丁酸鈉植物精油復合制劑對南美白對蝦生長性能、致病性弧菌和非特異性免疫的影響

錢希逸，李慧，徐亞飛，楊彩梅，2*

（1.浙江萬方生物科技有限公司，浙江 安吉 313307；2.浙江農林大學動物科技學院動物醫學院，浙江 杭州 311300）

南美白對蝦于20世紀80年代末引進我國，90年代初期進入養殖高峰。基于人工育苗和養殖技術的突破，對蝦養殖向規模化、集約化方向發展，但也造成養殖環境惡化與病害頻發，對蝦成活率過低。養殖者將抗生素當作對蝦病害防治的“超級守門員”，然而抗生素的大量使用帶來了細菌耐藥性、藥物殘留、水環境污染等問題，最終造成惡性循環。因此尋找環境友好、綠色安全的替抗添加劑成為當前水產營養研究的熱點。

目前，有機酸及有機酸鹽因易吸收、無毒害和無殘留等優點受到關注。丁酸可為結腸上皮細胞提供能量，利于促進細胞分化與維持結腸上皮完整性，提高動物生產性能。丁酸鈉是丁酸的主要提供方式。田莉對草魚投喂含丁酸鈉的飼糧，發現丁酸鈉能夠促進腸道發育，優化腸道菌群結構，增強草魚對腸炎、赤皮病和爛鰓病的抵抗能力，提高草魚生產性能。劉文舒等發現包膜丁酸鈉能促進腸黏膜修復，增加微絨毛高度和密度等，促進建鯉生長。

植物精油由于其資源豐富、安全、無毒等優點，成為替代抗生素的熱門選擇，可作為免疫和生理反應調節劑，具有抗應激、抗氧化、促進胃腸道健康的優點。在探究百里香酚對大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果的試驗中發現，百里香酚可導致細胞膜破裂，使胞內物質泄漏，進而殺滅病原菌，有效抑制病原菌生長。王猛強等發現，在飼料中添加植物精油能有效改善南美白對蝦的生長性能，促進腸道健康。Zhou等報道，乙酸和檸檬酸等有機酸、香芹酚和百里香酚對傷寒沙門氏菌具有協同抑菌作用，韓乾杰等研究表明，丁酸鈉與植物精油存在協同作用，并且能夠減少75%復合植物精油的使用。

當前，對丁酸鈉和植物精油的研究大多是對單一特性進行分析，對丁酸鈉與植物精油協同作用方面的研究相對較少，并且多集中于畜禽養殖，關于甲殼類動物的應用研究較少。本試驗以南美白對蝦為試驗對象，研究丁酸鈉植物精油復合制劑對甲殼類動物生長性能、腸道微生物及非特異性免疫的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用健康南美白對蝦蝦苗500尾。丁酸鈉植物精油復合制劑組成為40%丁酸鈉+7.5%肉桂醛+2.5%百里香酚，采用獨特的固體分散、緩釋微囊工藝。該制劑由浙江萬方生物科技有限公司提供。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗飼料配制

試驗分為2組，對照組飼喂基礎日糧，試驗組飼喂基礎日糧并添加2.5 kg/t丁酸鈉復合植物精油制劑。南美白對蝦基礎日糧配方及營養水平見表1和2。

表1 南美白對蝦基礎日糧配方含量 %

表2 南美白對蝦基礎日糧營養成分 %

1.2.2 試驗分組

正式試驗前先將蝦苗暫養于室外水泥池中，待蝦苗長至試驗規格后，將其轉入室內養殖水桶（4 m），馴化2周以適應試驗條件。暫養期間根據蝦苗規格投喂飼料，試驗分組前24 h停止喂食。選取體質健壯、規格基本一致、平均體長為（4.13±0.05）cm、平均體質量為（1.08±0.05）g的南美白對蝦300尾，隨機分為2組，每組設3個重復，每個重復50尾。

1.2.3 飼養管理

試驗期間每天正常投喂4次（07：00，11：00，17：00和21：00），投餌量為蝦體質量的3%～5%，投喂1 h后觀察對蝦攝食情況調整投喂量。嚴格控制養殖用水質量，連續充氧，每日記錄水溫，檢測氨氮、亞硝酸鹽氮、溶解氧及pH值等水質指標，定期清理桶底殘餌糞便。試驗期間保持水溫在（27.5±1.0）℃，ρ（氨氮）≤0.02 mg/L，ρ（亞硝酸鹽氮）≤0.05 mg/L，ρ（溶解氧）≥5.5 mg/L，pH值為（7.6±0.3），鹽度為（20±1.5）。試驗周期為42 d，養殖期間出現的死蝦需及時清理并記錄。

1.2.4 生產性能測定

養殖試驗結束后，對其饑餓處理24 h，將所有蝦進行稱量，計算終末平均體質量與平均體長（體長：從眼柄基部到尾節末端的長度）。計算成活率、質量增加率、增長率、特定生長率和餌料系數。計算公式如下：

