穴位敏化動態過程的科學基礎*

付紅娟，齊文川，唐 勇，任彥蓉，劉雪瑩，鄭倩華，梁繁榮**

（1.成都中醫藥大學針灸推拿學院 成都 610075；2.成都中醫藥大學附屬醫院針灸學校針灸推拿教研室 成都 610000）

穴位理論出自《黃帝內經》，是針灸學的重要組成部分。穴位在“分肉之間”、“骨空之中”，是經氣聚會之所，為“脈氣所發”，是疾病的反應點，可“知五臟之害”，又是針灸的施術部位，能“主治所及”，與臟腑功能密切相關。受《靈樞·經筋》“以痛為輸”和《靈樞·背腧》“欲得而驗之，按其處，應在中而痛解，乃其腧也”的啟發，研究者們逐漸發現穴位是“活”的[1]。一是穴位功能是“活”的，“以痛為輸”和“按之痛”表明穴位在正常生理情況下和異常病理狀態下具有不同的功能表現。二是穴位大小是“活”的，疾病狀態下內臟-體表匯聚神經元受到易化/敏化后，特定區域會出現體表感受野的擴大。即機體異常病變時，相應的體表特定區域發生痛覺異常等敏化現象，穴位的定位就是這些出現敏化現象部位的規律的總結。隨著疾病的痊愈，敏化現象逐漸減弱甚至消失。說明穴位是從正常生理狀態的“靜息”態到異常病理狀態下的“激活”態，是穴位反應疾病的基礎。由此，學者們提出腧穴的本質是一種敏化態[2-3]。

穴位敏化是小刺激引起大效應的作用載體，是提高臨床療效的重要支點[2]。穴位敏化形式主要有電敏化、光敏化、熱敏化、微循環敏化、痛敏化、聲敏化等[4]。熱敏和痛敏是穴位敏化最常見的兩種表現形式，其中，熱敏灸已發展成為一個成熟、有效、安全的中醫特色外治技術，并在全國重點推廣應用于臨床。其特點是“小刺激大反應”，廣泛應用于治療20多種疾病，開創了一條治療疾病的內源性熱敏調控新途徑[5]。最新研究認為，從肌筋膜激痛點活化狀態的特征來看，它就是軟組織病變部位敏化狀態的“阿是”穴，是穴位痛敏化的一種形式，也是針灸對該病發揮最佳治療效應的部位[6]。隨機對照研究表明，針刺或熱灸敏化穴治療冠心病[7]、慢性頸痛[8]、壓瘡[9]以及膝骨關節炎[10]有良好的臨床療效。因此，繼20世紀80年代經絡研究“沉寂”后，“穴位敏化”成為這一針灸研究領域備受重視研究命題，對揭示針灸作用的科學原理具有重要意義。2015年國家自然科學基金重大項目“穴位的敏化研究”正式啟動，隨著項目課題的深入開展，目前已經積累了豐富的科學資料，這些資料對于構建當代知識背景下的現代針灸知識體系具有重要的學術價值。

基礎研究表明，疾病狀態下，相關的敏化穴位局部呈現出神經肽-肥大細胞-致敏物質釋放的病理反應，并激活不同水平的中樞神經結構發生敏化[2]。然而，穴位敏化形成過程中，傳遞傷害性刺激信號的結構，神經肽-肥大細胞-致敏物質釋放的先后順序以及三者之間的相互作用關系，參與穴位敏化過程的中樞結構，以及是否存在非神經源性炎性物質介導穴位敏化的形成等問題尚不清楚。本研究總結了穴位敏化研究開展以來的研究成果，以期為未來穴位敏化的相關研究提供思路和借鑒。

1 穴位敏化是一個動態過程，分析參與穴位敏化的基礎物質具有重要意義

機體在病理過程中通過神經源性牽涉反應誘發穴位產生感覺異變，反應了穴位的狀態和功能強弱會隨著機體的動態變化而改變，具有診斷及治療內臟病變的雙重作用，在生物學上具有重要意義。經過多年的動物實驗研究和多中心、大樣本臨床研究，朱兵團隊最新定義了穴位敏化的概念——指機體在病理狀態下發生以神經源性炎性反應為主要特征、以“穴區敏化池”中的炎性介質為內源性調控啟動因子的生物學程序[2,11]。穴位敏化的演變過程是動態的，此過程中涉及多種物質和機制，更是與“神經源性”、“炎性反應”、“神經系統”和“穴位局部”密切相關。了解參與穴位敏化發生的局部炎性物質和神經結構對于全面認識穴位的功能具有重要的意義。

