冰片促燈盞乙素透體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的作用研究*

李志林，鄭祖杰，黎曉冬，曾潔萍

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 成都 610075）

青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cells，RGCs）及其軸突進(jìn)行性丟失為病理基礎(chǔ)的神經(jīng)變性性疾病，臨床上青光眼的主要治療措施是降低眼壓，但臨床發(fā)現(xiàn)某些眼壓得到有效控制的青光眼患者，仍然存在視功能繼續(xù)受損的情況，單純控制眼壓無法遏止RGCs凋亡[1]。故如何在眼壓控制后繼續(xù)對(duì)視神經(jīng)保護(hù)成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，在既往研究中已有采用各種中藥對(duì)視神經(jīng)保護(hù)的研究，諸如枸杞多糖、雷公藤、白藜蘆醇等[2]。也有研究證實(shí)活血通絡(luò)中藥如燈盞細(xì)辛提取物對(duì)急性眼內(nèi)壓升高的大鼠RGCs具有確切的保護(hù)作用[3-4]。同時(shí)臨床上研究表明燈盞花素注射液對(duì)于部分青光眼濾過術(shù)后患者的視野有部分改善作用[5]，然而口服制劑（燈盞花素片）臨床卻未達(dá)到預(yù)期效果，這可能是因?yàn)榭诜茈y透過血眼屏障而在眼內(nèi)達(dá)到有效濃度，注射給藥方式又難以長期持續(xù)給藥從而臨床療效不理想有關(guān)。

口服藥品經(jīng)吸收后通過血液到達(dá)全身，想要進(jìn)入視網(wǎng)膜內(nèi)，需要首選通過血-視網(wǎng)膜屏障。既往研究發(fā)現(xiàn)冰片作為中醫(yī)外科的常用藥，可經(jīng)眼、皮膚等部位吸收[6]。張瑞濤等[7]研究表明，經(jīng)鼻腔將冰片給藥可明顯提高鼻腔黏膜血管和腦血管的通透性，在一定濃度范圍內(nèi)，伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）的通透性與冰片使用濃度呈線性關(guān)系。而血-視網(wǎng)膜屏障由內(nèi)屏障和外屏障組成：內(nèi)屏障由視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間的緊密連接構(gòu)成。因此本研究通過構(gòu)建內(nèi)屏障模型觀察冰片對(duì)藥物的促透過作用。

1 HBSS中燈盞乙素含量測(cè)定方法學(xué)建立

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及藥物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

API4000型HPLC-MS/MS儀（ABSCIEX公司），十萬分之一電子分析天平（SHIMADZU公司），H2050R低溫高速離心機(jī)（湖南湘儀），EKUP-II-150L型超純水儀（四川宜科），多規(guī)格可調(diào)移液器（Sartorius）；實(shí)驗(yàn)藥品燈盞乙素（純度98.54%），批號(hào)AF8051821；冰片，批號(hào)AF8040412；黃芩苷（純度99.31%，內(nèi)標(biāo)），批號(hào)AF9062402，均購自于成都埃法生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用甲醇、甲酸、乙腈均為HPLC級(jí)。實(shí)驗(yàn)中所用純水為超純水。

1.1.2 測(cè)定對(duì)象

燈盞乙素CAS#：27740-01-8；分子式：C21H18O12；分子量：462.36。黃芩苷CAS#：21967-41-9；分子式：C21H18O11；分子量：446.36

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 色譜條件

HPLC-MS/MS系統(tǒng)由Aglient公司1260型HPLC儀和AB SCIEX公司API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（ESI離子源）組成。選擇Agilent ZORBAX C18色譜柱（2.1e100 mm，3.5 μm，批號(hào)959793-902），柱溫30℃。流動(dòng)相A為0.1%的甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%的乙腈溶液。梯度洗脫（見表1）。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相

1.2.2 質(zhì)譜條件

以選擇性負(fù)離子對(duì)監(jiān)測(cè)模式（MRM）測(cè)定燈盞乙素（m/z 461.3/285.2）的濃度，黃芩苷作內(nèi)標(biāo)（m/z 445.1/268.9），質(zhì)譜參數(shù)見表2，燈盞乙素質(zhì)譜product碎片離子掃描圖見圖1，黃芩苷質(zhì)譜product碎片離子掃描圖見圖2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

