1株禽大腸桿菌噬菌體的分離及殺菌效果評估

李金敏，高緒娜，桑瑞新，宮本芝，徐海燕，谷 巍，郝木強，蘭江華，王 紅

(1.山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動物微生態制劑重點實驗室，泰安 271000；2.濟寧市農業科學研究院，濟寧 272031)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是一種腸外致病性大腸桿菌，可引起禽類大腸桿菌病，并常與其他呼吸道疾病混合感染，引發禽類腹膜炎、肝周炎、心包炎等病變，嚴重的可引發敗血癥，導致禽類死亡[1-2]。此外，禽大腸桿菌病不僅會降低禽類生產性能，提高死亡率，與其他疾病混合感染還會加重病情，降低疫苗免疫效力[3]。

目前國內外防治禽大腸桿菌病的主要手段仍為抗生素，但抗生素的長期使用所引發的藥物殘留等食品安全問題及產生耐藥菌等問題已引起了廣泛關注[4-5]。因此，亟需開發安全、高效的禽大腸桿菌病防治手段。鑒于該病的自然感染途徑主要通過呼吸系統及消化系統兩方面單獨或協同誘發，從調控養殖環境中致病性大腸桿菌的數量入手，對于防控該病的發病率具有重要的生物安全意義。

噬菌體作為一種專一侵襲目標細菌的病毒，具有繁殖迅速、特異性強的優勢，能快速裂解目標菌株，從而達到殺菌的目的。自被發現至今一百多年的時間里，研究者一直嘗試著將其作為新型抗菌劑應用于病原菌的防控，且有些已在國外獲批上市[6]。大量研究表明，噬菌體對人及動物是安全的[7-9]，噬菌體作為一種可替代抗生素的生物制劑及環境改良劑，具有廣闊的應用前景。

本研究以O2血清型禽大腸桿菌為研究對象，從養殖環境中分離相應的噬菌體，并對噬菌體的生物學特性及環境殺菌效果進行綜合評估，以期為噬菌體制劑的推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 宿主菌O2血清型禽大腸桿菌CVCC1552購自中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；Tris-HCl緩沖溶液購自北京索萊寶科技有限公司；PEG8000購自長春天佳生物技術有限公司；氯仿購自重慶川東化工有限公司；DNase Ⅰ、RNase A、微量病毒提取試劑盒、限制性核酸內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ均購自寶生物工程(大連)有限公司；0.22 μm微孔濾膜購自PALL公司。 超凈工作臺、電熱恒溫培養箱、恒溫振蕩培養箱等均購自山東博科科學儀器有限公司；Philips Tecnai 10透射式電鏡購自Philips公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離純化 于山東省泰安市某鴨場糞池采集糞便樣品。將采集到的樣品加入15 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，4 ℃靜置過夜。將樣品于12 000 r/min離心10～15 min去除大部分固體雜質，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。取10 mL過濾液加入10 mL已滅菌TSB培養基中，再按照1%接種量加入對數生長期的宿主菌種子液，37 ℃、180 r/min振蕩培養過夜，次日將培養液8 000 r/min離心15 min,取1 mL上清液加入10 mL TSB培養基，并按照1%接種量接種對數生長期的宿主菌種子液，室溫靜置1 h后于37 ℃振蕩培養4 h，培養結束后8 000 r/min離心15 min，過濾，即得噬菌體原液。

用50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液對噬菌體原液進行梯度稀釋，取合適梯度噬菌體稀釋液0.3 mL與0.3 mL宿主菌種子液混合，加入5 mL 約55 ℃ TSB半固體培養基，混勻后倒入TSA平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培養箱4～6 h，觀察噬菌斑生長情況。挑取直徑大且透亮的噬菌斑于Tris-HCl緩沖溶液，適當稀釋后按照前述分離方法進行純化，重復3～5次，直至噬菌斑形狀大小均勻。挑取單個噬菌斑至10 mL TSB培養基，并按照1%接種量接種對數生長期的宿主菌液，37 ℃、180 r/min振蕩培養過夜；離心過濾后即得純化的噬菌體裂解液，同時參照文獻方法進行噬菌體滴度測定[10]。

1.2.2 噬菌體電鏡觀察 參照文獻提供方法，采用PEG8000制備噬菌體顆粒濃縮液，取10 μL濃縮液滴于銅網上，自然沉淀10 min，用濾紙吸去側面多余液體，加1滴磷鎢酸至銅網上，染色10 min，銅網干燥后用透射電鏡進行觀察[11]。

