樹莓中鞣花酸的提取及生物活性研究進展

張鑫宇，王亞菲，應 茵，王雪山

（棗莊學院食品科學與制藥工程學院，山東棗莊 277160）

樹莓是薔薇科懸鉤子屬的落葉小灌木，傳統中藥名為“覆盆子”，又名“山莓”“托盤”等，果實營養豐富，可入藥，是一種藥食同源植物。據記載，樹莓是最先被證明含有鞣花酸的植物之一，并且是抗癌物質鞣花酸的最佳來源之一[1]。研究表明，鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌和抑菌消炎等生物活性，還有鎮靜、降壓等作用，具有很高的利用價值[2]。近年來，樹莓鞣花酸的提取及分離純化工藝發展迅速，已成為國內外的研究熱點。

我國野生樹莓資源豐富，適合樹莓生長的地區廣泛，從樹莓中提取鞣花酸，并深入研究其生物活性具有重要的意義。本文對樹莓鞣花酸的提取、分離和純化方法進行了總結，同時介紹了鞣花酸的生物活性，以期為樹莓鞣花酸的進一步開發應用提供思路。

1 樹莓鞣花酸的結構及提取純化方法

1.1 鞣花酸結構及理化性質

鞣花酸是一種天然存在的酚類內酯化合物，其分子式為C14H6O8，分子結構如圖1 所示，含有四個酚羥基、兩個內酯基團[3]，顯弱酸性，大部分以縮合形式（包括鞣花苷、鞣花單寧等）存在[4-5]。

圖1 鞣花酸的化學結構式Fig.1 Chemical structural formula of ellagic acid

純凈的鞣花酸呈現黃色結晶粉末的形態，溶解度隨pH 的增加而增加，可溶于堿性水溶液和醇[6]。鞣花酸與不同化合物反應會呈現不同顏色，如與硫酸反應呈黃色，遇三氯化鐵顯現藍色等[7-8]。

1.2 鞣花酸的提取方法

在目前的研究中，鞣花酸提取方式主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法等。

1.2.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法是使用廣泛，也是較早應用于鞣花酸提取的一種方法。將原料破碎后，加入有機溶劑，在一定溫度下，提取一定時間后進行過濾和濃縮，可以得到鞣花酸粗提物[9]。劉卉等[10]以樹莓葉為原材料，考察了影響鞣花酸提取率的關鍵因素，發現提取劑濃度的影響最為顯著，然后依次是提取溫度、提取時間和固液比，最終得出乙醇濃度80%、提取溫度95 ℃、提取時間60 min、固液比3∶140（g/mL）的組合最為合適，在此條件下鞣花酸的提取量最大，達到0.432 8 mg/g，這與吳士龍等[11]的研究結果相似。在常用的四種溶劑（甲醇、乙醇、丙酮、鹽酸）中，李小萍[12]以紅樹莓為原材料，通過對比分析以挑選出最佳提取溶劑，發現丙酮提取得率最高，經過優選工藝條件，確定選用80%的丙酮進行萃取，在80℃下萃取90 min，最終可得到含量為322 μg/g 的鞣花酸提取物。

1.2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法（MAE）是利用微波破壞細胞壁加快釋放可提取化合物的一種方法[13]。Theocharis 等[14]研究表明，MAE 的最佳條件取決于待測物質的類型及其對微波的吸收程度。Sun 等[15]通過掃描電鏡發現，乙醇產量高、毒性低，是微波輔助提取的最佳培養基。崔珊珊等[16]以乙醇為提取劑，考察各影響因素后發現，微波功率的影響最為顯著，并得出最優條件為采用50%乙醇在60 ℃下提取1.8 min，固液比1∶19（g/mL），微波功率411 W，測得提取量為827.5 μg/g。

