基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別綠萼梅質(zhì)量標(biāo)志物的評(píng)價(jià)研究

趙宏蘇，趙 茹，喬金為，金傳山，王燦燦，張 偉，吳德玲

基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別綠萼梅質(zhì)量標(biāo)志物的評(píng)價(jià)研究

趙宏蘇1, 2, 3，趙 茹1#，喬金為4，金傳山1, 2, 3，王燦燦1，張 偉1, 2, 3*，吳德玲1, 2, 3*

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012 2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012 3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012 4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061

利用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)綠萼梅藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選特征性指標(biāo)成分從而建立綠萼梅Q(chēng)-Marker的定量分析策略，為綠萼梅質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。采用超高液相色譜法建立3個(gè)產(chǎn)地綠萼梅的指紋圖譜，運(yùn)用相似度分析、聚類(lèi)分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析等化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)篩選出不同產(chǎn)地綠萼梅化學(xué)成分的特征成分作為綠萼梅Q(chēng)-Marker，并定量分析。30批綠萼梅UPLC指紋圖譜標(biāo)定8個(gè)共有峰，相似度在0.816～0.969；通過(guò)聚類(lèi)分析、主成分分析和偏最小二乘判別分析較好的區(qū)分各產(chǎn)地綠萼梅，綜合分析篩選綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷作為綠萼梅Q(chēng)-Marker，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在3.08%～4.71%、0.41%～0.71%、0.13%～0.25%、0.25%～0.38%。通過(guò)指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)的分析策略可快速有效的篩選綠萼梅Q(chēng)-Marker，為綠萼梅質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

綠萼梅；質(zhì)量標(biāo)志物；定量指紋圖譜；化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)；綠原酸；蘆丁；金絲桃苷；異槲皮苷

梅花為薔薇科植物梅(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花蕾。《中國(guó)藥典》2020年版收錄藥用梅花分別有紅梅花和白梅花[1]，其中花萼灰綠色花瓣為黃白色者為白梅花，又稱(chēng)綠萼梅，主產(chǎn)于安徽各地，為新安著名醫(yī)家常用中藥，收錄于《全國(guó)中草藥匯編》《中藥大辭典》，為臨床入藥主要品種，具有疏肝和中、化痰散結(jié)之功效，主要用于唇上生瘡、月經(jīng)不調(diào)、肝胃氣痛、郁悶心煩等癥狀[2-4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)綠萼梅化學(xué)成分研究表明其化學(xué)成分包括揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚苷類(lèi)、酯苷類(lèi)、苯丙素類(lèi)，其中以綠原酸為代表的苯丙素類(lèi)和以金絲桃苷為代表的黃酮類(lèi)成分含量較高[5-6]。有關(guān)綠萼梅質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的是多成分的含量測(cè)定，而篩選的定量指標(biāo)成分依據(jù)并未說(shuō)明[7-10]。因此如何獲得區(qū)分不同產(chǎn)地綠萼梅質(zhì)量差異、反映藥材品質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)志物作為綠萼梅多指標(biāo)成分含量的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法顯得尤為重要[11-12]。本實(shí)驗(yàn)以綠萼梅為研究對(duì)象，通過(guò)UPLC指紋圖譜對(duì)綠萼梅主要化學(xué)成分進(jìn)行宏觀整體表征，采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)指紋圖譜中提取共有峰的面積進(jìn)行整合分析，從而得到影響不同產(chǎn)地質(zhì)量的特征化學(xué)成分并含量測(cè)定，從而建立綠萼梅質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）以期為綠萼梅的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY H-CLASS UPLC（美國(guó)Waters公司，真空脫氣機(jī)、包括四元高壓梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Empower2 色譜工作站）；Milli-Q Advantage A10一體式超純水機(jī)（美國(guó)Milipore公司）；WL-100型打粉機(jī)（瑞安市威力制藥機(jī)械廠）；AB135-S型十萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多有限公司）；KQ-400KED型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)CFN99116）、蘆丁（批號(hào)CFN99642）、異槲皮苷（批號(hào)CFN9875）均購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；金絲桃苷（批號(hào)為MUST-20052210）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。分析純甲醇購(gòu)自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司，色譜純甲醇、色譜純乙腈均購(gòu)自德國(guó)Merk公司，甲酸（色譜純，美國(guó)Sigma公司），水為超純水。

