胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6在舒尼替尼治療腎透明細(xì)胞癌中的作用*

胡威，祝恒成

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，武漢 430060)

透明細(xì)胞癌(clear cell-renal cell carcinoma，ccRCC)是人類泌尿系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，致死率最高，目前外科手術(shù)切除原發(fā)病灶仍是治療ccRCC最有效的方法，但ccRCC通過血液轉(zhuǎn)移概率高，手術(shù)切除原發(fā)病灶后依然存在轉(zhuǎn)移可能[1-4]。對(duì)于身體狀態(tài)差、無法耐受手術(shù)患者，或錯(cuò)過手術(shù)時(shí)機(jī)的晚期腎癌患者，或手術(shù)切除原發(fā)病灶后仍然發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，可考慮使用藥物治療。

舒尼替尼(sunitinib，美國(guó)輝瑞公司，商品名：索坦)是近10多年來開發(fā)出的多靶向抗癌藥物，具有強(qiáng)大的抗癌活性[5]，其最初開發(fā)目的是針對(duì)晚期轉(zhuǎn)移性腎癌，目前已被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)醫(yī)學(xué)指南推薦為晚期ccRCC一線治療藥物(如美國(guó)、歐盟和中國(guó)等)。多項(xiàng)臨床研究表明，舒尼替尼作為一線治療藥物，對(duì)ccRCC患者無進(jìn)展生存期及癥狀緩解率均優(yōu)于生物制劑α干擾素(interferon-α，IFN-α)等[6-7]，且舒尼替尼不良反應(yīng)較少，易被控制。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6，IGFBP-6)是一個(gè)較新的IGFBP家族成員，已有研究表明其在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8-9]，IGFBP-6在腎腫瘤中的作用筆者較少見到報(bào)道。筆者前期研究已證實(shí)，在ccRCC臨床標(biāo)本中，IGFBP-6 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IGFBP-6表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤TNM分期(tumor lymph node metastasis staging，TNM staging)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o相關(guān)性[10]。本研究旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察IGFBP-6在ccRCC中的作用，并研究舒尼替尼對(duì)ccRCC治療作用是否與調(diào)控IGFBP-6基因表達(dá)有關(guān)，以進(jìn)一步探索舒尼替尼藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞的培養(yǎng) 人正常腎小管上皮細(xì)胞株HK-2(批號(hào)：21563-29-1)、人ccRCC細(xì)胞株786-O(批號(hào)：CL-0010)均購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)；含10%新生胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RMPI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8117179)，平衡鹽DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8127186)，胰蛋白酶Trypsin-EDTA (美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：25200-56) 培養(yǎng)于37 ℃溫箱。為觀察舒尼替尼對(duì)786-O細(xì)胞株作用，將786-O細(xì)胞用舒尼替尼作用0～24 h，確定合適的用于干擾的舒尼替尼 (美國(guó)Onyx Pharmaceuticals公司，批號(hào)：SU-11248)；為觀察IGFBP-6與舒尼替尼關(guān)系，786-O細(xì)胞株被小干擾IGFBP-6(siRNA-IGFBP-6，IGFBP-6抑制劑)預(yù)處理30 min。

1.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè) RT-PCR試劑盒(日本寶生物株式會(huì)社，批號(hào)：RR820A)，LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司，批號(hào)：L3000001)，IGFBP-6在ccRCC及其臨近癌旁組織(adjacent paracancerous tissue，ANCT)中mRNA的表達(dá)由ABI 7300 RT-PCR分析系統(tǒng)完成。先提取總RNA，再以20 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃60 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣本設(shè)復(fù)孔3個(gè)，ABI 7300系統(tǒng)SDS軟件分析mRNA比值。引物：IGFBP-6，5′-GAGGGGCTCAAACACTCTACG-3′(上游)和5′-CCATCCGATCCACACACCA-3′(下游)；β-actin，5′-GTAAACATCCGCAAAGAC-3′(上游)和5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′(下游)。