成活率（%）=（末蝦尾數/始蝦尾數）×100；

質量增加率（%）=（末均質量-初均質量）/初均質量×100；

增長率（%）=（末均長-初均長）/初均長×100；

特定生長率（%）=（ln末均質量-ln初均質量）/飼養天數×100；

餌料系數=飼料攝入量（g，干質量）/蝦體質量增加量（g，濕質量）

1.2.5 腸道微生物計數

試驗結束后測定對蝦腸道弧菌數及細菌總數。每組隨機選取15尾蝦，在無菌操作臺內進行解剖，去除腸道內糞便，用無菌生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干多余水分，置于滅菌玻璃勻漿器中，加入1 mL無菌生理鹽水進行勻漿，對勻漿液進行梯度稀釋，取0.1 mL分別涂布于Marine培養基和TCBS弧菌篩選培養基，每組涂布3個平板，28℃倒置培養24 h，統計菌落數。

每尾蝦腸道細菌總數（TBC）按下述公式計算：

TBC（CFU）=細菌克隆數目×10×勻漿液稀釋倍數/對蝦尾數。

每尾蝦腸道弧菌數（TCBS）按下述公式計算：TCBS（CFU）=弧菌克隆數目×10×勻漿液稀釋倍數/對蝦尾數。

1.2.6 非特異性免疫功能檢測

非特異性免疫功能檢測指標包括血細胞總數、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力。每組隨機選取15尾（5尾×3重復）對蝦，每個樣品重復測試3次。

（1）血細胞總數。用一次性注射器抽取100μL含10%甲醛的0.45 mol/L NaCl溶液，按1∶1比例抽取對蝦血淋巴，置于1.5 mL干凈離心管中，用血球計數板進行細胞計數。采用的是25×16型（湯麥式）血球計數板，計數時數4個中方格和中央1個中方格的細胞數（即80個小格），計算公式為：每mL細胞數（個）=80個小格內細胞總數×5×10×稀釋倍數。

（2）酚氧化酶活力。用ACD-BSolution抗凝劑按1∶1比例抽取對蝦血淋巴，水平離心機800 g，4℃離心10 min，取10μL上清液，與10μL 0.3%的L-DOPA混合，在水浴鍋中40℃條件下反應30 min，加入80μL 0.9%的NaCl溶液，充分混勻，酶標儀固定檢測OD490的光吸收值，空白對照組用0.9%的NaCl溶液代替血清。每2 min測量1次，共測量10次，以OD490對反應時間作圖，OD值每分鐘增加0.001定義1個酶活力單位。

（3）超氧化物歧化酶活力。用ACD-B Solution抗凝劑按1∶1比例抽取對蝦血淋巴2 mL，水平離心機800 g，4℃離心10 min，取上清液。根據Sigma-Aldrich超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒說明書進行測定。

1.3 數據處理及統計分析

原始數據使用Microsoft Excel 2019進行處理，再用SPSS 23.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。試驗數據采用“平均值±標準差”形式進行表示。

2 結果與分析

2.1 丁酸鈉植物精油復合制劑對南美白對蝦生長性能的影響

丁酸鈉復合植物精油對南美白對蝦生長性能的影響見表3，由表3可知，試驗組南美白對蝦增長率、質量增加率、特定生長率和成活率均顯著高于對照組，與對照組比，試驗組南美白對蝦增長率升高11.73%（＜0.01），質量增加率升高13.58%（＜0.05），特定生長率顯著升高6.92%（＜0.01），成活率顯著升高5.83%（＜0.01），餌料系數顯著降低18.24%（＜0.01）。

表3 丁酸鈉復合植物精油對南美白對蝦生長性能的影響①

2.2 丁酸鈉復合植物精油對南美白對蝦致病性弧菌的影響

丁酸鈉復合植物精油對南美白對蝦腸道總菌數與致病性弧菌的影響見表4，從表4可知，相比對照組，試驗組的南美白對蝦的腸道總菌數無顯著變化，致病性弧菌則顯著減少（＜0.01），減少幅度達68.3%。

表4 丁酸鈉復合植物精油對南美白對蝦腸道總菌數與致病性弧菌的影響① CFU/g

2.3 丁酸鈉植物精油復合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響

丁酸鈉植物精油復合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響見表5，由表5可見，相較于對照組，試驗組的南美白對蝦血細胞總數、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著提高，分別提高11.45%（＜0.05），21.39%（＜0.01）和7.67%（＜0.01）。