2 外周微理化環境的改變介導穴位敏化的發生

2.1 C類傷害性感受器是傳遞信息和觸發體表敏化區域炎性反應的關鍵神經元

眾所周知，痛覺過敏是穴位敏化的最常表現形式。疼痛通常始于軀體或內臟結構中稱為傷害性感受器的感覺受體的激活，傷害性感受器是位于皮膚、肌肉、關節和內臟的感覺終末器官，這些感受器會選擇性地對有害或潛在的組織損傷刺激做出反應，并將傷害性（疼痛）信息傳遞給中樞神經系統。傷害性感受器被細分為無髓鞘C纖維和有髓A纖維傷害性感受器，其重要特征之一是它們具有敏感性（即它們的興奮性可以增加）[12]。最近，Prato等[13]發現了一種C類沉默型傷害性感受器，它們在正常條件下對有害機械刺激不敏感，但在暴露于炎癥介質神經生長因子中時會變得對此類刺激敏感。也就是說，這種C類沉默型傷害性感受器在疾病時能夠被炎性物質“喚醒”，與穴位的敏化特性十分相近[14]。在一項觀察傳入神經末梢的分布與大鼠后肢中穴位相關性的研究中發現，無論是A類神經元還是C類神經元，神經感受野的分布都與穴位密切相關，并由此提出穴位可能是具有高密度神經末梢的可興奮肌肉/皮膚-神經復合體[15]。最新研究中，馬永圓[16]、Zhang等[17]通過逆向示蹤和離體膜片鉗方法記錄支配犢鼻穴（ST35）的背根神經節（Dorsal root ganglion，DRG）中C類和Aδ神經元的動作電位，觀察到在膝骨性關節炎（Knee osteoarthritis，KOA）后期大鼠ST35發生敏化后，雙側L5節段DRG中支配ST35穴位的C型神經元的興奮性和產生的超極化電流（Hyperpolarization-activated current，Ih）密度增加，而對Aδ類神經元的活動無顯著影響。同時，L5節段DRG中的環核苷酸門控陽離子通道亞型2（Hyperpolarization activated cyclic-nucleotide gated channel subtype 2，HCN2）蛋白表達水平升高，HCN2的上調主要來自C型神經元，運用ZD7288阻斷HCN2通道后，ST35敏化受到抑制。由此，作者認為C型神經元的興奮性增加和Ih/HCN2通道的上調是穴位敏化的形成機制。此外，最新研究發現，KOA大鼠敏化穴ST35局部瞬時感受器電位香草酸受體1（Transient receptor potential vanilloid，TRPV1）mRNA和DRG中p-TRPV1蛋白含量明顯高于空白組大鼠，認為組織損傷時，炎癥因子刺激激活TRPV1，引起Ca2+等陽離子內流，從而興奮神經元，促進如SP、CGRP等神經肽的釋放。SP、CGRP作用于肥大細胞，引起肥大細胞脫顆粒并釋放5-HT、HA等致痛物質，形成“穴位敏化池”，導致穴位敏化[18]。因此，C類傷害性感受器是穴位敏化觸發形成中的第一個關鍵物質。