1.3 藥材

綠萼梅藥材采自安徽休寧、安徽廬江和安徽歙縣，共30批次。經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院劉軍玲中藥師鑒定為薔薇科植物梅(Sieb.) Sieb.et Zucc.的干燥花蕾。綠萼梅樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 綠萼梅樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?～5 min，90%～85% A；5～15 min，85%～80% A；15～20 min，80%～75% A；20～21 min，75%～20% A；21～25 min，20%～20% A；25～26 min，20%～10% A；26～32 min，10%～90% A。體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取綠萼梅樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，靜置冷卻，稱(chēng)定質(zhì)量，加50%甲醇補(bǔ)足失重，混勻后過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，得續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別取對(duì)照品綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷適量，精密稱(chēng)定，置量瓶中，加入50%的甲醇制成含綠原酸71.2 μg/mL、蘆丁42.4 μg/mL、金絲桃苷61.6 μg/mL、異槲皮苷67.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一綠萼梅供試品（S1）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量2 μL，以綠原酸為參照峰S，計(jì)算其他各個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，考察儀器的精密度，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.14%、0.37%、0.38%、0.50%、0.43%、0.42%、0.45%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.25%、1.29%、0.13%、0.99%、1.47%、0.65%、1.33%，均小于2.0%。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一綠萼梅供試品（S1），按“2.2.1”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量2 μL，以綠原酸為參照峰S，計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，考察方法的重復(fù)性。各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.18%、1.43%、0.64%、0.59%、0.69%、1.68%、0.89%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.16%、1.57%、0.36%、1.04%、0.92%、1.36%、1.24%，均小于2.0%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一綠萼梅供試品（S1）溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量2 μL，以綠原酸為參照峰，計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.17%、0.72%、0.97%、1.01%、1.02%、1.12%、1.25%，各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.22%、0.27%、0.15%、0.62%、1.31%、0.57%、1.21%，均小于2.0%。

2.4 綠萼梅指紋圖譜的建立

2.4.1 綠萼梅對(duì)照指紋圖譜的生成 分別取30批綠萼梅樣品約0.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，將所得的30批綠萼梅樣品UPLC圖譜以AIA格式按產(chǎn)地分別導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版）軟件”，以S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗的寬度默認(rèn)為0.1 min，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正之后進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成30批綠萼梅藥材的UPLC指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜（R），見(jiàn)圖1、2。

2.4.2 特征峰的指認(rèn) 30批綠萼梅藥材指紋圖譜的共有峰有8個(gè)，經(jīng)與混合對(duì)照品色譜圖鏡像比對(duì)（圖3），指認(rèn)其中4個(gè)主要特征峰：2號(hào)峰為綠原酸，6號(hào)峰為蘆丁，7號(hào)峰為金絲桃苷，8號(hào)峰為異槲皮苷。

2.4.3 相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本）軟件”對(duì)30批綠萼梅樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算分析，綠萼梅樣品中綠原酸的出峰時(shí)間比較穩(wěn)定，且分離度較好，因此選擇綠原酸峰作為參照峰（S），其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算30批綠萼梅樣品的共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2.0%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于45%，說(shuō)明不同批次樣品中各成分含量差異較大，相對(duì)峰面積結(jié)果見(jiàn)表2。30批綠萼梅樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.816～0.969，主要相似度小于0.9的樣品為S4、S6、S8、S16、S24，表明各個(gè)產(chǎn)地綠萼梅質(zhì)量具有不穩(wěn)定現(xiàn)象，這可能與綠萼梅半野生狀態(tài)種植有關(guān)。相似度結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.5.1 聚類(lèi)分析 以30批不同產(chǎn)地綠萼梅藥材UPLC指紋圖譜的8個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，生成30×8的階數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析（hierarchical clustering analysis，HCA），采用組間連接的聚類(lèi)方法，以平方歐式距離作為測(cè)度，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)分類(lèi)距離10時(shí)，顯示30批樣品共聚為3類(lèi)，其中來(lái)自休寧產(chǎn)地的S2、S7、S10單獨(dú)聚為一類(lèi)，其余休寧產(chǎn)地和廬江地產(chǎn)的綠萼梅可大致聚為一類(lèi)，歙縣綠萼梅樣品單獨(dú)聚為一類(lèi)，說(shuō)明通過(guò)聚類(lèi)分析可大致區(qū)分產(chǎn)地。