1.2.3 基因組提取及核酸類型確定 利用PEG8000制備噬菌體顆粒濃縮液，在濃縮液中加入DNaseⅠ、RNase A，37 ℃孵育30 min，采用微量病毒提取試劑盒提取噬菌體核酸。用限制性核酸內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ 對提取到的噬菌體核酸進行酶切，酶切產物用0.7%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據酶切圖譜鑒定噬菌體核酸類型。

1.2.4 噬菌體生物學特性分析

1.2.4.1 噬菌譜測定 測定該噬菌體對本實驗室保存的除宿主菌之外的其余10株大腸桿菌的宿主譜，10株大腸桿菌于37 ℃、180 r/min振蕩培養過夜，噬菌體過濾液及大腸桿菌菌液各取100 μL，加入5 mL TSB半固體培養基，混勻后倒入TSA平板上，凝固后倒置于37 ℃培養箱4～6 h，觀察有無噬菌斑生長。

1.2.4.2 最佳感染復數(MOI)測定 將宿主菌培養至對數生長期，并進行活菌計數。宿主菌按照培養基體積的1%加至滅菌的TSB液體培養基中，噬菌體裂解液按照感染復數為0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001加入，37 ℃、180 r/min振蕩培養3.5 h，5 000 r/min離心15 min，上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，梯度稀釋法測定裂解液滴度，以產生最高滴度的感染復數組作為該噬菌體的最佳感染復數。

1.2.4.3 一步生長曲線 將噬菌體及對數生成長期的宿主菌按照最佳感染復數加至100 mL TSB液體培養基中，37 ℃振蕩培養箱靜置孵育15 min 后180 r/min振蕩培養，每隔20 min 取樣，測定噬菌體滴度。以時間為橫坐標、噬菌體滴度為縱坐標繪制一步生長曲線圖。 通過下列公式計算噬菌體裂解量。

裂解量=裂解末期噬菌體滴度/裂解初期宿主菌數

1.2.4.4 熱穩定性測定 取1 mL 噬菌體純培養液(109PFU/mL)置于無菌EP管內，分別于40、50、60、70、80 ℃水浴中孵育1 h 后，測定噬菌體滴度。以溫度為橫坐標、噬菌體滴度為縱坐標繪制溫度耐受性曲線圖。

1.2.4.5 酸堿穩定性測定 取噬菌體純培養液(109PFU/mL)按照1∶9的比例分別加至pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的Tris-HCl緩沖溶液中，37 ℃水浴中孵育1 h 后，測定噬菌體滴度。以pH為橫坐標、噬菌體滴度為縱坐標，繪制酸堿耐受性曲線圖。

1.2.5 環境殺菌效果評估

1.2.5.1 液體殺菌效果評估 制備宿主菌菌懸液，離心、緩沖液重懸后獲得去培養基菌懸液，將菌懸液活菌數調整到2.0×105CFU/mL，然后按體積比1∶1加入相應噬菌體(混勻后效價分別為在1.0×104、1.0×105、1.0×106PFU/mL左右)，對照組加入等量TSB培養基，25 ℃放置，分別在1和6 h取樣，測定宿主菌活菌數。

1.2.5.2 載體(雞糞)殺菌效果評估 制備宿主菌菌懸液，稀釋菌液濃度到4.0×106CFU/mL，分別以體積比1∶1加入濃度為4.0×105、4.0×106、4.0×107PFU/mL的噬菌體，混勻后取1 mL混合液滴加于已高壓滅菌并烘干的10 g雞糞中，攪拌均勻(使得雞糞含宿主菌為2.0×105CFU/g；雞糞含噬菌體分別為2.0×104、2.0×105和2.0×106PFU/g)，以加等量TSB培養基為空白對照組，用玻璃紙密封，于25 ℃培養箱放置，分別在5和10 h 取樣，測定宿主菌活菌數。

1.2.6 統計分析 試驗數據用Excel 2010進行初步處理后，采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并進行LSD多重比較。結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離純化

通過雙層平板法分離純化出1株禽大腸桿菌(O2血清型)噬菌體，命名為ФECP2-1。該噬菌體在雙層平板上形成直徑1 mm 左右圓形透明噬菌斑，有較大暈圈(圖1)。

圖1 噬菌體ФECP2-1噬菌斑

2.2 噬菌體電鏡觀察結果

在透射電子顯微鏡下觀察發現，該噬菌體具有正多面體的頭部和細而長的尾部結構，頭部直徑約98 nm，尾部長約123 nm(圖2)，初步判定為肌尾科噬菌體。

圖2 噬菌體ФECP2-1電鏡圖片(400 000×)