2.2 SP和CGRP是調控外周神經致敏和肥大細胞脫顆粒的重要神經肽

如前所述，C類神經纖維與神經源性炎癥反應介導的穴位敏化密切相關，C類沉默型傷害性感受器在接受沖動后從纖維末梢釋放神經肽，包括SP物質和降鈣素基因相關肽（CGRP）[19]。早在1978年，H?germark等[20]已經發現SP是人體皮膚中一種作用于肥大細胞的有效組胺釋放劑。隨后的研究也表明，神經-肥大細胞在沒有中間轉導細胞的情況下也會發生交互作用，而神經肽物質如SP就是這種交流的重要介質[21]。因此，SP和CGRP在神經-肥大細胞的觸發機制和交互作用中發揮的作用成為穴位敏化研究中的重要關注點。研究者發現急性胃黏膜損傷大鼠的“脾俞穴”和“胃俞穴”發生敏化，敏化穴位皮膚局部SP陽性纖維和蛋白高表達，同時伴有肥大細胞聚集和脫顆粒明顯增多[22]。同樣地，哮喘模型組大鼠的肺俞穴、定喘穴和華蓋穴發生敏化現象，敏化穴位局部SP陽性目標平均光密度和MCs數目及其脫顆粒率顯著增加[23]。在急性腸粘膜損傷模型大鼠和心肌缺血模型大鼠的敏化區皮膚中發現肥大細胞聚集的同時伴有CGRP的分布及蛋白表達量明顯增加[24-25]。因此，神經肽SP和CGRP釋放引起的肥大細胞脫顆粒改變的生物學過程是穴位敏化的生物學基礎。但神經肽釋放與肥大細胞脫顆粒之間的先后順序以及神經肽物質刺激肥大細胞改變的機制和物質基礎仍需進一步探索。

2.3 肥大細胞是導致敏化局部神經源性炎癥反應的激發器，組胺、5-HT和類胰蛋白酶是構成局部“炎性湯”分子池的主要活性物質

肥大細胞（Mast cells，MCs）是參與外周神經源性炎性反應的主要炎性細胞，20世紀70年代，肥大細胞被發現與經絡循經感傳密切相關[26]。此后，肥大細胞在腧穴的研究中備受關注。石宏等[22]采用空腹稀鹽酸灌胃造成急性胃黏膜損傷模型，發現模型大鼠“脾俞穴”和“胃俞穴”發生敏化，穴區局部肥大細胞出現聚集現象，其數量和脫顆粒率明顯高于對照組以及穴區旁開組織。王巧俠等[27]發現KOA模型大鼠的鶴頂穴在造模7天時發生敏化，穴區皮膚和皮下組織中MCs數量和脫顆粒率高于對照組，且隨疾病程度加重呈遞增增長。秦萍萍等[28]運用軟X線納米CT成像在透射電鏡觀察到膝骨關節炎模型大鼠在造模14天和21天時陽陵泉穴呈現特征性的MCs脫顆粒改變：顆粒融合，胞外可見已脫出的顆粒或正在脫出的顆粒，胞內伴隨顆粒密度降低，并出現遺留的空泡。研究者們用多種方法均發現穴位敏化局部的肥大細胞脫顆粒現象，由此認為肥大細胞在穴位跟隨機體狀態的動態變化過程中發揮著重要作用，肥大細胞可能是穴位敏化的細胞學基礎和客觀指標之一[29]。

在神經源性免疫炎癥反應中，致敏的周圍神經末梢釋放血管活性肽、促炎性神經肽P物質（Substance P，SP）和降鈣素相關基因肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP），導致血管擴張、血漿外滲、白細胞浸潤和肥大細胞活化[30]。肥大細胞激活后釋放神經肽、組胺和其他致痛介質，刺激神經末梢釋放更多神經肽，導致肥大細胞激活和外周神經致敏的惡性循環，進一步放大血管滲漏和神經源性炎癥[31]。同時，釋放的類胰蛋白酶、5-HT和組胺等物質對血管滲透性和白細胞遷移、粘附和運輸具有直接影響，都參與了疼痛的外周機制。組胺通過其多種受體（H1R、H2R、H3R和H4R）在外周和中樞神經系統的神經源性炎癥和疼痛傳遞中起關鍵作用，且組胺以雙向方式與神經肽SP和CGRP相互作用[32]。類胰蛋白酶是肥大細胞顆粒的主要蛋白質，與神經末梢上的蛋白酶活性受體-2（Proteinase-activated receptor-2，PAR-2）相互作用[32]，PAR-2可以激活TRPV1通道，刺激神經末梢釋放神經肽SP和CGRP[33]。Ding等[34]以KOA大鼠為研究對象，在造模第14天時采用甲苯胺藍和免疫熒光染色觀察陽陵泉、鶴頂和委中穴位局部MCs的聚集、脫顆粒及MCs共表達介質類胰蛋白酶、5-HT和組胺的釋放情況。結果顯示KOA大鼠陽陵泉和鶴頂穴發生敏化，穴位局部MCs數量和脫顆粒明顯升高，且與疾病嚴重程度正相關。敏化穴位局部胰蛋白酶、5-HT和組胺呈陽性表達。同樣，He等[35]研究結果表明胃粘膜損傷模型大鼠敏化穴位局部皮膚過敏物質和傷害性神經肽SP、CGRP、HA、5-HT和類胰蛋白酶高表達可能是穴位致敏的潛在機制。綜上所述，病理狀態下，C類神經元向外周傳遞傷害性信息促使神經肽物質SP和CGRP釋放，誘導肥大細胞脫顆粒釋放炎性活性物質HA、5-HT和類胰蛋白酶和神經肽等致痛物質，此類物質以雙向方式進一步刺激神經末梢釋放更多神經肽，導致肥大細胞脫顆粒和炎性物質釋放的惡性循環，最終形成“炎性湯”的分子池，導致穴位發生敏化。

