基于HPLC指紋圖譜、多指標成分含量測定結合化學計量學的懷牛膝質量評價*

王彥夫，劉 艷，楊琬琪，匡海學，楊炳友

（黑龍江中醫藥大學教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室 哈爾濱 150040）

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，主產于河南，全國各地均有栽培，道地產區為河南省焦作市，為“四大懷藥”之一，習稱其為懷牛膝。2020版《中國藥典》[1]記載其具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨、利尿通淋、引血下行的功效。臨床上常用于急性咽炎、高血壓、痛風性關節炎、引產、功能失調性子宮出血等癥。

國內外研究報道表明牛膝根內含有皂苷類、甾酮類、多糖類、生物堿等成分[2-7]。其中，甾酮類化合物為牛膝的主要成分之一，具有抗腫瘤、鎮痛抗炎、抗骨質酥松等活性[8-10]。牛膝藥材質量受多因素影響，不同產地的牛膝藥效有顯著差異，這可能是因為不同產地的牛膝所含的化學成分不同或其部分化學成分的含量有所不同。

含量測定為歷代《中國藥典》中判定藥材質量的常用方法，具有方法簡單、成本低、易操作等優點[11]，現2020版《中國藥典》中對牛膝的質量標準僅以β-蛻皮甾酮含量判斷不夠全面。隨著中藥指紋圖譜的研究越來越深入，將指紋圖譜作為質量控制的方法得到了廣泛應用，中藥指紋圖譜可對成分復雜的中藥材及制劑，進行色譜分析得到豐富的化學信息，從而實現對不同中藥材及制劑的質量控制[12]。化學計量學的出現及應用更是將指紋圖譜中所包含的化學信息提取并數字化，可對大量樣品進行全面準確的鑒別歸類，為中藥材的質量控制提供了極大的便利[13]。因此本實驗通過多指標含量測定并建立HPLC指紋圖譜，結合化學計量學對河南省不同產地的懷牛膝藥材建立更加全面的懷牛膝質量評價方法，為懷牛膝的質量評價提供參考。

1 材料

萬分之一電子分析天平（AL204，梅特勒-托利多），超聲波清洗器（KQ-250E，昆山超聲儀器有限公司），高效液相色譜（型號：e2695；檢測器型號：2998 PDA檢測器，美國Waters科技有限公司）。15批懷牛膝經樊銳鋒副教授鑒定（黑龍江中醫藥大學藥學院）均為莧科科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，保存于黑龍江中醫藥大學中藥化學實驗室（產地見表1），水為超純水，甲酸、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，β-蛻皮甾酮（純度≥98%，LOT：HR20625W5）、25R-牛膝甾酮（純度≥95%，LOT：HR20924W3）、25S-牛膝甾酮（純度≥98%，LOT：HR4229W4）均采購自寶雞晨光生物科技有限公司，所購藥材晾干，粉碎后過3號篩備用[12]。

表1 15批懷牛膝藥材來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 為Waters SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以A：乙腈，B：0.1%甲酸水為流動相；梯度洗脫條件見表2，檢測波長設置為280 nm；流速為1.0 mL·min-1；進樣10 μL，柱溫為25℃，洗脫時間為70 min，理論板數按β-蛻皮甾酮峰計算應不低于4000。

表2 梯度洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備

稱取β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮對照品適量，制成濃度分別為2.57、0.55、0.74 mg·mL-1的對照品母液。分別精密量取β-蛻皮甾酮對照品母液800 μL，25S-牛膝甾酮對照品母液500 μL，25R-牛膝甾酮對照品母液500 μL，混合，定容至2 mL，搖勻，得到β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮濃度依次為1.14、0.15、0.21 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取懷牛膝粉末（過三號篩）5 g，置錐形瓶中，加水飽和正丁醇30 mL，密塞，浸泡過夜，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，用甲醇10 mL分數次洗滌容器及殘渣，合并濾液和洗液，減壓回收至干，以甲醇定容至1 mL，離心取上清液，過0.22 μm濾膜，即得[14]。

2.4 方法學考察

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末，按2.3項下方法制備供試品溶液；2.1項下色譜條件，以β-蛻皮甾酮為參照峰，通過計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積對該方法重復性，儀器精密度以及樣品穩定性進行考察。精密稱取6份，每份5 g進行重復性考察，取其中一份連續測定6次進行精密度考察，并在室溫條件下，分別于0、2、4、8、16、24 h時進行穩定性考察。其共有峰的相對保留時間RSD均〈2.0%，相對峰面積RSD均〈3.0%，說明該方法重復性良好，儀器精密度良好，樣品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.5 懷牛膝指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜相似度評價

精密稱取15批不同產地的懷牛膝藥材粉末各5 g，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，提取記錄各樣品色譜圖，并將15批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012版）》中，設S1號樣品色譜圖為參照圖譜，時間窗寬度0.10 min，采用中位數法，多點校正后得到15批懷牛膝藥材HPLC圖譜疊加圖（圖1），及對照指紋圖譜（R）（圖2）。共得到31個共有峰，計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度結果為0.979、0.892、0.896、0.902、0.958、0.978、0.912、0.973、0.977、0.972、0.969、0.876、0.943、0.967、0.802由該相似度分析結果顯示，11批樣品的相似度大于0.900，其差異性較小，其中產地為河南省安陽市的S2、S3兩批藥材以及河南省駐馬店市的S12、S15兩批藥材相似度小于0.900，說明不同產地中個別批次的懷牛膝藥材成分具有一定的差異性[15-16]。

