恩諾沙星、喹烯酮、土霉素和硫酸多黏菌素B對細胞的聯(lián)合毒性研究

傅榆涵，侯力睿，趙 沖，扈洪波，尹淑濤

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

中國是獸藥生產(chǎn)和使用大國，在生產(chǎn)上獸藥種類豐富，在《中華人民共和國獸藥典(2015版)》錄入的獸藥共2 030種[1]，且處于不斷研發(fā)狀態(tài)。在應用上，中國人口增長和經(jīng)濟水平的提高使肉類消費量劇增，推動獸藥需求不斷增長，每年抗生素使用量為15～20萬t；每生產(chǎn)1 kg肉，中國使用抗菌藥物的量約是歐盟國家的10倍[2]。一些使用者濫用、亂用或為追求經(jīng)濟利益不遵循休藥期規(guī)定等現(xiàn)象導致獸藥殘留超標[3]。獸藥在動物體內(nèi)經(jīng)系列代謝轉(zhuǎn)化，部分會殘留在動物體內(nèi)經(jīng)食品加工流入市場，大部分以代謝物或原藥的形式進入環(huán)境[4]，再經(jīng)食物鏈富集流動、不斷放大，最終影響處于食物鏈頂端的人類，可能引起急性毒性或過敏，破壞機體內(nèi)菌群平衡，誘導有害微生物產(chǎn)生抗性基因，降低藥物治療效果，若長期積累產(chǎn)生蓄積毒性，將影響機體的正常生理功能和生長發(fā)育[5]。

目前，獸藥種類繁多、濫用現(xiàn)象普遍且存在多種獸藥混合使用現(xiàn)象，易造成多獸藥殘留，當這些藥物同時存在時相互影響將產(chǎn)生聯(lián)合毒性，可能放大對生物的危害[6-7]，如大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類和磺胺類獸藥兩兩結(jié)合對小球藻的生長均表現(xiàn)出協(xié)同抑制[8]；頭孢菌素和環(huán)丙沙星協(xié)同抑制羊角月牙藻的生長[9]。混合獸藥殘留帶來的威脅不容小覷，但中國現(xiàn)有的獸藥殘留標準多僅針對單一藥物，對藥物的聯(lián)合毒性不夠重視，關于獸藥聯(lián)合的政策或管理也有待完善。喹烯酮、恩諾沙星、硫酸多黏菌素B、土霉素為常見抗菌藥，使用較為普遍且在環(huán)境中的殘留較高，同時接觸的可能性較高[10-11]。因此，本研究選取這4種藥物，以人肝細胞L02、小鼠肝細胞AML12、猴腎細胞Marc145、人腎細胞HEK293T、人神經(jīng)母細胞瘤細胞SK-N-SH和小鼠睪丸間質(zhì)細胞TM3為模型，評價不同暴露濃度下各獸藥單獨處理和聯(lián)合處理時對細胞生長的抑制作用，得到濃度效應關系，并采用濃度加和模型(CA)和獨立作用模型(IA)法評價二元、三元、四元組合的聯(lián)合毒性，以期對各藥物之間可能發(fā)生的聯(lián)合作用進行初步了解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 AML12(CRL-2254)、L02(CVCL-6926)、HEK293T(ACS-4500)、Marc145(CRL-12231)和SK-N-SH(HTB-11)細胞均來自ATCC 細胞庫；TM3(3101MOUGNM24)細胞來自國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫。

1.1.2 主要試劑 恩諾沙星(enrofloxacin,ENR,98%)、土霉素(oxytetracycline dihydrate,OTC,97%)、硫酸多黏菌素B(polymyxin B sulfate,PMB,USP級，≥6 000 USP units/mg)均購自Aladdin公司；喹烯酮(quinocetone，QCT,≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM/F12、DMEM高糖培養(yǎng)基購自HyClone公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司；戊二醛、結(jié)晶紫均購自Sigma公司；ITS細胞培養(yǎng)添加物(100×)購自塞業(yè)生物科技有限公司；馬血清、胎牛血清均購自Biological Industries(BI)公司。