2.3 基因組提取及核酸類型確定

由圖3可知，噬菌體ФECP2-1可被限制性內切酶切開，表明噬菌體ФECP2-1為雙鏈DNA噬菌體。根據酶切結果預測其基因組大小約為29 kb。

1，噬菌體DNA；M1，15 kb DNA Marker；2，EcoRⅠ酶切；3，Hind Ⅲ 酶切；M2，10 kb DNA Marker

2.4 噬菌體生物學特性測定結果

2.4.1 噬菌譜測定結果 對除宿主菌之外其余10株大腸桿菌進行宿主譜測定，發現噬菌體ФECP2-1還能裂解C8-0008、C8-0020、C8-0033、C8-0040、C8-0045、C8-0047、C8-0106、CVCC1568 8株宿主菌(含與宿主菌不同血清型菌株)(表1)，表明該噬菌體還可裂解自身血清型之外的其他大腸桿菌，具有較寬的裂解譜。

表1 噬菌體ФECP2-1宿主譜

2.4.2 最佳感染復數測定結果 噬菌體ФECP2-1在感染復數為0.00001時所產生的的子代噬菌體滴度最高，為1.66×1010PFU/mL(圖4)，表明噬菌體ФECP2-1最佳感染復數為0.00001。

圖4 噬菌體ФECP2-1最佳感染復數

2.4.3 一步生長曲線測定結果 通過一步生長曲線測定發現，噬菌體ФECP2-1感染宿主菌的潛伏期為20～40 min，裂解時間為80～100 min，120 min后進入平臺期，噬菌體最高滴度為6.20×1010PFU/mL(圖5)，通過裂解量公式得出該噬菌體裂解量為4 133 PFU/cell。

圖5 噬菌體ФECP2-1一步生長曲線

2.4.4 熱穩定性測定結果 由熱穩定性曲線圖可知，噬菌體ФECP2-1在40～50 ℃滴度變化不明顯，60 ℃處理1 h，噬菌體滴度降低接近50%，60 ℃以上噬菌體滴度驟降，至80 ℃時基本降至0(圖6)。

圖6 噬菌體ФECP2-1熱穩定性

2.4.5 酸堿穩定性測定結果 噬菌體ФECP2-1在 pH 3.0～11.0范圍內較穩定。強酸、強堿都會造成噬菌體活性降低。在經pH為1.0及12.0緩沖液處理后，噬菌體ФECP2-1完全失活(圖7)。

圖7 噬菌體ФECP2-1酸堿穩定性

2.5 噬菌體ФECP2-1環境殺菌效果評估

2.5.1 液體殺菌效果評估 由表2可知，在液體條件下，濃度為1.0×104～1.0×106PFU/mL的噬菌體ФECP2-1 對濃度1.0×105CFU/mL的宿主菌殺菌率均在99.9%以上，且殺菌率隨著噬菌體濃度的增加而顯著增加(P<0.05),隨作用時間的延長殺菌率略有增加。說明該噬菌體在液體中具有較好的殺菌效果，可用于養殖環境中液體的消毒。

表2 噬菌體ФECP2-1對液體殺菌效果

2.5.2 載體(雞糞)殺菌效果評估結果 由表3可知，濃度為2.0×104～2.0×106PFU/g 的噬菌體ФECP2-1 對雞糞中濃度為2.0×105CFU/g的宿主菌均具有殺菌效果，殺菌率均在99.0%以上。殺菌率隨著噬菌體濃度的增加顯著增加(P<0.05)，隨作用時間的延長殺菌率略有增加。說明該噬菌體針對雞糞中的宿主菌也具有一定的殺菌效果。

表3 噬菌體ФECP2-1雞糞殺菌效果

3 討 論

目前養殖業中關于禽大腸桿菌病的防控手段仍主要采用抗生素療法，但大腸桿菌極易對抗生素產生耐藥性，進而增強該菌的致病力，給養禽業帶來更大的經濟損失[12]。針對細菌耐藥性問題，相關部門也出臺了一系列限抗禁抗政策，在這種情況下，尋求新的防控手段成為一種必然。噬菌體以其獨特的生物學特性及在防控細菌性疾病方面的巨大優勢及潛力而備受關注[13]。

