附子品質評價及影響因素研究進展*

蒲婷婷，王宇飛，周忠瑜，嚴靖婷，楊 燕**，段寶忠**

（1.大理大學藥學院 大理 671000；2.云南省科學技術院 昆明 650051）

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根加工品，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效，用于亡陽虛脫，肢冷脈微，心陽不足，胸痹心痛，虛寒吐瀉，脘腹冷痛，腎陽虛衰，陽痿宮冷，陰寒水腫，陽虛外感，寒濕痹痛[1]，是參附注射液、附子理中丸等300余種中成藥的重要原料，其年需求量高達3000噸[2]。然而由于產地、栽培方式、采收時間和加工炮制等因素造成附子質量參差不齊[3]，嚴重影響了臨床療效和用藥安全。近年來，有關附子的研究不斷深入，已有學者對附子的化學成分、藥理作用、質量控制等進行了研究[4-5]，亦有學者從附子的化學評價、生物評價、質量標準、炮制規范和檢測方法等角度，對附子的品質評價進行了綜述[6-7]，但尚未見從附子品質的有效性和安全性評價，以及附子品質影響因素的系統綜述，限制了對附子品質提升和評價體系建立的認識。鑒于此，本文首次對古代和現代附子品質評價及影響因素進行系統總結，以期為附子品質提升和評價體系的建立提供科學參考。

1 古代附子品質評價

古代附子品質評價始載于南北朝時期《雷公炮灸論》，其認為底平、有九角、如鐵色、一個個重一兩，即是氣全，堪用；此后宋代從角、節、花色角度評價附子品質，認為蹲坐正節角少，花色白為上；而明代則從肉色、皮色、角和形出發，認為色肉微黃，黑色頂全圓正者佳；清代從附子節、角、花色、皮色、產地和加工等角度，對附子品質評價方法進行了豐富，形成了以形態頂圓正底，角少，肉微黃，皮黑，花白為最佳的認識，詳細見表1。

表1 附子歷代品質評價

2 現代附子品質評價

2.1 附子的有效性評價

2.1.1 化學成分評價

紫外分光光度法（Ultraviolet and visible spectrophotometry，UV）主要用于附子中總生物堿含量的測定，如貝自英等[8]建立了酸性染料萃取光度法，用于附子中烏頭堿和次烏頭堿含量的測定，5-25 μg·mL-1，多位學者亦采用該法對附子及其炮制品中的總生物堿含量[9-10]和鎂含量及溶出率[11]進行了測定，但由于該法靈敏度和準確性存在較大問題[5]，2015年版中國藥典取消了該法用于總生物堿的檢測。

紅外光譜法（Infrared absorption spectrometry，IRS）被廣泛用于附子質量評價研究。如采用近紅外光譜（Near-Infrared spectroscopy，NIRS），結合偏最小二乘和最小二乘支持向量機法，對38批附子進行了研究，發現LS-SVM模型的相對預測偏差4.0-8.8，驗證集相關系數均在0.95以上，表明NIRS可用于附子中的單酯型和雙酯型生物堿總量檢測[12]；亦用于附子及炮制品中雙酯型生物堿含量的快速測定[13]。此外，研究發現附子、黑順片、白附片的近紅外光譜特征存在差異[14]，與吳志生等[15]研究結果一致。NIRS方法操作簡單，無需樣品預處理，實現了快速、綠色分析的目的，逐漸得到推廣應用。

薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）在中國藥典2020年版、韓國藥典-06均用于附子質量的評價，見表2；上述標準根據薄層色譜上附子提取液斑點的密度、顏色及位置來評價樣品質量。曹玲麗等[16]建立了生附子中烏頭堿的薄層色譜指紋圖譜法，發現TLC法的7個特征斑點顏色深淺與HPLC含量測定結果基本相符，可用于生附子質量初步評價。此外，多位學者采用薄層色譜法，對附子中烏頭堿分進行分離，發現該法分離效果良好，斑點清晰[17-18]。TLC法簡單易行，準確性和穩定性較理想，但靈敏度低，且無法測定成分的具體含量。