1.1.3 主要儀器設備 CO2恒溫培養(yǎng)箱(3111型)、液氮罐(8038型)、生物安全柜(Forma CLASSⅡ級A2型)、高速低溫離心機(Biofuge Pro R)和96孔酶標儀(Multiscan SK3)均購自Thermo Scientific公司；電子精密天平(AL104-IC)購自梅特勒-托利多(上海)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

AML12細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1% ITS細胞培養(yǎng)添加物的DMEM/F12培養(yǎng)基中；L02細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；HEK293T、Marc145和SK-N-SH細胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；TM3細胞培養(yǎng)于含有5%馬血清和2.5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中貼壁生長。

1.3 藥物處理

細胞傳代時，根據(jù)細胞狀態(tài)和生長速度，將一定數(shù)量的細胞均勻接種到細胞培養(yǎng)板中，當細胞匯合度達到40%～50%時，進行加藥處理。表1所示濃度為對應的一元藥物在該細胞中的最大濃度，按相應稀釋因子進行梯度稀釋。根據(jù)單一藥物對細胞產(chǎn)生50%、33%和25%生長抑制率時的濃度計算結(jié)果進行二元(EC50∶EC50)、三元(EC33∶EC33∶EC33)、四元(EC25∶EC25∶EC25∶EC25)毒性比藥物混合，并以1/2為稀釋因子進行梯度稀釋，按所需濃度將藥物加入新培養(yǎng)基中并混勻，用真空泵吸除原培養(yǎng)基，再加入新配好的含藥培養(yǎng)基，聯(lián)合處理細胞24 h。

表1 單一藥物最大濃度及稀釋因子

1.4 結(jié)晶紫染色

加藥處理24 h后移除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液潤洗，再每孔加入0.5 mL 1%戊二醛溶液，于搖床上固定15 min。棄去戊二醛，每孔用PBS緩沖液潤洗2次后，加入1 mL 0.02%結(jié)晶紫染色液，在搖床上染色30 min。棄去染色液，流水小心沖洗每個孔，至洗液呈無色透明為止。倒置晾干后每孔加入2 mL 75%乙醇，于搖床上溶解6～8 h，570 nm波長下測定吸光值(D)，以75%酒精為空白對照。以對照組細胞數(shù)量為100%，按公式(1)計算出加藥處理一段時間后的細胞存活率。

細胞存活率(%)=

(1)

1.5 擬合劑量效應曲線

根據(jù)抗菌藥對細胞生長的抑制作用(Y)與濃度(X)和EC50預估值，使用非線性回歸模型，遵循方程(2)、(3)。

Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((logEC50-X)×HillSlope))

(2)

logECF=logEC50+(1/HillSlope)×log(F/(100-F))

(3)

式中，Y,藥物對細胞的生長抑制率(%)；X,抗菌藥濃度(mg/L)；ECF,抑制率為F%(F=10、20、25、33、50)時抗菌藥的濃度(mg/L)；Bottom,曲線的基線響應(mg/L)；Top,最大響應(mg/L)；Hillslope,指曲線的坡度。

1.6 多元混合物毒性的預測

采用CA[12]和IA[13]判斷聯(lián)合效應。

CA 模型數(shù)學表達式為：

(4)

式中，n,混合物中組分數(shù)目；ECx,i,第i個組分單獨作用時產(chǎn)生x%效應對應的單一毒性效應濃度；ci,混合物產(chǎn)生x%效應時對應的組分i在混合物體系中的濃度。

IA模型數(shù)學表達式為：

(5)

式中，E(cmix),預測的效應；cmix,混合物的總濃度；ci,混合物產(chǎn)生x%效應時對應的組分i在混合體系中的濃度；E(ci),i組分單獨作用產(chǎn)生x%效應時的單一濃度。

根據(jù)公式擬合CA和IA線，當實際曲線在CA、IA線之上時，表示實際毒性大于預測毒性。存在協(xié)同效應；與CA、IA線相交時，表示相加效應；當實際曲線在CA、IA線下時，表示實際毒性小于預測毒性，存在頡頏效應。