1.2.3 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法主要是通過超聲波的機械振動以及空化作用對鞣花酸進行提取[17]。王佳慧等[18]研究表明，利用超聲波提取19.72 min，在提取溫度80.02 ℃、固液比1∶14.04（g/mL）的組合下，樹莓鞣花酸的提取量最大，為670.28 μg/g，并且通過分析各因素對鞣花酸提取率的影響，發現料液比、提取時間對其影響較為明顯，這與趙慧芳等[19]的發現相似。此外，Sebojka 等[20]在樹莓鞣花酸的提取實驗中也利用了超聲波來輔助提取，提取量達到了40.06 mg/100 g。

1.2.4 鞣花酸提取方法的比較

表1（見上頁）分析了上述幾種提取方法，并對它們的優缺點進行了總結。由表可知，與傳統溶劑提取法相比，借助超聲波和微波進行輔助提取能極大地提高提取效率。

表1 鞣花酸提取方法的比較Table 1 Comparison of extraction methods of ellagic acid

1.3 樹莓鞣花酸的分離純化

鞣花酸粗提物中含有大量的雜質，對粗提物進一步分離純化才能達到更高的純度。樹莓鞣花酸純化的方法主要有以下幾種。

1.3.1 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（HSCCC）早在20 世紀70 年代由Ito 博士研發出來，是一種高效、新型的色譜分離方法，因組分在固定相與流動相（兩相都是液體）中分配系數不同而實現分離[23]。

溶劑體系的選擇是HSCCC 的關鍵環節，Ding 等[24]研究表明，若選用對鞣花酸溶解度較低的兩相溶劑體系，不斷增加樣品量，鞣花酸純度不會提高。辛秀蘭等[25]在利用HSCCC 分離純化樹莓鞣花酸時，在體積比為丁醇∶異丙醇∶水=2∶1∶3 的條件下進行了兩相溶劑體系的配制，設置流速為2 mL/min，機器轉速為850 r/min，且選擇了梯度洗脫方式來替換高速液相洗脫，可使鞣花酸純度達到81.6%。另外，Jikai 等[26]發現，每隔2.5 h 注射鞣花酸粗品，可以加速分離而快速獲得較高純度的鞣花酸。

1.3.2 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂吸附法是一種物理吸附方式，因其對不同組分的吸附及篩選力度不同，進而達到分離提純[27]。李慶等[28]在試驗中發現，用乙醇溶液洗脫時可以在低濃度下將鞣花酸洗脫出來，得到較高純度的鞣花酸。王佳寧[29]也發現50%乙醇對鞣花酸具有較好的溶解性，而濃度過高或過低都會溶解出較多雜質，不利于鞣花酸的分離。崔珊珊[30]采用X-5 大孔樹脂分離純化紅樹莓中的鞣花酸，得出經吸附、水洗、50%乙醇溶液洗脫，回收率達到了83.56%，純度達到了50.53%，且對比分析發現，純化后鞣花酸的粒徑顯著減小，純化后的粉體更加細膩、均勻。

1.3.3 分離純化方法的比較

目前，關于樹莓鞣花酸的分離純化方法較少，且存在一些問題。表2 對上述幾種方法進行了比較。

表2 分離純化方法的比較Table 2 Comparison of separation and purification methods

2 樹莓鞣花酸的生物活性

2.1 抗氧化及自由基清除作用

鞣花酸是一種天然的抗氧化劑[32]，起抗氧化作用的因素之一是它清除自由基的能力[33]。李小萍等[9]通過還原力測試、抗油脂氧化試驗和自由基清除試驗，證實了紅樹莓鞣花酸對·OH 與DPPH 自由基的清除作用非常顯著，并且具有很強的抗油脂氧化能力。Beekwilder 等[34]研究發現，樹莓鞣花酸清除·OH 和DPPH 自由基的效率分別達到74.8%和57.82%。此外，李俊[35]分離得到幾種不同純度的樹莓鞣花酸提取物，對它們進行抗氧化能力的比較，發現其抗氧化能力與鞣花酸含量成正比。崔珊珊等[16]發現通過不同方法得到的鞣花酸提取物，它們的抗氧化能力存在一定的差異。