3 脊髓背角、延髓背柱核、延髓背側網狀亞核、腦干迷走神經運動背核和丘腦腹后外側核等中樞神經系統參與穴位敏化的動態過程

1983年，Woolf[36]首次指出伴隨外周組織損傷或炎癥的疼痛超敏反應的許多特征是中樞神經系統感覺信號增強的直接結果，即中樞敏化現象。這種中樞敏化表現為閾值降低，對有害刺激的反應性增加和后遺效應延長（痛覺過敏），以及感受野擴大，使來自非損傷組織的輸入產生疼痛（繼發性痛覺過敏）[37]。穴位敏化最常表現為痛閾值降低，類似于內臟疾病的牽涉痛反應。如前所述，C類神經元與穴位敏化現象密切相關。研究者使用視覺引導的膜片鉗技術在保留軀體和內臟神經的胸椎脊髓中記錄脊髓I層神經元，發現體細胞和內臟C纖維單突觸會聚到脊髓I層神經元上[38]。中樞敏化是否在穴位敏化中扮演角色引發了針灸學研究者們的關注。

朱兵團隊率先采用電生理學方法，分別從脊髓背角、延髓和丘腦探討敏化穴區的量-效關系及其相關的中樞機制[39-41]。該團隊以結直腸擴張（Colorectal distension，CRD）作為內臟傷害性刺激觀察是否發生穴位敏化效應。同時，分別記錄“足三里-上巨虛”同側L1-L3節段脊髓背角寬動態范圍（Wide-dynamic range，WDR）神經元（又稱為會聚神經元）、延髓背柱核（Dorsal column nuclei，DCN）、延髓背側網狀亞核（Subnucleus reticularis dorsalis，SRD）和丘腦腹后外側核（Ventral posterolateral，VPL）神經元外周感受野的大小和放電情況，以及電針對CRD刺激前后神經元放電反應的影響。研究發現持續的內臟傷害性刺激可以引起穴位敏化效應，且隨著CRD刺激強度的加大，以上四個核團神經元也呈現出一定的量效敏化關系。傷害性CRD刺激還可以加強WDR、DCN、SRD和VPL神經元對來自體表同節段穴位的電針傳入產生更強烈的反應，引起穴位功能的敏化[39-41]。韓國學者Fan等[42]同樣發現穴位的數量和大小隨著內臟疼痛的嚴重程度而增加，即穴位敏化，這可能與脊髓背角WDR神經元的神經元反應增強有關。

最新研究表明，除WDR、DCN、SRD和VPL參與穴位敏化外，腦干迷走神經運動背核（Dorsal motor nucleus of vagus，DMV）在穴位敏化中的作用也引發關注[43]。研究者采用5% DSS溶液自由飲用建立結腸炎大鼠模型，發現大鼠體表敏化點主要分布于T12-S1節段，以L2和L5節段水平分布最為集中，上巨虛穴位發生敏化現象。結腸炎模型大鼠大鼠出現足底機械縮足反射閾值和熱痛潛伏期降低，伴有脊髓背角淺層和DMV中乙酰膽堿轉移酶陽性（Choline acetyl transferase，Ch AT+）神經元的激活數量多于正常組，認為脊髓背角淺層神經元和DMV中Ch AT+神經元參與了穴位敏化形成的中樞機制。