圖1 燈盞乙素質(zhì)譜product碎片離子掃描圖（m/z 461.3/285.2）

圖2 黃芩苷質(zhì)譜product碎片離子掃描圖（m/z 445.1/268.9）

1.2.3 樣本預(yù)處理

取待測(cè)樣本10 μL，加入0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15∶85的溶液90 μL，混勻后，再加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作液（1000 ng·mL-1的黃芩苷甲醇溶液），混勻后于4℃、12000 r·min-1離心5 min后，取上清液50 μL上樣，進(jìn)樣5 μL分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst色譜工作站，自動(dòng)計(jì)算待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積、峰面積比值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)定濃度以及偏差。濃度單位為ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線加權(quán)設(shè)置為1/c2。以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣后的色譜峰面積比值對(duì)應(yīng)其理論濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，未知樣本進(jìn)樣后得到的色譜峰面積比值代入次標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可反算出其濃度。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

先用天平稱取燈盞乙素10.15 mg標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于燈盞乙素10 mg，用甲醇配制燈盞乙素儲(chǔ)備液（100 μg·mL-1），儲(chǔ)存條件-35℃冰箱。取儲(chǔ)備液，臨用前先用流動(dòng)相即0.1%甲酸水溶液：0.1%甲酸乙腈溶液=15∶85溶液稀釋出標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液STA-STG。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為5000-400 ng·mL-1，最低定量限為400 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液具體配置見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制表

1.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

用甲醇配制燈盞乙素質(zhì)控儲(chǔ)備液（200 μg·mL-1）并用50%甲醇水溶液稀釋出質(zhì)控工作液HQC、MQC、LQC（含燈盞乙素4000、2000、400 ng·mL-1）。取這3個(gè)濃度水平的質(zhì)控基質(zhì)樣本，經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣。共測(cè)定3個(gè)分析批，每批每個(gè)濃度各測(cè)定6次，計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。批內(nèi)精密度CV 0.91%-1.59%，批間精密度CV 3.70%-7.58%，準(zhǔn)確度為98.03%-99.87%。

1.3.3 預(yù)處理回收率

取HQC、LQC質(zhì)控基質(zhì)樣品各3份，經(jīng)預(yù)處理揮干后復(fù)溶進(jìn)樣。另取空白HBSS基質(zhì)經(jīng)預(yù)處理后揮干，加入標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶，配制成同理論濃度的樣品直接進(jìn)樣，比較兩組樣品的峰面積，計(jì)算預(yù)處理回收率。燈盞乙素的預(yù)處理回收率為97.3-99.5%，內(nèi)標(biāo)的預(yù)處理回收率為98.7%。

1.3.4 特異性與基質(zhì)效應(yīng)

取6個(gè)不同來源未混合的空白HBSS基質(zhì)，經(jīng)預(yù)處理后分別進(jìn)樣檢測(cè)，考察空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的出峰干擾情況，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)干擾。燈盞乙素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為1.5 min，空白基質(zhì)圖見圖4，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜見圖5，實(shí)測(cè)樣本圖見圖6。

圖4 空白基質(zhì)圖譜（Blank HBSS）

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜（SD sample）

圖6 實(shí)測(cè)樣本圖譜（Unknown sample）

將6個(gè)不同來源的空白HBSS基質(zhì)經(jīng)預(yù)處理后揮干，加入標(biāo)準(zhǔn)工作液復(fù)溶分別配制HQC、LQC兩個(gè)濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)考察樣本，進(jìn)樣。另配制同理論濃度的純?nèi)芤簶颖荆M(jìn)樣。比較兩組樣品的峰面積，考察基質(zhì)效應(yīng)。每個(gè)濃度平行測(cè)定3份，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的基質(zhì)效應(yīng)因子，結(jié)果各基質(zhì)的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子分別為0.989-1.003，符合要求。

1.3.5 穩(wěn)定性

分別考察了儲(chǔ)備液和工作液于-30℃保存31天的穩(wěn)定性（偏差為（-0.60%）-（-0.84%））、儲(chǔ)備液和工作液于室溫保存24 h的穩(wěn)定性（偏差為（-3.30%）-（-0.57%））、基質(zhì)樣本室溫保存22 h穩(wěn)定性（偏差為（-1.83%）-（3.53%））、基質(zhì)樣本在-30℃冰箱冷凍保存60天的穩(wěn)定性（偏差為（-0.75%）-（-4.05%））、基質(zhì)樣本反復(fù)凍融5次的穩(wěn)定性（偏差為（-1.37%）-（5.33%））、處理后的樣本重復(fù)進(jìn)樣穩(wěn)定性（偏差為（1.21%）-（2.34%））和在進(jìn)樣室（11℃）保存24 h的穩(wěn)定性（偏差為（-0.96%）（4.27%）），其結(jié)果均符合要求。