1.7 統(tǒng)計分析

運用GraphPad Prism 8.0分析數(shù)據(jù)及曲線擬合。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 單一獸藥對不同細胞的生長抑制作用

探究ENR、OTC、QCT、PMB單獨作用24 h對細胞生長的抑制作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種抗菌藥對6種細胞均存在劑量效應關系，隨著作用劑量的增加，細胞生長抑制率增加，利用軟件進行曲線方程擬合，具體結(jié)果見表2。通過擬合得到的曲線計算的4種藥物對不同細胞的EC50、EC20、EC10值，具體結(jié)果見表3。

A～F,分別為4種獸藥單獨作用于L02、AML12、HEK293T、Marc145、SK-N-SH和TM3細胞的劑量-效應曲線

表2 抗菌藥作用于不同細胞后的生長抑制曲線

表3 抗菌藥作用不同細胞的EC50、EC20、EC10值

通過比較EC50可知，不同藥物對同一細胞的毒性大小不同。無論對哪種細胞，QCT的毒性都是最強的，PMB毒性最小，其中在HEK293T細胞中，QCT和PMB相差約763倍(EC50,PMB,HEK293T=557.10 mg/L，EC50,QCT,HEK293T=0.73 mg/L)。ENR和OTC的毒性介于QCT和PMB之間，但對不同細胞，毒性大小存在差別，對L02、Marc145細胞，兩者毒性類似，對AML12細胞，ENR的毒性更強，而對HEK293T、SK-N-SH和TM3細胞，OTC的毒性更強。

同種藥物對不同細胞的毒性也存在差異。 ENR對AML12細胞的毒性最大(EC50,ENR,AML12=25.40 mg/L)，而對TM3的毒性最小(EC50,ENR,TM3=208.04 mg/L)，相差約8.2倍。 OTC對6種細胞的EC50在60～200 mg/L范圍內(nèi)，對每種細胞的毒性差別不明顯，影響最小的是Marc145細胞(EC50,OTC，Marc145=178.50 mg/L)。PMB對SK-N-SH細胞的EC50為182.0 mg/L，對比PMB對其他類型細胞的毒性，PMB對神經(jīng)細胞的影響最大，具有較強的神經(jīng)毒性。QCT對腎細胞的毒性最強，僅0.73 mg/L就可對HEK293T細胞造成半數(shù)抑制。

2.2 二元獸藥對不同細胞的生長抑制作用

ENR+OTC、ENR+PMB、ENR+QCT、OTC+PMB、OTC+QCT、PMB+QCT二元組合聯(lián)合毒性結(jié)果見圖2～4。大部分藥物二元組合后產(chǎn)生協(xié)同毒性效應。ENR與其他3種抗菌藥的組合在大部分細胞中主要表現(xiàn)出相加效應，而ENR+OTC組合在肝細胞(L02和AML12細胞)，ENR+PMB在腎細胞(Marc145和HEK293T細胞)中表現(xiàn)出了協(xié)同效應，ENR+PMB和ENR+QCT在AML12細胞中出現(xiàn)明顯的頡頏，在低濃度時有促進細胞生長的作用。與OTC組合的藥物大部分出現(xiàn)了協(xié)同效應，尤其是OTC+QCT在6種細胞中均出現(xiàn)協(xié)同毒性。與PMB組合的藥物易出現(xiàn)低濃度呈相加或頡頏作用，而隨濃度的增加對細胞的毒性增強，出現(xiàn)協(xié)同作用。

A～F、G～L，分別為ENR+OTC、ENR+PMB、ENR+QCT、OTC+PMB、OTC+QCT、PMB+QCT二元組合對L02和AML12細胞的混合毒性評價

