質(zhì)，又能盡可能縮短質(zhì)譜分析時(shí)間，同時(shí)保護(hù)質(zhì)譜免受污染。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用甲醇和1‰氨水溶液（9∶1，v/v）的流動(dòng)相能在7 min內(nèi)完成辛基酚和正辛基酚的有效分離。圖2為辛基酚和正辛基酚的MRM色譜圖。

圖2 辛基酚和正辛基酚的MRM色譜圖

2.2.3 進(jìn)樣量的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣量為2 μL，可以滿足方法的檢出限和定量限，同時(shí)進(jìn)樣量少可以減少樣品提取液中雜質(zhì)污染色譜柱，從而延長色譜柱壽命，還可以減少雜質(zhì)對質(zhì)譜離子源的污染。

2.3 定量方法的選擇

樣品中除目標(biāo)物以外的組分常常對目標(biāo)物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過比較目標(biāo)化合物在牛奶中與純?nèi)軇┲械臉?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價(jià)辛基酚和正辛基酚的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)目標(biāo)化合物在基質(zhì)中與純?nèi)軇┲械男甭时戎敌∮?時(shí)，表明基質(zhì)對其具有電離抑制作用；反之，則表明具有電離增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛基酚和正辛基酚的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.67和0.71，說明牛奶中的其它成分對這兩種物質(zhì)的測定造成電離抑制作用。因此有必要采用同位素內(nèi)標(biāo)法來彌補(bǔ)前處理過程中的差異對檢測定量結(jié)果的影響，提高方法定量的準(zhǔn)確性。本方法選擇辛基酚-13C6和正辛基酚-D17做為相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析。

2.4 線性范圍與檢出限

配制標(biāo)準(zhǔn)系列混合工作液（辛基酚和正辛基酚質(zhì)量濃度依次為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL，二者的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10.0 ng/mL）。以目標(biāo)物的峰面積（y)對質(zhì)量濃度（x）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)選擇空白樣品，定量添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理測定。當(dāng)測試液所得譜圖的信噪比大于3時(shí)，將此添加量定為最低檢出限，當(dāng)信噪比大于10，將此添加量定為最低定量限，結(jié)果如表3所示。

表3 辛基酚和正辛基酚的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限

2.5 方法的回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取空白樣品18份，每份1.0 g，平均分為3組，分別定量加入目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。第一組添加水平：辛基酚和正辛基酚均為2.0 μg/kg；第二組添加水平：辛基酚和正辛基酚均為4.0 μg/kg；第三組添加水平：辛基酚和正辛基酚均為10.0 μg/kg。

按上述實(shí)驗(yàn)方法提取后進(jìn)行測定，測定結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，辛基酚和正辛基酚不同濃度平均加標(biāo)回收率在88.1%～100.4%之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.48%～7.29%（n=6）。

表4 辛基酚和正辛基酚的加標(biāo)回收率

2.6 實(shí)際樣品檢測

按照上述實(shí)驗(yàn)方法對市場中銷售的10種牛奶樣品（包括脫脂奶、全脂奶、調(diào)制奶和兒童牛奶等）進(jìn)行處理并檢測，辛基酚和正辛基酚均未檢出。牛宇敏等建立了同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物性食品中的雙酚A、壬基酚及辛基酚，此方法中辛基酚的檢出限為0.4 μg/kg，且液體奶樣品中辛基酚未檢出，參照此方法對上述的10種牛奶進(jìn)行測定，辛基酚和正辛基酚均未檢出。上述結(jié)果表明，我國牛奶市場無辛基酚和正辛基酚普遍殘留的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本研究建立了使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定牛奶中辛基酚和正辛基酚殘留的方法。該方法的樣品前處理簡單易行、分析快速，回收率高，定量限及精密度均能滿足殘留檢測要求，能為我國牛奶中辛基酚和正辛基酚污染物殘留的監(jiān)管與乳品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)控提供技術(shù)支撐。