2.2 抗炎性及抑菌性

鞣花酸可以抑制潰瘍，保護傷口避免細菌的感染，達到消炎的作用。NF-κB 是炎癥的中心因子[36]，Rosillo 等[37]發現，鞣花酸能夠抑制NF-κB 活化，抑制炎癥中心因子的表達。Marin 等[38]研究表明，鞣花酸可以減弱小鼠結腸炎癥狀，且可以有效治療潰瘍性腸炎。Enrico 等[39]以樹莓為原料，從中提取出鞣花酸，在TNF-α 和IL-1β 刺激的胃細胞系AGS 上檢測其抗炎活性，結果表明，樹莓鞣花酸提取物可以抑制NF-κB 核轉位，并且能使大鼠潰瘍指數降低75%，有效降低炎癥反應。

鞣花酸對不同種類的細菌有不同程度的抑制作用。辛秀蘭等[40]發現，鞣花酸能夠顯著降低大腸桿菌、枯草桿菌等細菌的活性，而對霉菌、黑曲霉以及酵母菌的抑制效果并不突出。閆莉等[41]通過實驗發現，其抑菌作用機理可能與破壞細菌的細胞膜有關。Thiem 等[42]的研究也表明鞣花酸在人體內具有抗菌活性，并且直接服用鞣花酸對人體無危害。

2.3 抑制腫瘤及抗癌性

樹莓鞣花酸在抑制腫瘤方面有良好的效果，且具有抗突變、抗癌變效應。楊洪亮等[43]對鞣花酸抗腫瘤機制進行了研究，提出了其作用機理可能與抑制DNA 合成、阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡有關。崔珊珊[30]通過建立紅樹莓鞣花酸體外抗氧化與肺癌細胞A549 增殖活性之間的相關性，發現二者呈顯著的正相關關系，證實了紅樹莓鞣花酸對A549 的增殖具有明顯的抑制作用。劉暢[44]研究發現，隨著紅樹莓鞣花酸濃度的增加，肝癌細胞的存活率會越來越低。鐘晨[45]證實鞣花酸對肝癌的抑制作用表現在它使HepG2 的細胞周期滯停在G0/G1 期，能進一步促進HepG2 細胞的凋亡。

2.4 其他生物活性

除上述幾種生物活性外，樹莓鞣花酸還有很多的生物活性，如Kang 等[46]發現，樹莓籽粉中的鞣花酸對高糖高脂飲食導致的血脂異常有明顯的改善作用，還可以通過減輕肝臟內質網應激與氧化應激反應，從而有效降低高糖高脂飲食引起的代謝并發癥，達到預防肥胖的效果。也有研究表明，紅樹莓鞣花酸可以保護正常細胞免受某些食品添加劑或化學物質造成的致癌毒素的侵擾[47]。一定劑量的鞣花酸能夠減弱順鉑抗癌藥物通過不同機制引起的腎毒性[48]，還有助于減輕飲酒導致的肝毒性[49-50]。

3 結論及展望

目前樹莓鞣花酸的提取工藝及分離純化技術還存在一些不足，有些副產物對環境造成一定影響。隨著儀器與科技的不斷發展，未來會有更多高效且綠色安全的方法被研發出來。近年來發展了一些新型技術，如超聲波-微波協同提取技術、膜分離技術等，但還未應用到樹莓鞣花酸的提取及分離中。

鞣花酸具有良好的抗氧化、抗癌及抑菌等生物活性，且隨著研究的深入，鞣花酸的藥用價值和保健功效更多地被挖掘出來。近年來，國外鞣花酸功能性食品暢銷，而我國鞣花酸相關產品還很少，具有廣闊的發展前景。因此應不斷優化樹莓鞣花酸的提取工藝，在醫藥和保健品領域發揮其更大的價值，以期促進樹莓產業長久發展。