A-休寧綠萼梅指紋圖譜 B-廬江綠萼梅指紋圖譜 C-歙縣綠萼梅指紋圖譜 D-30批綠萼梅指紋圖譜，下同

圖2 綠萼梅UPLC對(duì)照?qǐng)D譜

2.5.2 主成分分析 為了更好地將各不同產(chǎn)地綠萼梅進(jìn)行區(qū)分，另采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，PCA可實(shí)現(xiàn)高維數(shù)據(jù)的降維處理，少數(shù)幾個(gè)主成分（綜合變量）即可代原始數(shù)據(jù)的大部分信息。同樣以30批不同產(chǎn)地綠萼梅藥材UPLC指紋圖譜的8個(gè)共有峰的峰面積為原始數(shù)據(jù)，生成30×8的階數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)降維因子分析，計(jì)算特征值和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果顯示KMO值為0.754，大于0.5，代表各變量相關(guān)性較好，提取到2個(gè)主要成分，特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率為80.569%，能基本反映出樣品的主要信息；以主成分因子變量繪制公因子碎石圖，結(jié)果顯示特征值較高的2個(gè)主成分因子的斜率更大，說(shuō)明所提取的2個(gè)主成分可以最大程度地代表綠萼梅藥材的整體質(zhì)量特征。因此2個(gè)主成分因子可以作為綠萼梅藥材的評(píng)價(jià)指標(biāo)。將得到的成分矩陣進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)得到8個(gè)共有峰成分在2個(gè)主成分中的旋轉(zhuǎn)矩陣，權(quán)重值越大表明該成分在決定樣品區(qū)分中的作用越大。結(jié)果顯示第1個(gè)主成分信息主要來(lái)自1號(hào)峰、2號(hào)峰（綠原酸）、7號(hào)峰（金絲桃苷）、8號(hào)峰（異槲皮苷），第2個(gè)主成分信息主要來(lái)自5號(hào)峰、6號(hào)峰（蘆丁）。將綠萼梅樣品的8個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件繪制30批不同產(chǎn)地綠萼梅樣品的主成分得分圖，見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示2個(gè)主成分能反映不同產(chǎn)地綠萼梅的主要特征，提示不同產(chǎn)地在化學(xué)成分含量上存在差異。2.5.3 偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 為了更好地觀察不同產(chǎn)地樣本間的組內(nèi)差異，在PCA分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLS-DA方法進(jìn)一步分析。在建立的偏最小二乘判別分析模型中2X（cum）=8.847，2Y（cum）=0.737，2（cum）=0.721，均大于0.5，說(shuō)明建立的PLS-DA模型解釋率和預(yù)測(cè)力可靠、良好。PLS-DA得分圖及3D圖見(jiàn)圖6、7。結(jié)果結(jié)果顯示30批樣品分為3組，3個(gè)產(chǎn)地各為一組，結(jié)合變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）（圖8）可知VIP＞1的色譜峰有1、5號(hào)峰（未知），說(shuō)明1、5號(hào)峰代表的化學(xué)成分是不同產(chǎn)地綠萼梅樣品的差異性標(biāo)志物。

2-綠原酸 6-蘆丁 7-金絲桃苷 8-異槲皮苷

表2 綠萼梅樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

表3 30批綠萼梅指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖4 綠萼梅樣品聚類(lèi)分析圖