從細胞的角度來看，在TM3細胞中抗菌藥聯(lián)合易出現(xiàn)相加效果，在肝細胞(L02和AML12細胞)和腎細胞(Marc145和HEK293T細胞)中出現(xiàn)協(xié)同的概率較高。不同細胞模型由于代謝途徑的差異對同樣藥物聯(lián)合表現(xiàn)出來的效應可能不同，如ENR+QCT在AML12細胞中主要是頡頏作用，而在HEK293T中主要是協(xié)同作用，聯(lián)合毒性效應存在模型差異。

2.3 多元獸藥對不同細胞的生長抑制作用

ENR+OTC+PMB、ENR+OTC+QCT、OTC+PMB+QCT、ENR+QCT+PMB三元及OTC+ENR+PMB+QCT四元組合聯(lián)合毒性結(jié)果見圖5、6。多元組合中相加效應出現(xiàn)的概率上升。在AML12細胞中，ENR+PMB+QCT組合出現(xiàn)明顯的頡頏作用，在低濃度混合時甚至有促生長作用，在ENR+PMB和ENR+QCT二元組合也有類似情況，而在AML12細胞中4種藥物單獨作用均不存在促生長作用，當多元組合中出現(xiàn)OTC時多為協(xié)同作用。部分組合出現(xiàn)3段毒性，即低濃度時為相加或頡頏作用，中間濃度時為協(xié)同作用，當濃度繼續(xù)上升，協(xié)同作用減弱，變?yōu)轭R頏作用，如HEK293T細胞中的ENR+OTC+PMB組合、Marc145和TM3細胞中OTC+PMB+QCT組合，隨著組分的增加，藥物之間的聯(lián)合作用變化更為復雜。

3 討 論

QCT為化學合成喹噁啉-1,4-二氧化合物[14]，其在代謝過程中脫氫產(chǎn)生自由基引起氧化應激，使細胞DNA損傷斷裂，細胞膜通透性增加，從而引起細胞死亡[15]。QCT的毒性較強，且可能由于肝臟和腎臟為QCT的主要代謝器官，其肝臟和腎臟毒性較為顯著，在本研究中，僅0.73 mg/L就可對HEK293T細胞造成半數(shù)抑制，Chen等[16]以非洲綠猴腎細胞Vero為材料，發(fā)現(xiàn)短時間處理下40 μg/mL QCT對細胞生長的抑制率達50%，且抑制強度遠高于同為喹噁啉類抗菌藥的卡巴氧和喹乙醇。PMB屬多肽類抗生素[17]，對革蘭氏陰性菌有強烈的殺傷作用[18]。本研究結(jié)果顯示，在4種藥物中PMB 對6種細胞的EC50均最大，可見其毒性較小，但從細胞上比較，對SK-N-SH細胞的EC50最小，神經(jīng)毒性較為突出。有文獻報道，PMB可造成神經(jīng)肌肉阻滯，具有一定神經(jīng)毒性[19]。ENR屬喹諾酮類抗菌藥物[20]，在食品中ENR的脫乙基產(chǎn)物環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)檢出最為常見，其次是ENR[21]。OTC屬四環(huán)素類抗生素，是農(nóng)業(yè)和醫(yī)學中應用最多的抗菌藥之一，在河流中的檢出率可達287 ng/L[22]，是最常見的環(huán)境污染物之一[23]，這些藥物極易發(fā)生混合殘留，當不同的藥物混合使用可能同時對多種器官造成損傷。

A～F、G～L，分別為ENR+OTC、ENR+PMB、ENR+QCT、OTC+PMB、OTC+QCT、PMB+QCT二元組合對HEK293T和Marc145細胞的混合毒性評價

A～D、E～H、I～L、M～P、Q～T、U～X，分別為ENR+OTC+PMB、ENR+OTC+QCT、OTC+PMB+QCT和ENR+QCT+PMB三元組合對L02、AML12、HEK293T、Marc145、SK-N-SH和TM3細胞的混合毒性評價