高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）是附子中生物堿成分檢測最主要的方法，如2020年版中國藥典、中國臺灣中藥材標準-03和中國香港中藥材標準-07，均采用HPLC方法測定，并規定毒性成分含量上限和有效成分下限，詳見表2。研究發現“一測多評法”可用于附子藥材及同屬植物的質量控制[19-20]，例如，Huang等[21]采用HPLCELSD法同時測定了5種醇胺型二萜生物堿。此外，指紋圖譜技術也被用于附子的質量評價，多位學者建立了附子的HPLC指紋圖譜，用于附子藥材及其炮制品的質量控制[22-24]；研究顯示不同采摘批次的生附子相似度0.9以上，各主要成分組成變化不大，但成分含量存在一定差異[25]。HPLC具有高速、高靈敏度、高分辨度等優點，因其能同時測定多種成分、結果準確而極受歡迎。

表2 各主要國家或地區對附子的質量規定

液相色譜-質譜聯用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC/MS）被廣泛用于附子中生物堿含量的測定。研究顯示液相色譜-串聯質譜（Liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）可用于烏頭屬中藥的質量評價[26-27]，共檢測出145個化合物以及77個質量標志物[28]；LC/MS可用于測定沒有紫外吸收的胺醇型二萜生物堿含量[29]；Zhang等[30]采用UPLC-MS技術從附子中鑒定出99個雙酯型生物堿。此外，采用HPLC與電噴霧質譜聯用技術檢測附子研究顯示，雙酯型生物堿為附子主要成分，而單酯型生物堿的含量和種類較少[31]。相比于HPLC，LC/MS技術測定的成分種類、數量更加豐富，還能進一步確定生物堿結構。

高效毛細管電泳法（High performance capillary electrophoresis，HPCE）亦被用于附子質量評價。韓樂等[32]建立了檢測附子中新烏頭堿、次烏頭堿等6種生物堿含量的HPCE法，r2〉0.9997，加樣回收率95.25%-103.91%，用于附子類藥材內在質量的評價和控制；付昆等[33]建立了分析附子多糖中單糖組分的高效毛細管電泳法，結果顯示該法靈敏度高，分離效果好。此外，Zhao等[34]發現較之傳統方法，HPCE法的分離度好且顯著提高分析效率，總分離時間只需13 min，但由于通常HPCE所采用的內徑為75 μm的毛細管色譜柱光程較短，其靈敏度受到影響。為增加化學成分信號響應強度，采用場放大進樣-高效毛細管電泳（Field amplified sample stacking-high performance capillary electrophoresis，FASS-HPCE）法[35]，對10批附子飲片的指紋圖譜進行了研究，結果顯示采用FASS富集后，其檢測靈敏度明顯提高并在18 min內完成測定工作，可用于附子的質量評價。與HPLC法相比，HPCE法分析時間短、雜質干擾少、使用有機溶劑少、操作方便，是一種很有應用前景的分析方法。

此外，采用酶聯免疫吸附劑測定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA法），對川烏和附子中雙酯型生物堿的含量進行了測定，發現與現行藥典收載的HPLC法相比，兩者檢測結果基本一致，但ELISA法測定靈敏度提高了約200倍，該法適用于川烏、附子藥材及其飲片中微量甚至痕量雙酯型生物堿的檢測[36]。

2.1.2 生物效應評價

附子常見的生物效應包括強心、抗炎、鎮痛和抗氧化等。采用大鼠室性早搏最小量測定法，對8種附子炮制品的生物毒性評價顯示，生附片醇提液最小中毒劑量遠低于其余附片，其次為黑順片、白附片、刨附片、炮附子及蒸附片；炒附片與炮天雄未檢測出心毒性，安全性好[37]，且8種附片均具有明確的強心效果；黑順片、白附片等5種附片具有中等強度強心活性，而炮附子與炮天雄強心活性最弱；強心活性驗證結果顯示去甲烏藥堿與去甲豬毛菜堿是強心活性物質[38]。