1.3.6 其他

我們還考察了儀器的進(jìn)樣攜帶污染率（Carryover）、樣本稀釋的可靠性（稀釋系數(shù)5、10）等，其結(jié)果均符合2015版《中國藥典》中《9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》。所有樣本的采集、處理、保存和檢測(cè)過程均控制在方法學(xué)驗(yàn)證有效的時(shí)效范圍內(nèi)。

2 大鼠原代視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1 實(shí)驗(yàn)所需材料

2.1.1 主要儀器

TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司），AE31型生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司），MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)株式會(huì)），F(xiàn)B124電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），DSX-280B型手提式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械），另外需要尼龍篩網(wǎng)200目（Corning），15 mL離心管及50 mL離心管，Transwell（24孔8 μm及0.4 μm），一次性針頭過濾器PES進(jìn)口（33 mm，0.22 μm），眼科手術(shù)剪，眼科手術(shù)鑷，加樣槍及槍頭、培養(yǎng)瓶、碘伏、棉簽等若干。

2.1.2 主要試劑

Gibco公司生產(chǎn)胎牛血清，DMEM/F12，HBSS緩沖液，Sigma公司的II型膠原酶，纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N），Hyclone的胰蛋白酶（含EdTA），青鏈霉素（雙抗），Solarbio的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS），ScienCell的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM），成都埃法生物科技有限公司的燈盞乙素及冰片，北京凱瑞基生物科技有限公司的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

先將培養(yǎng)瓶進(jìn)行FN包被，包被需在正式取材實(shí)驗(yàn)前24 h。取纖維粘連蛋白，規(guī)格1010 μg·mL-1。解凍后取0.25 mL原液，加入9.75 mL的PBS液，得濃度25 μg·mL-1的FN共計(jì)10 mL，一次性濾器過濾后，用移液槍分別裝入2個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶5 mL纖維粘連蛋白混合液包被。室溫狀態(tài)下靜置45 min后，吸出上清液。再將培養(yǎng)瓶密封好后置入2-8℃冰箱冷藏。

取SD大鼠6只，體質(zhì)量250-280 g，來源于（成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房），10%水合氯醛麻醉處死后，碘伏棉簽消毒眼周和眼球。摘除眼球，浸泡于75%的酒精中10 min，后拿出浸泡于含有4%雙抗的PBS液中，反復(fù)沖洗3次。沿角鞏膜緣剪開，去除眼前段組織，分離視網(wǎng)膜、玻璃體。視網(wǎng)膜置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入0.1% Ⅱ型膠原酶消化，37℃下消化20 min，加入終止液（含20%胎牛血清的ECM）終止消化。予以200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，按1000 r·min-1，7 min條件下離心。后取出去除上清。加入ECM培養(yǎng)基（含20%胎牛血清，4%雙抗，1%的ECGS）混懸。分裝兩個(gè)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶預(yù)先已行FN包被，每瓶各細(xì)胞懸液8 mL。予以37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后首次換液進(jìn)行半量換液[8]。此后每兩天換液。

2.2.2 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代

當(dāng)細(xì)胞貼壁生長約8天左右，視生長情況予以消化傳代。消化傳代前，在37℃孵箱內(nèi)復(fù)溫所需的胰酶、培養(yǎng)基、PBS等。待原代細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代。復(fù)溫所需的胰酶、培養(yǎng)基、PBS后。棄去原有的培養(yǎng)基后，予以PBS洗滌3次，每次用PBS約2 mL。清洗后加入0.25%胰酶（含EDTA）1 mL進(jìn)行消化，消化約2 min后可見細(xì)胞脫落。消化完全時(shí)，加入3 mL培養(yǎng)基終止消化。予以離心機(jī)1000 r·min-1，離心5 min，去上清。加入完全培養(yǎng)基約5 mL吹打混勻，按每毫升5×104接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，1∶1或者1∶2傳代，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取第四代細(xì)胞用于Transwell實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮形態(tài)觀察及細(xì)胞生長周期