表5 丁酸鈉植物精油復合制劑對南美白對蝦非特異性免疫的影響①

3 討論

3.1 丁酸鈉復合植物精油促進南美白對蝦生長

丁酸鈉可以促進水產動物的生長，提高生長性能。在斑節對蝦飼料中添加包膜丁酸鈉，能顯著提高對蝦質量增加率和飼料轉化率。丁酸鈉對美洲鰻鱺、羅非魚、鯉和鯽均有顯著促生長作用。丁酸鈉的特殊氣味也對水產動物具有良好的誘食作用。而植物精油能誘導水產動物主動進食，促進胃腸道興奮，提高生產性能與飼料利用率。在南美白對蝦飼料中添加0.02%的植物精油，能促進對蝦采食，并且有效改善對蝦的生長性能，維持腸道健康。Wigraiboon等發現魚腥草油能夠促進紅羅非魚生長，同時有效提高魚肉的蛋白質含量，降低脂質含量，改善魚肉品質。本試驗發現，在南美白對蝦飼料中添加丁酸鈉復合植物精油，能顯著提高對蝦增長率、質量增加率和特定生長率，有效降低餌料系數，表明適量的丁酸鈉復合植物精油能夠促進南美白對蝦的生長。

3.2 丁酸鈉復合植物精油提高南美白對蝦存活率

丁酸鈉能促進腸道黏膜上皮細胞增殖，修復受損黏膜，促進腸絨毛增殖，增加隱窩深度，減少絨毛寬度，增強腸道對營養物質的消化吸收。植物精油同樣可以改善腸道形態，選擇性抑制某些有害菌群，促進有益菌群生長，維持腸道系統穩定。鄭瑞耕在鯉飼料中添加丁酸鈉，顯著改善了鯉腸黏膜上皮完整度，腸絨毛粗壯。孫浪在鯽基礎飼料中添加丁酸鈉，顯著提高了鯽前腸絨毛高度/隱窩深度的數值，有效促進了腸道細胞增殖。本試驗中，試驗組南美白對蝦存活率顯著高于對照組，表明丁酸鈉復合植物精油增強了南美白對蝦抵抗力。

3.3 丁酸鈉復合植物精油有效抑制南美白對蝦腸道內有害菌

弧菌屬（）是一類菌體短小，略彎曲呈弧形，具有鞭毛的革蘭氏陰性菌，該菌能生存于海洋和河口環境中，廣泛存在于魚類、珊瑚、對蝦、浮游生物和哺乳動物中。目前已知幾種弧菌對人類、魚類和海洋無脊椎動物具有致病性，其中鰻弧菌（）是條件致病菌，可感染鮭魚、大菱鲆、鱸、虹鱒、香魚等并致其死亡，Lu等從患病青蟹中分離得到多種弧菌。有研究表明，在凡納濱對蝦飼料中添加丁酸鈉能有效降低其腸道內弧菌數。崔惠敬等發現富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛的植物精油對大菱鲆弧菌具有良好抗菌作用。本試驗中，試驗組的南美白對蝦的腸道總菌數無顯著變化，致病性弧菌則顯著減少，表明丁酸鈉復合植物精油能有效抑制腸道內有害菌。

3.4 丁酸鈉復合植物精油能提升南美白對蝦非特異性免疫力

多項研究證明，丁酸鈉能促進動物免疫器官發育。在飼糧中添加植物精油可有效提高虹鱒血清中總補體含量和溶菌酶活性，植物精油還能通過增強抗氧功能提高動物免疫力。區別于哺乳動物，南美白對蝦這類甲殼動物不具備特異性免疫，僅依賴于非特異性免疫來抵御病原體。南美白對蝦血細胞總數、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均是衡量對蝦非特異性免疫力的重要指標。本研究中，試驗組南美白對蝦的血細胞總數、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均顯著上調，表明丁酸鈉復合植物精油能顯著提高南美白對蝦的非特異性免疫力。

3.4.1 血淋巴細胞

作為甲殼動物免疫系統中最重要的部分，血淋巴細胞是發揮細胞免疫功能的主要物質。血細胞的吞噬作用主要是吞噬外界病原及異物顆粒，血細胞通過表面受體識別異物，觸發由血淋巴細胞分泌的附著因子（如76 ku蛋白）介導的粘連，相互聚集成細胞團，以清除異物。日本對蝦Rab基因已被證實可以作為一種胞內病毒識別蛋白，增強宿主細胞吞噬功能。

3.4.2 酚氧化酶

酚氧化酶是體液免疫中主要的殺菌物質之一，主要存在于顆粒或半顆粒細胞中，有助于黑色素的形成。已知黑色素能抑制病原體蛋白與酶活性的發揮，參與黑化反應，產生毒性醌殺滅病原，愈合傷口，也作為一種識別信號，誘導宿主防御系統中其他成分的產生，亦可作為調理素，影響細胞吞噬功能。

3.4.3 超氧化物歧化酶活性

甲殼動物血淋巴細胞在發揮免疫機制的過程中會產生大量活性氧，活性氧濃度過高則會損害機體健康。血細胞中的超氧化物歧化酶具有清除活性氧的作用，降低機體受損傷的可能性。其變化可作為動物免疫狀態檢測指標。

4 結論

綜上所述，在南美白對蝦飼料中添加適量丁酸鈉植物精油復合制劑能夠有效促進南美白對蝦的生長，提高存活率，抑制致病菌的生長，增強對蝦非特異性免疫力，從而提高南美白對蝦養殖的經濟效益。