本研究以禽大腸桿菌CVCC1552為宿主菌，從山東泰安某養鴨場糞污樣品中分離得到1株具有較寬裂解譜的禽大腸桿菌噬菌體，將其命名為ФECP2-1。該噬菌體在雙層平板上形成的噬菌斑清晰、透亮，且在噬菌斑周圍形成較大的環形暈圈。暈圈的形成被認為是由噬菌體產生的一種具有多糖降解能力的解聚酶降解噬菌斑周邊宿主菌多糖骨架而成。此外，暈圈的形成也被認為是噬菌體具有莢膜水解酶活性的指示器。以上結果說明該噬菌體不僅可裂解宿主菌，還可降解細菌生物膜，具有較強的殺菌能力[14]。

通過透射電鏡觀察噬菌體ФECP2-1具有正多面體的頭部和細而長的尾部結構，同時結合酶切鑒定結果，確定該噬菌體為雙鏈DNA、肌尾科噬菌體，這與現有文獻[15-16]中報道的大腸桿菌噬菌體結構特征基本一致。

根據噬菌體裂解譜的寬窄可將噬菌體分為寬譜噬菌體和專一性噬菌體。自然界中大部分噬菌體專一性較強，只能特異性裂解某一細菌的某一血清型，但為了應對當前養殖行業中出現的病原菌混合感染，篩選寬譜噬菌體具有重要應用價值[17]。噬菌體ФECP2-1可裂解多種來源且不同血清型的大腸桿菌，裂解譜寬于吳圓圓等[18]報道的雞大腸桿菌噬菌體的裂解譜，說明該噬菌體可與多種細菌表面受體相結合進而裂解細菌，具有較高的應用價值。

噬菌體ФECP2-1最佳感染復數為0.00001，表明噬菌體對宿主菌CVCC1552極度易感。 潛伏期為20～40 min，對宿主菌的裂解量為4 133 PFU/cell，遠高于魏炳棟等[19]報道的大腸桿菌噬菌體裂解量370 PFU/cell。說明該噬菌體具有較強的裂解能力，適于投入生產使用，提高噬菌體的生產效率。

溫度和pH的變化對噬菌體滴度也具有不同程度的影響。 噬菌體ФECP2-1的溫度及pH穩定性結果顯示，在60 ℃及以下溫度條件下噬菌體滴度相對穩定，高于此溫度則滴度驟降。 這一結果與楊慧敏等[20]報道的雞大腸桿菌噬菌體在60 ℃作用20 min噬菌體全部失活不同。 說明本研究分離到的禽大腸桿菌噬菌體溫度耐受性更強，這一性能更有利于噬菌體制劑的商品化。噬菌體ФECP2-1在pH 3.0～11.0范圍內滴度較穩定，這一結果也優于文獻報道的同類噬菌體的酸堿耐受范圍[21-22]。說明該噬菌體在不同的酸堿環境中均具有裂解細菌的能力，這一特性對于噬菌體作為環境消毒劑進行開發具有重要意義。

O2血清型大腸桿菌是禽類常見的致病力較強且發病率較高的大腸桿菌血清型之一，可引起禽類的胸膜炎及敗血癥[23]。在實際生產中由于雜菌干擾、噬菌體施用及取樣不均勻等因素的存在，以致于無法對某一特異性噬菌體的真實殺菌效果進行評估。本研究排除以上干擾因素的影響，較理想化的使用噬菌體ФECP2-1針對處理過的養殖水體及雞糞中宿主菌進行防控，以最大程度的呈現噬菌體的真實殺菌效果。結果顯示噬菌體干預組液體及糞便大腸桿菌活菌數較初始均有明顯降低，殺菌率均在99%以上。其中噬菌體ФECP2-1針對液體中大腸桿菌殺菌效果優于對雞糞中大腸桿菌殺菌效果，這可能與2種基質中噬菌體與宿主菌的接觸概率有一定關系，此外雞糞中有機質對于噬菌體的殺菌效果也可能存在一定干擾。噬菌體ФECP2-1對雞糞中大腸桿菌殺菌效果仍略優于文獻中報道的殺菌效果[24]。 綜上可知，噬菌體ФECP2-1對于實驗室模擬的養殖環境感染的大腸桿菌具有良好的防控效果。

4 結 論

本研究從養殖環境中分離篩選到1株禽大腸桿菌O2血清型強裂解性噬菌體ФECP2-1，屬于肌尾科噬菌體，具有較寬的裂解譜及良好的熱穩定性、pH耐受性。該噬菌體感染復數低、裂解量高，在模擬養殖環境中表現出較好的殺菌效果，是一株具有較好應用前景的噬菌體。本研究為噬菌體類生物消毒劑的研發奠定了基礎，為禽大腸桿菌病的防控提供了新的思路。