圖5 綠萼梅PCA得分圖

2.6 綠萼梅Q(chēng)-Marker的含量測(cè)定

通過(guò)化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)客觀量化分析，由PCA 分析得知指紋圖譜中1、2（綠原酸）、7（金絲桃苷）、8（異槲皮苷）以及5、6號(hào)峰（蘆丁）是影響不同產(chǎn)地綠萼梅質(zhì)量的特征化學(xué)成分。PLS-DA結(jié)果指示1、5號(hào)峰的VIP＞1，說(shuō)明不同產(chǎn)地該含量差異較大，是產(chǎn)地的差異性特征Q-Marker，根據(jù)Q-Marker的“五要素”要求，為體現(xiàn)中藥成分的專(zhuān)屬性、傳遞性[13-14]，1、5號(hào)峰不適合作為綠萼梅質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的特征指標(biāo)。再結(jié)合綠萼梅樣品相對(duì)峰面積結(jié)果（表2）得知，綠原酸（2號(hào)峰）、蘆丁（6號(hào)峰）、金絲桃苷（7號(hào)峰）、異槲皮苷（8號(hào)峰）在各產(chǎn)地綠萼梅樣品中含量較高且穩(wěn)定。綜上，本實(shí)驗(yàn)篩選綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷作為綠萼梅特征Q-Marker進(jìn)行含量測(cè)定。

圖6 綠萼梅樣品PLS-DA得分圖

圖7 綠萼梅樣品PLS-DA分析3D圖

圖8 30批綠萼梅樣品的PLS-DA的VIP圖

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，使用50%甲醇逐級(jí)稀釋配制成6個(gè)對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD值分別為1.7%、2.9%、1.8%、0.73%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表4 對(duì)照品的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1樣品共6份，按“2.2.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.6%、2.6%、2.2%、1.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，按“2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD值分別為1.9%、2.9%、1.8%、0.73%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取測(cè)定的S1號(hào)梅花樣品粉末6份各0.2 g，精密稱(chēng)定，分別加入等量的綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷加樣回收率分別為88.73%、109.1%、87.34%、97.15%，RSD分別為3.1%、4.7%、4.3%、1.9%。

2.6.6 樣品含量測(cè)定 根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下方法制備綠萼梅藥材供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄數(shù)據(jù)，測(cè)得綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的百分含量，具體結(jié)果見(jiàn)表5。由結(jié)果可知，30批綠萼梅樣品中綠原酸（大于3.0%）及金絲桃苷和異槲皮苷總量（大于0.35%）達(dá)到《中國(guó)藥典》2020年版要求，通過(guò)比較3個(gè)產(chǎn)地綠萼梅樣品中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量無(wú)顯著性差異，說(shuō)明這4種特征成分在綠萼梅中含量較高且穩(wěn)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在《中國(guó)藥典》2020年版和文獻(xiàn)的梯度洗脫方法[15]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，考察了0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.05%磷酸水-0.05%磷酸乙腈、0.1%甲酸水-乙腈3種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）為流動(dòng)相時(shí)，樣品的分離效果較好，因此選擇0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)對(duì)254、300、355 nm這3種波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在355 nm波長(zhǎng)下圖譜的目標(biāo)成分分離較好且較小峰金絲桃苷的響應(yīng)值較高，因此選擇355 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

