乳腺癌患者Lin28A/B水平與乳腺癌轉移及血管新生的關系

曹渤海 胡 月 明田莉 楊瑞東

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來發病率逐漸升高，且發病呈年輕化趨勢[1]。其具有高侵襲性及易轉移、易復發的特點[2]。研究[3]發現，Lin28A/B作為高度保守的RNA結合蛋白，可抑制抑癌基因的合成并促進腫瘤生成。另外，血管新生是腫瘤轉移的重要因素[4]，血管新生指標血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及血管內皮抑素(endostatin，ES)可以反應血管新生情況，腫瘤細胞的增生促使腫瘤血管新生，血管新生由導致腫瘤轉移的概率增大[5]。目前，有關 Lin28A/B在乳腺癌轉移中的表達及影響研究較少，為此，本文通過對照研究探討Lin28A/B在乳腺癌組織中的表達及與乳腺癌轉移及血管新生的關系，旨為Lin28A/B對乳腺癌發生和發展的影響，及為尋求控制乳腺癌轉移的潛在靶向治療策略提供一定的參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年1月至2020年12月唐山中心醫院及灤州市人民醫院收治的80例女性乳腺癌患者設為觀察組。患者年齡31～70歲，平均(52.25±8.37)歲；絕經47例，未絕經33例；左側乳腺癌42例，右側乳腺癌38例；浸潤性導管癌49例，導管內癌19例，髓樣癌12 例，淋巴結轉移37例； TNM分期：Ⅰ期28例、Ⅱ期34例、Ⅲ期18例。乳腺癌診斷參考同時結合患者臨床表現、體格檢查、影像學檢查、組織病理學等進行診斷。觀察組納入標準：①所有患者均為女性且符合《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2017年版》[6]中乳腺癌診斷標準；②擬行手術治療者；③術前未行放化療等治療；④所有患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：中途轉院治療，脫離實驗者。另納入唐山中心醫院同期女性健康體檢者40例為對照組，年齡29～68歲，平均(51.36±7.64)歲，絕經24例。對照組納入標準：于唐山中心醫院門診行乳腺癌篩查未見異常者；排除標準：疑似乳腺癌者。兩組對象的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經倫理委員會批準(批準文號：TZYL/K/2020-14)。

1.2 方法 比較觀察組患者癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm)Lin28A/B的表達，比較觀察組與對照組血清癌細胞轉移指標基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和血管新生指標VEGF、bFGF 及ES表達水平。采用Pearson相關分析癌組織中Lin28A/B mRNA的表達量與癌細胞轉移及血管新生指標水平之間的相關性。

1.2.1 實時定量PCR檢測Lin28A/B表達 ①收集所有患者術中切除的乳腺癌組織及對應癌旁正常乳腺組織(距腫瘤邊緣5 cm)作為檢測樣本，采集的組織樣本均經DEPC水清洗、拭干后，立即放入液氮中，并于-80℃冰箱保存待測。并收集乳腺癌患者入組后和對照組體檢當日空腹肘靜脈血5 mL，分離血清，置于-80℃冰箱冷凍中待測。②待測樣本進行超聲勻漿，參照Trizol試劑盒操作說明書[7]提取組織總RNA，DEPC水溶解，應用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測總RNA的純度及濃度，再應用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。③參照逆轉錄試劑盒操作說明書進行逆轉錄反應，反應體系為20 μL：Oligo dT Primer 1 μL、總RNA 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、5×PrimeScript Buffer 0.5 μL、PrimeScript RTase 1 μL，DEPC水補至20 μL。反應條件：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，產物置于4℃保存待用。④于Thermo Fisher公司購買Trizol試劑盒；于Takara公司購買PrimeScriptTM逆轉錄酶試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM實時定量 PCR試劑盒；于Thermo Fisher公司購買Nanodrop 2000超微量分光光度計；于ABI公司購買實時定量PCR儀；參照實時定量 PCR試劑盒操作說明書進行操作，反應體系為25 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL,、上下游引物各1 μL、，cDNA模板 2 μL，滅菌蒸餾水補至25 μL。反應條件：95℃ 30 s預變性，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環，以GAPDH 作為內參基因。 Lin28A mRNA引物序列：上游引物5’-TGATGCAGTTGGTCGCTGATGGCA-3’，下游引物5’-AGCCCAATGCCCTCTCTGAGGGCCT-3’； Lin28B mRNA引物序列：上游引物5’-ATGCGGAGCTGCAGCACGATACTATG-3’，下游引物5’-CTAGCGCGCTATGTCGACATTGCATG-3’； GAPDH 引物序列：上游引物5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’，下游引物5’-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3’。本研究采用2-△△CT方法計算目的基因的表達水平，以GAPDH為內參，每組取三個復孔均值，根據各樣本的平均Ct 值，以2-ΔΔCt表示目的基因表達水平。

1.2.2 MMP-2、MMP-9檢測 采用酶聯免疫法檢測MMP-2、MMP-9，操作嚴格按照檢測試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司)說明書進行。

1.2.3 血管新生指標檢測 采用ELISA法檢測血管新生指標VEGF、bFGF 及ES，嚴格按照ELISA法試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司)說明書進行操作。