圖1 15批牛膝藥材樣品指紋圖譜

圖2 懷牛膝藥材對照指紋圖譜(R)

2.5.2 共有峰的指認

按2.2項下制備對照品溶液，2.1項下色譜條件對對照品溶液進行測定，將得到的色譜圖（圖3）與對照指紋圖譜進行對比可知，峰13為β-蛻皮甾酮，峰14為25R-牛膝甾酮，峰15為25S-牛膝甾酮。

圖3 混合對照品HPLC圖

2.6 三種指認成分含量測定

2.6.1 對照品溶液制備

精密稱取β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮對照品適量，至5 mL量瓶中，加甲醇定容，得到濃度依次為3.214、0.414、0.630 mg·mL-1的混合對照品溶液。精密吸取對照品溶液適量，加甲醇定容，梯度稀釋，共得到混合對照品溶液6份，見表3。

表3 六種梯度混合對照品濃度

2.6.2 線性關系考察

按2.1項下色譜條件對配制的混合對照品溶液進行測定，記錄峰面積。以β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮進樣量（mg）為橫坐標（x），以峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸。其線性回歸方程及線性范圍見表4。

表4 混合對照品溶液HPLC分析回歸方程測定結果

2.6.3 精密度

取2.6.1項下制備的對照品溶液，按2.1項下色譜條件進行連續6次測定，積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積，在6次測定下，3種成分的峰面積RSD均〈2.0%，說明儀器具有良好的精密度。

2.6.4 重復性

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末6份，按2.3項下方法制備供試品溶液；2.1項下色譜條件進行重復性考察。積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積。其6份樣品中3種待測成分的峰面積RSD均〈3.0%，說明該方法的重復性良好。

2.6.5 穩定性

取河南省焦作市的懷牛膝藥材粉末6份，按2.3項下方法制備供試品溶液；2.1項下色譜條件，在室溫條件下分別于0、2、4、8、16、24 h時進行穩定性考察，積分獲得β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮，25S-牛膝甾酮的峰面積。其中3種待測成分的峰面積RSD均〈3.0%，說明該樣品溶液在室溫條件下24 h內穩定。

2.6.6 加樣回收率

精密稱取已知含量的懷牛膝藥材粉末約1 g，置錐形瓶中，精密加入用水飽和正丁醇配制的混合對照品溶液（β-蛻皮甾酮142 μg·mL-1，25R-牛膝甾酮43 μg·mL-1，25S-牛膝甾酮30 μg·mL-1）5 mL和水飽和正丁醇25 mL，按2.3項下方法制備加樣供試溶液，測定并計算β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的加樣回收率，測定結果分別見表5，6，7。

表5 β-蛻皮甾酮加樣回收率測定結果

表6 25R-牛膝甾酮加樣回收率測定結果

表7 25S-牛膝甾酮加樣回收率測定結果

2.6.7 樣品測定

將15批懷牛膝藥材按2.3項處理后進樣分析，獲得15批懷牛膝藥材樣品中β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的峰面積，利用測得的結果，計算懷牛膝樣品中3種甾酮類成分的含量，每組實驗平行測定3次，實驗結果見表8。

表8 15批懷牛膝藥材樣品含量測定結果（%，n=3）

2.7 化學計量學分析

2.7.1 聚類熱圖分析

將15批懷牛膝指紋圖譜的31個共有色譜峰的峰面積組成31×15階矩陣，導入Metabo Analyst 5.0網站中進行聚類熱圖分析。以共有峰峰面積作為變量，采用標準化中位數法，得到聚類熱圖，見圖4。結果表明，15批懷牛膝樣品被分為3類，S1、S2、S3、S4、S5聚為一類，其產地均為河南省安陽市，且其指紋圖譜共有峰中2、3、5、10、11、16、24、26、27號峰代表的化學成分明顯高于安陽市和焦作市兩個產地；S6、S7、S8、S9、S10聚為一類，其產地均為河南省焦作市，其中共有峰1、4、6、7、8、9、12、13、14、15、18、21、22、25、28、29、30、31所代表的成分含量略高于安陽市所產懷牛膝，高于駐馬店市所產懷牛膝；S11、S12、S13、S14、S15聚為為一類，其產地均為河南省駐馬店市，其中17、19、20、23號峰代表的化學成分明顯高于安陽市和駐馬店市兩個產地。

圖4 15批懷牛膝藥材樣品的聚類熱圖

2.7.2 主成分分析

將15批懷牛膝指紋圖譜的31個共有色譜峰的峰面積組成31×15階矩陣導入SIMCA 14.1軟件，建立PCA模型，采用自標度化法（UV）進行縮放，提取2個主成分，得到模型解釋率參數R2X為0.700，預測能力參數Q2為0.544，表明提取的主成分可解釋70.0%的原始變量，模型的預測能力為54.4%。15批懷牛膝樣品的PCA得分圖見圖5，結果顯示15批懷牛膝樣品能基本分為3類，與聚類分析結果相互佐證，進一步說明不同產地懷牛膝化學成分的含量存在一定的差異。