李立紀等[39]發現新法加工附子總生物堿高于附片13倍，但兩者抗炎、鎮痛的效果無明顯差異。附子水煎液可以增強老年大鼠血清中的總抗氧化能力（TAA）以及紅細胞超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低腦組織脂褐素（LPF）和肝組織丙二醛（MDA）的含量，改善肝細胞膜脂流動性（LFU）[40]；同樣Xu等[41]也發現附子水煎液可降低心衰標志ANP，NT-proBNP等表達，改善慢性心力衰竭情況。上述研究為附子臨床早期心臟毒性評價、抗炎鎮痛、強心、抗氧化活性與質量控制提供了整體、綜合的方法，可作為化學評價方法的有益補充。

2.2 附子的安全性評價

2.2.1 內源性有害物質

附子的內源性有害物質主要為其所含的毒性成分。現代研究表明，附子中含有大量烏頭堿成分，其中新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型生物堿既是有效又是強毒性成分，苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿等單酯型生物堿為低毒性有效成分，但在大劑量、高濃度條件下也有導致中毒的可能[42]。中國藥典和中國臺灣中藥材標準規定較為全面，使用上述6種生物堿對附子質量進行評價，但中國藥典并未規定其重金屬、農殘、霉菌素等限量標準，詳見表2。日本藥典使用4個指標對附子進行質控，規定烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、結烏頭堿含量分別低于0.006%、0.028%、0.014%和0.006%；中國香港中藥材標準僅規定3種有效成分之和的范圍，尚未對單獨成分進行規定。此外，韓國藥典采用TLC，利用斑點密度對附子進行質控，其要求明顯低于中國藥典。

2.2.2 外源性有害物質

外源性有害物質主要包括重金屬及有害元素、真菌毒素、殘留農獸藥、亞硫酸鹽以及有機污染物等[43]。作為國際廣泛使用的藥材，附子被多個國家藥典或地方標準收錄。日本藥典-17、韓國藥典-06、中國香港中藥材標準-07、中國臺灣中藥材標準-03均規定了附子中重金屬和農藥殘留限量，詳見表2。中國藥典未對附子中重金屬等相關指標作限制，依據《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》，多位學者對市售附子中的重金屬及有害元素進行了研究，結果顯示中國產區的附子絕大部分符合標準[44-47]。研究發現種植環境，如土壤，大氣、水源、加工等均會影響附子中重金屬及有害元素的組成，土壤中的Cd、Cu、Zn等元素容易被附子吸收，而土壤中的Cr、Pb、Ni、As、Hg相對不易吸收[48]；同時水質也是影響附子重金屬質量濃度的重要因素之一[45]。此外，研究發現市售附子的膽巴殘留量中鈣殘留較低，但Na、Mg、K殘留過大，質量分數分別為88.60，1252.39，7864.12 mg·kg-1，建議制定附子相關元素質量分數的限量標準[47]；附子炮制前后元素變化的結果顯示，炮制后Cu、Cr和Ni營養元素的濃度分別增加至1.03，18.90，5.02 μg·g-1，Pb和Cd含量分別降低44和1.4倍[49]。目前國內外針對附子農藥殘留的研究報道較少，僅見對四川省抽檢的100批附子進行了研究[50]，結果顯示32批附子SO2殘留超標不合格，殘留量為210-2079 mg·kg-1；有12批次樣品檢測出喹禾靈，平均檢出量為0.03 mg·kg-1；1批次樣品鎘超標，含量為2.99 mg·kg-1，表明附子種植中有違規使用農藥。綜上，外源性物質是影響附子安全性的重要因素，但目前中國藥典尚未規定有關指標的檢測限量，應進一步加強附子飲片質量標準研究，并完善優質種植基地和中藥材溯源體系建設。