2 結果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中Lin28A/B mRNA表達量比較 乳腺癌組織中Lin28A/B mRNA的相對表達量分別為(2.57±0.96)、(2.89±0.82)，均明顯高于癌旁組織(1.06±0.52)、(1.11±0.69)，差異均有統計學意義(t=12.370、14.856，P均<0.05)。

2.2 觀察組與對照組血清癌細胞轉移指標水平比較 乳腺癌組血清中MMP-2和MMP-9水平分別為(18.25±3.18)mg/L、(21.91±3.49)mg/L，均明顯高于對照組(4.12±1.41)mg/L、(5.99±1.51)mg/L，差異均有統計學意義(t=11.729、21.056，P均<0.05)。

表1 觀察組與對照組血清癌細胞轉移指標水平比較

2.3 觀察組與對照組血清血管新生指標表達水平比較 乳腺癌組血清中VEGF、bFGF和ES的表達水平均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 觀察組與對照組血清血管新生指標表達水平比較

2.4 癌組織中Lin28A/B mRNA的表達量與癌細胞轉移指標、血管新生指標的相關性 Pearson相關分析顯示，乳腺癌組織中Lin28AmRNA的表達量與MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF水平明顯相關(r=0.523、0.439、0.562、0.461，P<0.05)，與ES無相關性(P>0.05)；Lin28B mRNA的表達量與MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF明顯相關(r=0.546、0.468、0.527、0.449，P<0.05)，與ES無相關性(P>0.05)。見表3。

表3 癌組織中Lin28A/B mRNA的表達量與癌細胞轉移指標、血管新生指標相關性

3 討論

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，雖然早期乳腺癌患者經手術治療聯合放化療的治療效果較好[7]，但臨床對于已發生轉移的乳腺癌患者而言尚缺乏有效的治療手段，因此，探尋乳腺癌的早期診斷標記物及有效的治療靶點對乳腺癌患者的臨床診治意義重大。

Lin28是一種高度保守的RNA結合蛋白，其中Lin28A和Lin28B是主要家族成員[8]，Lin28轉錄后水平可選擇性地阻斷miRNA let-7家族的生物合成過程[9-10]，而Let-7可以進一步通過與mRNA的特定序列結合, 誘導mRNA的剪切或阻遏其翻譯[11-12]。現已證實Lin28可通過對let-7的抑制作用使let-7下游癌相關基因去抑制，進而促進腫瘤的惡性進程[13]。研究[14-15]發現，Lin28家族在人類原發性腫瘤和腫瘤細胞株中高表達，并可能在肝癌、卵巢癌、白血病等多種腫瘤進展及轉移過程中發揮著重要作用。但目前尚不清楚其與乳腺癌轉移的關系。本研究結果顯示，乳腺癌組織中Lin28A/B mRNA的相對表達水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05)，提示Lin28A/B mRNA的表達上調可能參與乳腺癌的發生發展，分析原因可能是Lin28在胞漿中誘導let-7家族的尿苷化，從而使其不能被Dicer酶加工，阻斷具有抑癌基因功能的let-7的生物合成，產生對靶miRNAs的表達抑制，這與Lin28A/B在其他惡性腫瘤中的報道結果一致，且有研究[16]指出，約15%的惡性腫瘤中存在Lin28的異位表達，其高表達與腫瘤的惡性程度也存在相關關系。

惡性腫瘤的重要臨床特征是腫瘤細胞容易侵襲周圍組織及發生遠處轉移，而轉移主要是通過血管新生進行轉移[17]。MMP被證實是腫瘤轉移中的重要參與者，其中MMP-2和MMP-9均是重要成員[18]。新生血管已經被證實為腫瘤細胞的轉移通道，其中 VEGF 和bFGF具有極強的促血管新生作用[19]。有研究發現，ES的增高與惡性腫瘤患者遠處轉移的增加有關[20]。本研究結果顯示，乳腺癌組血清中MMP-2和MMP-9的表達水平明顯高于對照組，推測MMP-2與MMP-9可能通過降解基底膜的膠原蛋白，從而破壞乳腺局部組織結構，促進腫瘤轉移[21-22]，乳腺癌組織中Lin28A/B mRNA的表達量與轉移指標MMP-2、MMP-9呈正相關，提示Lin28A/B對乳腺癌患者的促轉移有一定影響。乳腺癌組血清中VEGF、bFGF和ES高表達，造成新生血管的生成，為腫瘤生長提供了養分，加速腫瘤細胞繁殖[23-24]。通過Pearson相關分析發現，乳腺癌組織中Lin28A/B mRNA的表達量與轉移指標MMP-2、MMP-9及血管新生指標VEGF、bFGF呈正相關，可能與Lin28A/B mRNA激活了目前臨床上公認的血管新生通路PI3K/PTEN/Akt中的蛋白出現磷酸化具有一定的關系[25]，其導致其下游促血管因子VEGF、bFGF的高表達，從而參與腫瘤的發展,但這一推測仍需要后續大量實驗去證實。

綜上所述，Lin28A/B與乳腺癌轉移及血管新生關系密切，可能參與調節乳腺癌的疾病進展，下一步將進行深入的基礎研究，探索Lin28A/B調節乳腺癌轉移及血管生成的具體分子機制，以發現乳腺癌靶向基因治療的新策略。