圖5 15批懷牛膝藥材樣品的PCA得分圖

2.7.3 偏最小二乘法-判別分析

為進一步尋找不同產地懷牛膝間的差異性成分，我們對15批懷牛膝樣品進行PLS-DA分析。將共有峰峰面積導入SIMCA 14.1軟件，獲得相應PLS-DA模型，提取4個主成分，得到模型解釋率參數R2X和R2Y分別為0.838和0.985，模型預測能力參數Q2為0.941，表明模型對變量X的可解釋能力為83.8%，對變量Y的可解釋能力為98.5%，模型的預測能力為94.1%，說明該模型穩定、可靠。PLS-DA得分圖見圖6。結果顯示15批懷牛膝樣品被分為3類，與PCA相比，各組懷牛膝樣品進一步聚集。

圖6 15批懷牛膝藥材樣品的PLS-DA圖

變量投影重要性（VIP）值是篩選差異化合物的重要指標，VIP值越高，表明其對組間差異的影響越大。以貢獻值VIP〉1為標準，得到17個成分，結果見圖7。按VIP值大小排序依次為2號峰、24號峰、16號峰、26號峰、5號峰、27號峰、19號峰、3號峰、23號峰、20號峰、17號峰、18號峰、31號峰、29號峰，21號峰、22號峰、28號峰。由此推測這17個共有峰所代表的化學成分可能是導致三個不同產地懷牛膝之間差異的主要變量，與聚類熱圖分析的差異性成分較為一致[8]。

圖7 15批懷牛膝31個共有峰的VIP值

3 討論

3.1 色譜條件的優化

現階段對懷牛膝指紋圖譜的研究中，共有峰鑒定數量較少，檢測時間較長[17]且多需要變波長檢測[18]，本實驗為了確定最佳色譜條件，對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液3個流動相體系進行了考察，最終確定以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，該條件下系統基線平穩，色譜峰分離較好；采用2998 PDA檢測器對樣品進行了190-400 nm全波長掃描，確定檢測波長為280 nm，該條件下色譜信息較為豐富，整體峰形較好。通過優化色譜條件，大大縮短了檢測時間，同時也確定了最優檢測波長，可為不同產地懷牛膝的質量評價的色譜條件提供參考。

3.2 含量測定結果分析

據文獻報道[17]，河南省不同地區所產懷牛膝也具有一定質量差異，由含量測定結果可知河南省各產地懷牛膝β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮含量較為接近。2020版《中國藥典》中對懷牛膝的質量標準規定以β-蛻皮甾酮含量判斷不得少于0.03%，本實驗15批懷牛膝的β-蛻皮甾酮含量在0.068%-0.073%之間，明顯高于藥典標準，而甾酮類成分作為懷牛膝的主要成分之一，具有較好的活性以及可測性，因此本實驗通過HPLC指紋圖譜建立更加全面的懷牛膝質量評價方法，同時提供了共有性成分25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的含量測定的一種可行性方法。可為懷牛膝的質量評價中甾酮類成分含量測定的指標提供參考依據。

3.3 化學計量學結果分析

為了進一步區分并對不同產地懷牛膝進行質量評價，我們在最佳色譜條件下，建立了15批懷牛膝藥材的指紋圖譜，其11批相似度在0.900以上，并且標定了31個共有峰，指認了其中3個共有峰成分，其他共有峰成分有待確定。并將15批懷牛膝藥材的指紋圖譜的共有峰峰面積進行聚類熱圖分析、主成分分析以及偏最小二乘法—判別分析。結果發現河南省不同產地懷牛膝其他成分存在含量差異，聚類熱圖分析結果顯示15批樣品可聚為3類，S1-S5為一類，S6-S10為一類，S11-S15為一類，此與主成分分析結果、正交偏最小二乘-判別分析結果基本一致，通過熱圖分析可知，安陽所產牛膝中峰2、3、5、10、11、16、24、26、27所代表的化合物含量較高，駐馬店市所產牛膝中峰17、19、20、23所代表的化合物含量較其他產地高，焦作市所產牛膝中以上成分含量均小于其他兩個產地，通過對比以上共有峰可初步篩選區分該牛膝所屬產地，依據VIP〉1得到的17個共有峰，推測該17個成分可能為造成不同產地懷牛膝質量差異的潛在成分，可對不同產地的懷牛膝質量控制中其他指標的選擇提供實驗參考。

4 結論

本研究建立了一種簡單、快速、便捷且具有較好的準確性的懷牛膝三種甾酮類成分（β-蛻皮甾酮，25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮）的含量測定方法，同時建立了15批懷牛膝的指紋圖譜，并首次結合化學計量學從多角度相互驗證下對不同產地15批懷牛膝的共有成分進行分析，篩選出了不同產地間懷牛膝質量差異性成分，可為懷牛膝的質量控制提供參考。