3 影響附子品質的因素

3.1 種質因素

種質是影響附子品質的重要因素之一。研究發現，不同品種附子總生物堿和雙酯型生物堿含量差異較大，多糖含量差異不顯著[51]。夏燕莉等[52]、朱彥西等[53]對附子種質資源的生物學性狀和產量進行了比較，篩選出“中附1號”、“中附2號”、“中附3號”、“中附4號”4個優良種質品系，結果表明4個新品種具有良好的豐產性能，可作為優良株系在生產中應用[52-53]；此外，繆璐琳等[54]比較了不同種質附子的水煎液抗炎、鎮痛作用，發現四川布拖產大花葉、小花葉型附子和四川江油產小花葉附子的抗炎作用較好；布拖產小花葉附子的鎮痛作用最強；高繼海等[55]研究顯示小花葉與瓜葉子型附子間，其根表土壤的優勢真菌種類、群落多樣性均存在差異。綜上，不同種質的附子在產量、成分及藥效等方面存在差異，因此，篩選培育附子優質種質資源，對保障附子品質和產業可持續發展具有重要意義。

3.2 產地因素

附子在四川、陜西、云南等地均有栽培，土壤及氣候的不同是影響附子品質的重要因素。研究表明，不同栽培區附子的浸出物、總生物堿、雙酯型生物堿、多糖及蛋白質存在明顯差異[56-57]；四川江油栽培附子的雙酯型二萜生物堿遠高于云南和湖北[58]；對20份不同產地的附子生物堿含量的研究顯示[59]，新烏頭堿與附子靈在布拖和巍山產區中含量較高，而次烏頭堿、尼奧靈、卡米查林、宋果靈等在江油和漢中產區較高；研究還發現不同產區附子中附子靈、尼奧靈和宋果靈3種水溶性生物堿的含量差異較大，其中江油附子中尼奧靈含量明顯高于其他產區[60]，與蔣蕩等[61]的研究結果一致；此外，對四川江油、布拖和云南的黑順片進行研究，發現指紋圖譜相似度大于0.9，化學計量學結果顯示，35批樣品可聚為3類，四川江油產黑順片與四川布拖、云南產存在一定差異性[62]；四川江油產區不同商品之間的相似度均大于0.9，其它產區與四川江油產區比較，相似度小于0.9[63-64]，該研究結果與王曉雅等[62]結果有一定差異；梅超南等[65]研究發現，四川產江油附子對維拉帕米注射液誘發的大鼠緩慢型心律失常作用，較四川涼山附子、云南祿勸、陜西漢中等產區強。查閱文獻整理了云南、陜西、貴州、四川的18個縣市（以縣為單位，同一縣如有多個樣品取平均值）102批生附子，對其藥典指標成分單酯型生物堿（苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿）和雙酯型生物堿（新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿）的平均含量進行分析，結果見圖1。可見各產地附子所含雙酯型生物堿（圖1a）及單酯型生物堿（圖1b）的含量不盡相同，表明產地是影響附子品質的重要因素。

圖1 各產地樣本中主要化學成分含量的總結

3.3 栽培因素

氣候、土壤因子及栽培管理方式與附子質量密切相關，且肥沃的土壤有利于產量和質量的提高[66]。研究顯示土壤養分對附子生物堿含量有較大影響，其中全氮和速效磷對附子中雙酯型生物堿含量影響作用較大[67]；在同一氣候條件下，不同地塊附子生物堿類成分含量存在差異[68]；適時打頂可以提高附子產量和品質，同時可促進總生物堿、雙酯型生物堿及單酯型生物堿的積累[69]。此外，在生產過程中噴施烯效唑，對附子總生物堿含量無顯著影響，但可增加莖粗、葉片數、須根數、干物質量[70]；6-芐氨基嘌呤和對總生物堿的含量有抑制作用[71]；萘乙酸可提高附子中新烏頭堿和烏頭堿的含量，降低次烏頭堿的含量；赤霉素和細胞分裂素類對附子生物堿成分影響不大。鋅、硼、鐵、錳微量元素肥料，對附子生物堿成分含量可產生顯著影響[72]。綜上，不同產區氣候、土壤及栽培措施，可導致附子化學成分和產量等的不同，實際生產中，需綜合考慮相關因素。