A～F,分別為OTC+ENR+PMB+QCT四元組合對L02、AML12、HEK293T、Marc145、SK-N-SH和TM3細胞的混合毒性評價

當2種或2種以上物質(zhì)同時或順序進入機體會發(fā)生復雜的交互作用，影響彼此的吸收、代謝或轉(zhuǎn)化等過程，產(chǎn)生與單一作用時不一樣的綜合效應，即聯(lián)合毒性[24]。由于獸藥使用不當和多種獸藥聯(lián)合使用易導致獸藥混合殘留，而混合獸藥對生物的聯(lián)合毒性往往不是簡單的相加。 本研究結(jié)果顯示，QCT+OTC在等毒性比混合時對6種細胞均造成了協(xié)同抑制，以OTC∶QCT=4∶1的濃度比混合時也具有顯著協(xié)同效應，可通過增加活性氧(ROS)、抑制超氧化物歧化酶2(SOD2)和過氧化氫酶(CAT)激發(fā)氧化應激，并上調(diào)促凋亡蛋白Bim使細胞發(fā)生凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，在HEK293T細胞中與ENR組合的藥物均出現(xiàn)顯著協(xié)同作用，有文獻報道ENR和其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星(CIP)也可產(chǎn)生協(xié)同肝毒性，引起肝細胞氧化應激[26]，因此抗菌藥的使用在避免濫用、亂用外還要注意配伍禁忌，避免聯(lián)合使用后對人體產(chǎn)生更大的危害；除此之外，可采用降解、吸附等抗菌藥去除策略，結(jié)合快速、靈敏的檢測方法提高對食品中抗菌藥的檢測效率，以減少抗菌藥進入人體[27]。

藥物的聯(lián)合毒性不是固定的，影響聯(lián)合毒性的因素包括組分、劑量、作用時間、模型及評價方法等。不同的化學物之間無論是理化性質(zhì)、針對的靶器官或細胞還是在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化、代謝等過程都存在差異，各物質(zhì)的毒性作用機制不同導致聯(lián)合作用不相同[28]。組分越多，化學物之間產(chǎn)生的相互影響也越復雜。本研究結(jié)果顯示，當藥物三元、四元組合時出現(xiàn)相加效應的概率上升，這與Funnel假說一致，即混合物組分越多，聯(lián)合效應越接近于相加作用[29]。同時聯(lián)合效應是隨濃度的變化而變化的，如OTC+PMB組合在L02細胞中低濃度為相加作用，隨著濃度的升高出現(xiàn)了協(xié)同作用。連勇等[30]發(fā)現(xiàn)敵敵畏與樂果低劑量聯(lián)合對HepG2細胞DNA的損傷效應為簡單相加，敵敵畏與馬拉硫磷、樂果與馬拉硫磷具有協(xié)同效應，而在高劑量下，3種有機磷農(nóng)藥之間聯(lián)合模式為頡頏。產(chǎn)生這種區(qū)別的可能原因是不同劑量對于代謝酶的影響不同，有機磷農(nóng)藥低劑量下可能對P450酶系產(chǎn)生誘導，而高劑量下產(chǎn)生抑制。在模型上，同一組藥物可能因靶點、作用方式、代謝途徑差異對不同細胞聯(lián)合毒性存在較大區(qū)別。聯(lián)合毒性也存在時間依賴性[31]，造成時間依賴的原因可能是靶蛋白不同、細胞膜的通透性變化、藥物與靶蛋白結(jié)合的有效濃度變化等[32-34]。本研究固定染毒時間為24 h，并未涉及這4種抗菌藥對細胞不同作用時間下的聯(lián)合毒性的影響，時間依賴作用有待進一步探討。

4 結(jié) 論

在6種細胞模型中，QCT的毒性最強，PMB的毒性最小，ENR、QCT主要造成肝臟和腎臟毒性，OTC對每一種組織的毒性大小相似，但生殖毒性較突出，而PMB主要對神經(jīng)細胞造成影響，不同的藥物混合使用可能同時對多種器官造成損傷。二元抗菌藥組合出現(xiàn)協(xié)同作用的可能性較高，尤其是與OTC組合。在多元組合中，隨著組分的增加，組分間的相互作用更加復雜，聯(lián)合毒性出現(xiàn)相加的概率上升。