近些年利用中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析中藥樣品的差異，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究較為廣泛應(yīng)用[16-20]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)、PCA、HCA和PLS-DA的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地綠萼梅質(zhì)量進(jìn)行研究。所建立的30批綠萼梅樣品UPLC指紋圖譜有8個(gè)共有峰，指認(rèn)了綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷4個(gè)特征峰。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示30批樣品的相似度在0.816～0.969，其中休寧有3個(gè)批次的樣品相似度低于0.9，休寧的綠萼梅為半野生種植，存在地理分布差異，導(dǎo)致休寧綠萼梅質(zhì)量不太穩(wěn)定，部分相似度偏低。在聚類(lèi)分析中，3個(gè)產(chǎn)地綠萼梅樣品聚為3類(lèi)，其中廬江綠萼梅大部分聚為一類(lèi)，歙縣綠萼梅大部分聚為一類(lèi)，休寧的較為分散，質(zhì)量不穩(wěn)定，表明3個(gè)產(chǎn)地綠萼梅樣品化學(xué)成分既有相似性又有差異性，造成差異性的原因可能與產(chǎn)地、環(huán)境、地理位置有關(guān)，與相似度結(jié)果一致。在PCA和PLS-DA分析中可看出3個(gè)產(chǎn)地的綠萼梅樣品均位于空間的不同位置，表明不同產(chǎn)地綠萼梅化學(xué)成分存在一定的差異，同時(shí)篩選出綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷作為綠萼梅藥材的Q-Marker，其中綠原酸及金絲桃苷和異槲皮苷也是《中國(guó)藥典》2020年版中梅花的含量測(cè)定檢測(cè)指標(biāo)，說(shuō)明研究建立的篩選中藥特征性標(biāo)志物的方法比較全面科學(xué)，由含量檢測(cè)結(jié)果可知綠萼梅中蘆丁的含量比金絲桃苷、異槲皮苷黃酮總量高，可以將蘆丁引入梅花的質(zhì)量控制指標(biāo)。

表5 30批綠萼梅樣品中質(zhì)量標(biāo)志物的含量

4 小結(jié)

通過(guò)UPLC指紋圖譜對(duì)綠萼梅主要化學(xué)成分進(jìn)行宏觀整體表征，可較為全面的反映綠萼梅化學(xué)信息，采用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)指紋圖譜中提取共有峰峰面積進(jìn)行整合分析，同時(shí)結(jié)合中藥Q-Marker “五要素”要求，篩選可作為綠萼梅質(zhì)量評(píng)價(jià)的Q-Marker，為綠萼梅質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供參考，同時(shí)該分析策略可為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供研究思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S].一部.2020: 324.

[2] 張清華.白梅花化學(xué)成分研究及生物活性預(yù)試 [D].濟(jì)南: 山東大學(xué), 2008.

[3] 王燦燦, 張偉, 吳德玲, 等.白梅花化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展 [J].廣州化工, 2017, 45(24): 40-42.

[4] 陳明珠, 陳靜, 黃幼霞, 等.綠萼梅總黃酮對(duì)小鼠抑郁的改善作用 [J].現(xiàn)代藥物與臨床, 2017, 32(2): 120-124.

[5] 王燦燦, 張偉, 吳德玲, 等.綠萼梅乙酸乙酯部位的化學(xué)成分研究 [J].中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(2): 347-351.

[6] Fujimoto K, Nakamura S, Matsumoto T,.Medicinal flowers.XXXVIII.structures of acylated sucroses and inhibitory effects of constituents on aldose reducatase from the flower buds of[J]., 2013, 61(4): 445-451.

[7] 張偉, 郭晶晶, 鄭太華, 等.不同產(chǎn)地梅花中綠原酸含量測(cè)定 [J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 32(6): 89-91.

[8] 李國(guó)衛(wèi), 吳文平, 何民友, 等.一測(cè)多評(píng)法用于梅花多成分含量測(cè)定的適用性研究 [J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2020, 26(11): 42-45.

[9] 張曉霞, 房經(jīng)貴, 陳世忠, 等.高效液相色譜法測(cè)定中藥梅花中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷的含量 [J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2016, 36(2): 107-109, 156.

[10] 魏梅, 朱德全, 陳向東, 等.梅花配方顆粒中4種黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015, 21(14): 49-51.

[11] 趙鴻鵬, 許浚, 張洪兵, 等.基于質(zhì)量傳遞與溯源的中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker) 的發(fā)現(xiàn)策略及應(yīng)用 [J].中草藥, 2021, 52(9): 2557-2565.