1.3Western blotting檢測(cè) 1.5 mL離心管收集6孔板細(xì)胞，每3個(gè)復(fù)孔計(jì)為一個(gè)樣本，每孔細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)約4×105個(gè)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入4 ℃下新鮮配制的蛋白裂解劑 RMPI，冰上裂解 30 min，4 ℃下超聲波水浴洗脫30 s，預(yù)冷離心機(jī)至4 ℃，18 000 g·min-1離心10 min(r=15 cm)，取上清液，棄去沉渣。二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定獲得的蛋白濃度，計(jì)算每個(gè)點(diǎn)樣孔所需蛋白量，每孔取反應(yīng)體系30 μg，4%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)膠分離蛋白，200 V、120 MA、25 W運(yùn)行1 h， 分離后蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜，顯影后觀察轉(zhuǎn)印效果，5%脫脂奶粉[三乙醇胺緩沖鹽溶液 triethanolamine buffered saline solution(Tween)，TBST液配制]，室溫反應(yīng)1 h，分別加入1：1250陽(yáng)性對(duì)照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體與1：1250一抗 CD248單克隆抗體，置4 ℃冰箱孵育，搖晃，過夜，TBST 洗滌3次，每次5 min，加入1：2000二抗(兔抗)，室溫孵育 1 h，TBST洗滌3次，噴涂電致化學(xué)發(fā)光分析法(electrochemiluminescence analysis，ECL)顯影劑，反應(yīng)3 min，置富士LAS-3000數(shù)碼攝影系統(tǒng)，攝影存檔。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司用化學(xué)合成方法制作兩組不同序列的siRNA，siRNA1-IGFBP-6序列為5′--/GFP/CGGCTCCCGACGCGCCTTCG -3′，siRNA2-IGFBP-6序列為5′-/GFP/GTCCCGGTGACCTTCCTTGT-3′，陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，GFP為5′端綠色熒光基團(tuán)。siRNA轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染操作按照LipofectamineTM 3000說明書進(jìn)行。作用于786-O細(xì)胞株48 h后，激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon，Eclipse TE2000-E)觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

1.5CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè) 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期786-O細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞計(jì)數(shù)約5.0×103個(gè)。加RMPI1640無色培養(yǎng)基置37 ℃5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，按照CCK-8試劑盒說明書，分別于48，72 和 96 h后每孔添加RMPI1640無色培養(yǎng)基90 μL+CCK-8 10 μL，重新放回細(xì)胞培養(yǎng)箱，約3 h后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Spectra Ⅲ)在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A值)，通過每孔細(xì)胞不同A值來反映該孔內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量。將陰性對(duì)照組A值設(shè)為100%，設(shè)為參照，計(jì)算各種細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=A值siRNA組/A值陰性對(duì)照組×100%。每組細(xì)胞設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1IGFBP-6對(duì)人腎癌細(xì)胞系786-O的影響 與786-O細(xì)胞株比較，IGFBP-6基因在HK-2細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)量下調(diào)67.5%，蛋白表達(dá)量下調(diào)61.8%(P<0.01)，見圖1，圖2。

①與HK-2比較，t=2.016，P<0.01。

1，2.786-O細(xì)胞株；3，4.HK-2細(xì)胞株

2.2siRNA-IGFBP-6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞786-O細(xì)胞系結(jié)果 化學(xué)合成siRNA5′端自帶綠色熒光基團(tuán)5′-GFP，48 h后，在Nikon激光共聚焦顯微鏡下可見脂質(zhì)體破膜成功，成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染效率>90%，siRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)，少量位于細(xì)胞核(圖3， 左為空白，中為加熒光，右為上述兩圖重疊效果)。

圖3 786-O細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后激光共聚焦顯微鏡影像(×10)

2.3IGFBP-6的作用 在786-O細(xì)胞系，舒尼替尼誘導(dǎo)并上調(diào)IGFBP-6 mRNA及蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性，Western blotting及RT-PCR結(jié)果均提示，舒尼替尼誘導(dǎo)786-O細(xì)胞株IGFBP-6蛋白表達(dá)呈劑量依賴性，50 μmol·L-1舒尼替尼作用于786-O細(xì)胞系24 h可達(dá)到最理想上調(diào)效果，故選用50 μmol·L-1作為舒尼替尼后續(xù)干擾實(shí)驗(yàn)劑量(圖4)。為進(jìn)一步探索IGFBP-6在舒尼替尼對(duì) 786-O細(xì)胞系中發(fā)揮的作用，采用siRNA抑制IGFBP-6。結(jié)果顯示，兩個(gè)siRNA干擾組siRNA1-IGFBP-6及siRNA2-IGFBP-6均能逆轉(zhuǎn)舒尼替尼對(duì) 786-O細(xì)胞活力的影響，將陰性對(duì)照組(NC組) 設(shè)為參考值100%，可見siRNA1組及siRNA2組細(xì)胞生長(zhǎng)率在72 h及96 h均較高于舒尼替尼組(P=0.000)(圖5)。siRNA抑制IGFBP-6的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)舒尼替尼(50 μmol·L-1)對(duì) 786-O細(xì)胞活力的影響，將陰性對(duì)照組(NC組) 設(shè)為參考值100%，可見siRNA1組及siRNA2組細(xì)胞生長(zhǎng)率在72 h及96 h均高于舒尼替尼組(P=0.000)。