P1內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)第6天可見細(xì)胞呈梭形生長，部分可見軸突（圖7）。培養(yǎng)第9天，細(xì)胞層結(jié)構(gòu)生長致密，融合度達(dá)到80%-90%（圖8）。

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞P1第6天（100×）

圖8 內(nèi)皮細(xì)胞P1第9天（100×）

圖9顯示細(xì)胞融合度較高，呈梭形生長，結(jié)構(gòu)致密。無接觸性抑制。原代細(xì)胞在生長前期剛貼壁時(shí)，其主要呈散在分布，以單層排列為主，主要以梭形，也有三角形或多角形，邊界較為清晰，后期生長較為致密，可呈簇狀，網(wǎng)狀融合分布。一般可在3-5天細(xì)胞生長融合。

圖9 內(nèi)皮細(xì)胞P3（100×）

3 Transwell實(shí)驗(yàn)

3.1 建立視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障模型

取內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS 2 mL吹打沖洗。吸出PBS后加入1 mL胰酶，消化細(xì)胞約5 min，加入終止液約3 mL，終止消化，后移入離心管離心，1000 r·min-1，5 min，棄上清，加入約5 mL培養(yǎng)基，重懸。密度約為每毫升5×105。取Transwell（24孔板，0.4 μm），于下室加入600 μL培養(yǎng)基。上室加入約200 μL細(xì)胞懸液接種。隔日換液，待細(xì)胞貼壁后，每天換液。換液時(shí)，先吸出上室液體，再吸出下室液體，然后先加下室培養(yǎng)基600 μL，再加上室培養(yǎng)基200 μL。

3.2 結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞屏障致密度

培養(yǎng)21天，兩個(gè)模型各隨機(jī)取出5個(gè)小室，用復(fù)溫后的PBS清洗3次，無水乙醇室溫下固定30 min，后再用PBS清洗兩次。加入0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，染色可見單細(xì)胞層結(jié)構(gòu)模型形成。

染色結(jié)果示視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及細(xì)胞間連接呈紫色均染，且各組細(xì)胞致密度較高，無顯著差異。

3.3 冰片及燈盞乙素的藥物溶液配制

將所需HBSS、PBS等溶液復(fù)溫。精密稱取燈盞乙素5000 μg，加入50 mL的HBSS溶液，渦旋混勻后得100 μg·mL-1的燈盞乙素溶液。精密稱取冰片9600 μg，加入20 μL的DMSO，得濃度480 μg·mL-1的冰片藥物母液。再取4 μL含冰片的DMSO母液，加入4 mL含有100 μg·mL-1燈盞乙素的HBSS溶液，充分渦旋后，再用一次性濾器過濾。得含有冰片濃度為480 μg·mL-1，含有燈盞乙素濃度為100 μg·mL-1，DMSO濃度為1/1000的HBSS藥物溶液。然后按照不同比例配制含有冰片240 μg·mL-1、120 μg·mL-1、60 μg·mL-1的HBSS溶液。保證其每種濃度下燈盞乙素濃度為100 μg·mL-1，且DMSO濃度小于1/1000，僅僅存在冰片含量的差異性。

3.4 給藥取樣

取Transwell模型，吸凈其上下室培養(yǎng)液，HBSS清洗3次，洗滌細(xì)胞單層中可能殘留的培養(yǎng)基及附著物。隨機(jī)編號(hào)為A-E。按下列方法處理各個(gè)樣本（如表8）：A孔為陰性對(duì)照，上室給含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。B孔上室給含有冰片濃度為60 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。C孔上室給含有冰片濃度為120 μg·mL-1，含有燈 盞 乙 素100 μg·mL-1的HBSS溶 液200 μL，下 室給600 μL的純HBSS。D孔上室給含有冰片濃度為240 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μl的純HBSS。E孔上室給含有冰片濃度為480 μg·mL-1，含有燈盞乙素100 μg·mL-1的HBSS溶液200 μL，下室給600 μL的純HBSS。給藥后置于以37℃，5% CO2的孵箱之中。于2 h取下室液體凍存管封存。上室液體全部吸出，凍存管封存于-80℃冰箱保存。

3.5 UPLC-MS/MS檢測(cè)HBSS中燈盞乙素含量

按照第1部分建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

3.6 結(jié)果

冰片對(duì)燈盞細(xì)辛透視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的影響：與陰性對(duì)照比較，加入冰片2 h后，燈盞乙素透視網(wǎng)膜血管周內(nèi)皮細(xì)胞屏障到達(dá)Transwell下室的濃度升高，提示冰片具備促燈盞乙素透視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的作用，其效應(yīng)隨冰片濃度加大而增強(qiáng)（圖10）。