[12] 劉昌孝.基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的中藥質(zhì)量追溯系統(tǒng)建設(shè) [J].中草藥, 2017, 48(18): 3669-3676.

[13] Liu C X, Cheng Y Y, Guo D A, et al.A new concept on quality marker for quality assessment and process control of Chinese medicines [J]., 2017, 9(1): 3-13.

[14] 劉耀晨, 許浚, 張洪兵, 等.基于化學(xué)成分特有性的質(zhì)量標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)策略及應(yīng)用 [J].中草藥, 2021, 52(9): 2548-2556.

[15] 張鐵軍, 白鋼, 劉昌孝.中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念、核心理論與研究方法 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 54(2): 187-196, 186.

[16] 王燦燦, 楊沫, 吳德玲, 等.綠萼梅藥材超高效液相色譜指紋圖譜研究 [J].安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 38(1): 93-96.

[17] 陶曉賽, 龔海燕, 謝彩俠, 等.基于UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地盾葉薯蕷藥材質(zhì)量 [J].中草藥, 2021, 52(1): 227-233.

[18] 戚華文, 徐鑫, 溫柔, 等.基于化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)的枳實(shí)HPLC定量指紋圖譜研究 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2021, 40(1): 72-78.

[19] 林麗, 李歡歡, 謝輝, 等.基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的旋覆花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究 [J].中草藥, 2021, 52(6): 1751-1758.

[20] Meng Z, Huang Y, Wang L J,.Quality evaluation ofusing high-performance liquid chromatography with chemical pattern recognition [J]., 2020, 3(6): 200-206.

Evaluation of quality markers ofFlos based on fingerprint and chemical pattern recognition

ZHAO Hong-su1, 2, 3, ZHAO Ru1, QIAO Jin-wei4, JIN Chuan-shan1, 2, 3, WANG Can-can1, ZHANG Wei1, 2, 3, WU De-ling1, 2, 3

1.School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2.Key Laboratory of Xin'an Medicine, Ministry of Education, Hefei 230012, China 3.Anhui Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces of New Manufacturing Technology, Hefei 230012, China 4.Second Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230061, China

To analyze the UPLC fingerprints data ofusing chemical pattern recognition technology, screen the characteristic components and perform quantitative analysis, so as to provide scientific basis for the quality evaluation of.A total of 30 batches ofsamples from three production areas were collected, and the UPLC fingerprint ofwas established.The main characteristic peaks were identified by comparison with reference materials, and similarity analysis, cluster analysis, principal component analysis (PCA) and discriminant analysis by partial least squaremethod (PLS-DA) were used to identify and analyze the characteristic components infrom three producing areas, and the quantitative analysis was carried out.Eight common peaks were calibrated from UPLC fingerprints of 30 batches of, and the similarity was between 0.816—0.969.Through clustering analysis, PCA and PLS-DA, each producing area ofwas better distinguished.Chlorogenic acid, rutin, hyperin and isoquercitrin were screened as Q-Markers by comprehensive analysis, and the mass fractions were 3.08%—4.71%, 0.41%—0.71%, 0.13%—0.25% and 0.25%—0.38%, respectively.The method of fingerprint combined with chemical pattern recognition technology can effectively screen the quality markers offrom different producing areas, and provide a reference for the quality evaluation of.

; quality marker; quantitative fingerprint; chemical pattern recognition technology; chlorogenic acid; rutin; hyperoside; isoquercitrin

R286.2

A

0253 - 2670(2022)05 - 1345 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.008

2021-07-09

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1707004）；安徽省自然基金資助項(xiàng)目（2008085QH394）

趙宏蘇，女，講師，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: hongsuzhao@ahtcm.edu.cn

通信作者：張 偉，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: zhangwei@ahtcm.edu.cn

吳德玲，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物化學(xué)及中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: dlwu7373@ahtcm.edu.cn

#并列第一作者：趙 茹，女，中藥學(xué)專(zhuān)業(yè)，從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail: 3473170553@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]