圖4 舒尼替尼對(duì)786-O細(xì)胞系中IGFBP-6水平的影響

圖5 4組786-O細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

3 討論

1996年，COLLETT SOLBERG提出胰島素樣生長(zhǎng)因子軸概念，隨后研究不斷深入，其成員也不斷增加，由最初的IGFBP-Ⅰ、IGFBP-Ⅱ、IGFBP-R到后來IGFBP-6。實(shí)驗(yàn)表明，在體液和細(xì)胞內(nèi)，IGFBP-6生物學(xué)作用尚未完全闡明，IGFBP-6除具有調(diào)節(jié)IGF功能外，還是一種重要的生長(zhǎng)抑制因子，參與細(xì)胞衰老與凋亡等多種生理過程[8-11]。其主要介導(dǎo)細(xì)胞壞死，比胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)強(qiáng)約50倍[12]。其這一特點(diǎn)使其成為一個(gè)非常有力的IGF-Ⅱ活性抑制劑，其對(duì)IGF-Ⅱ依賴性的腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[13]，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤和結(jié)腸癌[10-13]等已有文獻(xiàn)報(bào)道。這些研究結(jié)果提示IGFBP-6有明確的腫瘤生物學(xué)相關(guān)性，但在腎癌領(lǐng)域，筆者所見IGFBP-6與ccRCC的關(guān)系報(bào)道甚少。本課題組前期研究成果表明，IGFBP-6表達(dá)與ccRCC發(fā)生呈相關(guān)性[10]；與癌旁組織比較，ccRCC組織中IGFBP-6蛋白表達(dá)明顯升高。通過對(duì)比原發(fā)腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及周圍臟器侵犯等指標(biāo)，筆者發(fā)現(xiàn)IGFBP-6表達(dá)與ccRCC的TNM分期之間無明顯相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)中，IGFBP-6在人ccRCC細(xì)胞系786-O中表達(dá)上調(diào)，使用siRNA-IGFBP-6抑制IGFBP-6表達(dá)可逆轉(zhuǎn)50 μmol·L-1舒尼替尼對(duì)786-O細(xì)胞增殖的影響。因此，通過靶向下調(diào)IGFBP-6基因表達(dá)，抑制786-O細(xì)胞增殖，提高ccRCC患者存活率，是一條可行的途徑。

蘋果酸舒尼替尼是最近十年來開發(fā)的用于治療轉(zhuǎn)移性ccRCC的多靶向藥物，是一種高度特異性多激酶抑制劑，其主要作用靶點(diǎn)有血小板衍生生長(zhǎng)因子受體激酶(platelet derived growth factor receptor kinase，PDGFR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，其主要通過抑制腎癌細(xì)胞增殖來發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5，14-18]。本研究結(jié)果顯示，在786-O細(xì)胞系，舒尼替尼可上調(diào)IGFBP-6表達(dá)。IGFBP-6抑制劑siRNA-IGFBP-6能逆轉(zhuǎn)舒尼替尼對(duì)786-O細(xì)胞系的影響。這些研究成果表明，IGFBP-6參與了舒尼替尼的抗腫瘤作用過程。但I(xiàn)GFBP-6抗腫瘤具體作用機(jī)制，即IGFBP-6具體是通過哪條信號(hào)通路來影響細(xì)胞的增殖、壞死、凋亡等，尚待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，IGFBP-6 與ccRCC 發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，IGFBP-6 可能是舒尼替尼的一個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，參與舒尼替尼抗腫瘤過程，為進(jìn)一步明確舒尼替尼的藥理機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。