圖10 內(nèi)皮細(xì)胞屏障模型中燈盞乙素含量柱狀圖及冰片與其比值

4 小結(jié)與展望

冰片具備促進(jìn)燈盞乙素透體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障模型的作用，在本實(shí)驗(yàn)中上室的冰片藥物濃度達(dá)到480 μg·mL-1時(shí)，燈盞乙素透過體外血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障模型達(dá)到最大藥物濃度。冰片外觀為一種無色或白色半透明的結(jié)晶體。其理化性質(zhì)中不溶于水。溶于乙醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、甲醇，極微能溶于水。極易升華，具有類似樟腦的氣味。冰片的通透作用，除了外用促透皮作用外，既往在研究血腦屏障時(shí)對(duì)其研究較多，主要表現(xiàn)在對(duì)血腦屏障的開放作用[9]，主要表現(xiàn)在通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，影響P-糖蛋白（P-gp）功能，以及通過影響P-gp功能，達(dá)到開放血腦屏障作用。同時(shí)對(duì)缺氧模型有保護(hù)性作用。此外也有研究顯示冰片對(duì)血腦屏障有雙向調(diào)節(jié)保護(hù)作用[10]。其主要包括通過抑制NF-κB下調(diào)P-gp，或以促進(jìn)血腦屏障胞飲作用方式；此外也可通過抑制IL-1β，MMP-9表達(dá)和影響Ca2+-eNOS-NO，VEGF-eNOS-NO等通路方式。在其促透作用方面效果比較確切。對(duì)于冰片開放血視網(wǎng)膜屏障，其原理與緊密結(jié)構(gòu)相關(guān)，這種緊密連接與蛋白質(zhì)元素組成的復(fù)合物相關(guān)，正因?yàn)榫o密連接的相關(guān)蛋白質(zhì)彼此相互作用，保持了緊密連接的完整性。如果這些蛋白質(zhì)被破壞，它們將直接影響緊密連接的完整性，從而改變屏障的滲透性。在其促進(jìn)血視網(wǎng)膜屏障的通透性的機(jī)制，可能與減少緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1表達(dá)有關(guān)，證實(shí)了冰片作為促透劑，能夠開放大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，增加血視網(wǎng)膜屏障的通透性[11]。在使用安全性方面，有研究顯示天然冰片與合成冰片對(duì)兔眼及角膜均不產(chǎn)生刺激性，長期應(yīng)用亦無毒性傷害，有望作為引經(jīng)促透劑廣泛用于滴眼液配方[12]。

燈盞乙素具有清除氧自由基，提高抗氧化酶活性，減少氧化物產(chǎn)生的作用[13]，同時(shí)還能抑制細(xì)胞焦亡[14]的作用。在既往研究中發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)部分阻塞血管的再通，達(dá)到再灌注效應(yīng)[15]。此外也有研究顯示燈盞乙素能促進(jìn)視網(wǎng)膜內(nèi)血流速度，這對(duì)于缺血缺氧內(nèi)循環(huán)的改善有極大幫助[16]。在對(duì)于DR中研究顯示燈盞花素可能存在降低VEGF的表達(dá)作用，從而達(dá)到減少血管的新生。這證明無論是青光眼還是糖尿病視網(wǎng)膜病變，燈盞乙素改善血流，對(duì)眼底血管的保護(hù)性作用巨大。但燈盞乙素存在生物利用度低、半衰期短、穩(wěn)定性差等問題[17]。在冰片的促透作用下，提高眼內(nèi)燈盞乙素的藥物含量，發(fā)揮其保護(hù)性作用、保護(hù)視神經(jīng)、提高對(duì)視功能，具有重大意義。在實(shí)驗(yàn)過程中，如果具備更好實(shí)驗(yàn)條件，可將觀察時(shí)間延長，進(jìn)一步觀察。甚至采用氣相色譜對(duì)冰片進(jìn)行濃度測(cè)量。如果具備更好的培養(yǎng)基，可否將兩種細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，建立混合模型，進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。如果繼續(xù)將冰片含量繼續(xù)提高，促透作用是否會(huì)繼續(xù)加強(qiáng)。這些均有待于我們進(jìn)一步研究。