3.4 加工方式

產地加工是影響附子品質的重要因素之一，不同的加工方法會導致附子的品質差異。生物堿是附子發揮藥效的主要成分，但其中的雙酯型生物堿具有劇毒，為臨床應用所忌憚，因此附子入藥前須經加工炮制以降低其毒性。此外，由于新鮮附子易腐爛變質，采收后需趁鮮加工。目前有關附子加工對品質的影響，主要集中在泡膽和不同蒸制方式領域。

3.4.1 泡膽

泡膽加工使用歷史悠久，其對附子化學成分含量、飲片形態和物理性質等均會產生影響。研究發現有膽與無膽兩種炮制方法，均降低雙酯型生物堿含量，但增加單酯型生物堿含量[73]；泡膽能使雙酯型生物堿含量降低[74]，經膽巴浸泡20天后生物堿含量損失70%左右[75]；匡青芬等[76]研究發現無膽炮制的4種附子飲片，生物堿指標符合藥典規定，毒性雙酯型生物堿含量明顯低于有膽附片。此外，亦有研究發現泥附子洗凈后在膽巴溶液中浸泡，新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿和苯甲酰新烏頭原堿的含量逐漸降低，20天以后含量趨于穩定[75]，并發現浸泡25天后，膽巴含量達到飽和[77]；附子在10%濃度的膽巴液中浸泡，質量不穩定，在20%及以上濃度質量相對穩定。在膽巴液浸泡過程中，附子的效/毒比也在發生變化，18-24天期間，呈現出活性成分較高，而毒性成分較少的狀態，有利于實際生產[78]。此外，膽巴可對附子起到固形作用，30%濃度是固形的最優濃度[79]，300 g·L-1氯化鈉浸泡后得到的附子飲片較佳，還可避免膽巴中的重金屬在附子中殘留[80]。還有報道指出，黑順片與其他無膽及含膽少的附片相比，其對不同臟器毒性也有所不同[81]，且在黑順片的炮制過程中，不同炮制階段膽巴的殘留量也會影響黑順片的毒性[82]。

3.4.2 蒸制或煎煮

附子毒性大小與加工密切相關，尤其是蒸制或煎煮時間不足或方法不當，是附子中毒的公認原因之一。多位學者對附子加工過程成分動態變化進行了研究，發現附子經煎煮炮制后，雙酯型生物堿水解轉化為單酯型生物堿及原堿，如焦新烏頭堿、焦烏頭堿、焦次烏頭堿和苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等，毒性大大降低[83-85]。同時，附子煎煮2-10 min后，烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型二萜類生物堿含量較高，而苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰中烏頭原堿等毒性較小的單酯型生物堿在煎煮60 min內逐漸增加，隨后趨于穩定[86]；附子煎煮2 h后，雙酯型生物堿無法檢出，單酯型生物堿逐漸升高，在6-8 h達到峰值，后逐漸降低[87]。綜上，適宜的泡膽、煎煮及蒸制可降低附子毒性，一定程度增加有效成分含量，具有減毒增效作用，但膽巴殘留量及蒸制時間等顯著影響附子藥材質量，目前有關炮制標準并未對這些參數進行規定，有待進一步規范。

3.5 采收時間

對不同采收期附子新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的含量研究顯示，隨著時間（7-9月）的推移，新烏頭堿的含量呈下降趨勢，次烏頭堿、烏頭堿的含量呈上升趨勢[88]。拓亞琴等[89]對陜西漢中地區不同采收期附子產量、總生物堿和烏頭堿含量進行研究，認為8月15日前后為附子的最佳采收時期，此階段附子的產量最高，含量也符合要求；對四川布拖不同生長期的附子產量和總生物堿含量研究顯示，從藥材內在質量和產量兩方面綜合考慮，8月20日-9月10日為附子的最佳采收期[90]。此外，附子中多糖的含量因采收期不同差異較大，在生長后期含量較高[91]。

3.6 貯藏

對附子自然堆放、麻袋覆蓋、沙藏、冷藏4種貯藏方式下的含水量、生物堿、粗多糖含量變化研究顯示，隨著貯藏期的延長，其含水量、生物堿成分逐漸降低。冷藏條件下，附子生物堿含量由貯藏初期的1.67%逐漸下降到1.27%，品質優于比其它儲藏方式[92]；上述4種貯藏條件下，附子的呼吸速率、可溶性蛋白、淀粉含量及淀粉酶活性的研究顯示，冷藏處理使附子外形始終完好，含水量維持在64%，保水效果最好，呼吸速率最低，淀粉酶活性最低，可溶性蛋白含量從1.56%上升到2.9%，優于其他方式。生產上有條件的地方應采用低溫處理的方法保藏新鮮附子，也可采用沙藏和麻袋覆蓋進行短期保存，但水分需保持在50%以上[93]。

3.7 不同商品規格

附子常見的商品規格有泥附子、鹽附子、黑順片、白附片等[1]，研究顯示不同商品規格其化學成分差異明顯，如鹽附子中烏頭堿的含量明顯高于白附片和黑順片[94]；蒸附片中單酯型生物堿、原堿和總生物堿的含量明顯高于烘附片，但雙酯型生物堿含量低于烘附片[95]。此外，研究表明不同商品規格其藥理功效亦有差異，如生附子可引起心電圖異常變化和不同程度的心肌損傷，而黑順片、白附片導致的心電異常較生附子弱[96]；強心活性分析結果顯示生附片強心作用較強，明顯優于黑順片、白附片等傳統飲片規格[38]；亦有研究發現黑順片、刨附片、蒸附片、炒附片均具有鎮痛、抗炎、提高免疫作用，但各商品規格的作用效果存在差異[97]；黑順片抗炎作用優于白附片，抗免疫力作用優于淡附片；白附片的強心、耐缺氧作用較強；炮附片的鎮痛效果優于黑順片[98]；隨著附子質量的增大，雙酯型生物堿的含有量呈降低趨勢，強心成分呈升高趨勢，單酯類生物堿變化不明顯；各商品規格鎮痛效果無顯著性差異[99]。

4 結論與展望

附子作為傳統大宗中藥，其品質對臨床用藥的有效性和安全性意義重大，目前中國藥典對其毒性成分上限和活性成分下限進行了規定，但未規定雙酯型生物堿的最低含量，這導致附子飲片中的雙酯型生物堿含量普遍很低，且不同廠家相差很大。已有多項研究表明，在附子加工過程中，雙酯型烏頭堿分解為烏頭原堿，強心功效顯著降低[100]，且存在炮制過度的現象，難于保證臨床用藥的有效性[101]。另外已有藥效研究表明，去甲烏藥堿與去甲豬毛菜堿是附子的主要強心成分[38]，但目前尚缺乏這些成分與附子品質的相關研究，因此對附子品質評價指標及其限量應開展更深入系統的研究。多個國際標準均已規定了農殘、重金屬、SO2等外源性有害物質的限量，但目前中國藥典尚未對附子的外源性有害物質進行規定，應加強這方面的研究，為附子進入國際貿易市場提供依據。同時，附子的藥效和毒性等相關研究比較有限，現有資料還不能完全揭示其“回陽救逆”的功能本質，且當前附子加工缺乏統一炮制規范，導致其飲片質量參差不齊，膽巴殘留、生物堿含量差異較大[102]，應加強相關基礎研究，明確附子毒性和藥效相關成分。在繼承傳統的基礎上，對附子炮制工藝參數進行優化和確定，最大程度上保留有效成分、降低毒性，保證飲片質量的穩定、可控。此外，種質、產地、加工、栽培及采收等因素對附子品質的形成具有重要影響。鑒于上述分析，今后應進一步加強附子質量標準的研究，健全質量控制體系建設，如將強心活性成分去甲烏藥堿和去甲豬毛菜堿等，作為附子質量控制指標之一，并對膽巴、農藥和重金屬殘留限量等進行明確，以保障臨床用藥安全；其次，確定附子炮制過程中泡膽、蒸煮、晾曬等工藝的具體時間，保證飲片質量的均一性；加強附子優質種質的篩選培育，探究品質與其影響因素的作用機制，保障附子產業的可持續發展，制定科學規范的種植和加工技術體系，確保附子優質原料和藥材飲片的供應，以滿足市場對高品質附子的需求。