以上動物研究表明，中樞神經系統參與了內臟損傷誘導的穴位敏化過程。非內臟性損傷，如軟組織疾病誘發的穴位敏化現象是否存在中樞敏化機制？研究者通過大鼠左膝關節內注射碘乙酸單鈉建立KOA模型。根據撤足機械閾值、穴位肥大細胞總數和肥大細胞脫顆粒率檢測穴位是否致敏。KOA大鼠雙側ST35穴發生敏化現象，同時伴有L3-L5雙側脊髓背角甘氨酸轉運蛋白2（Glycine transporter 2，GlyT2）上調和細胞外甘氨酸水平的降低。選擇性抑制GlyT2可減弱ST35敏化作用。椎管內GlyT2-shRNA注射可特異性下調同側L3-L5脊髓背角GlyT2表達，阻斷雙側犢鼻穴致敏作用。由此，研究者認為脊髓背角甘氨酸轉運蛋白2表達升高是KOA大鼠ST35穴位致敏的重要介質，KOA大鼠ST35穴位敏化是由中樞敏化介導的[44]。

綜上，內臟和軟組織損傷的穴位敏化過程中，相應的中樞神經核團神經元呈現出一定的量效敏化關系，如脊髓背角、延髓背柱核、延髓背側網狀亞核、腦干迷走神經運動背核和丘腦腹后外側核。以上核團神經元的異常活動可能是穴位敏化形成的中樞機制，抑制GlyT2轉運蛋白可以阻斷穴位敏化的發生。

4 皮膚局部微生物、外泌體和遺傳物質可能參與穴位敏化的動態過程

目前，穴位敏化研究主要圍繞神經源性炎癥反應開展，集中于穴位敏化的外周和中樞機制。然而，隨著科學技術進步和多學科交叉融合的推動，研究者嘗試運用不同技術手段從不同研究角度探索穴位敏化的其他機制。

穴位是一個立體結構，其中，皮膚是發揮穴位效應的重要組成部分。由于皮膚微生態與內臟狀態間存在相關性，皮膚局部的微生態可能是反應穴位狀態和功能變化的“晴雨表”。既往研究發現細菌通過免疫或炎性信號通路造成疼痛，Chiu等[45]觀察到金黃色葡萄球菌的α-細菌成孔毒素可直接在傷害性感受器上形成通道，也可以通過細菌N-甲醛化肽在傷害感受器神經元中誘導鈣通量和動作電位，證明細菌可直接誘發疼痛。研究者認為穴位敏化中的疼痛癥狀可能與敏化穴位皮膚菌群的局部分泌相關。其課題組的研究初步發現，穴位敏化不影響細菌總體物種數量和分布，但在牽涉痛或“敏化穴位”處葡萄球菌屬豐度明顯增加[46]。因此，皮膚微生物可作為研究穴位敏化的新著力點，穴位敏化與皮膚微生態失衡的相關性有待進一步研究。

目前認為，內臟疾病狀態時的神經源性炎癥反應介導了內臟-體表牽涉痛（穴位敏化），是否存在非神經源性炎癥介質誘導穴位敏化現象需要進一步探索。外泌體是常見的膜結合納米囊泡，包含多種生物分子，如脂質、蛋白質和核酸。外泌體是由胞吐作用從細胞中衍生出來，被靶細胞攝取，可在局部或遠處細胞之間傳遞生物信號，與穴位的內臟-體表相關存在相似性。Chen等[47]發現外泌體通過介導肥大細胞和神經之間的信息交換啟動神經免疫調節過程，提出肥大細胞來源的外泌體調控針刺穴位的神經免疫調節是導致針刺療效的關鍵因素之一。蔣一璐[48]對KOA大鼠足三里皮膚進行高通量測序，結果顯示高敏組、低敏組和非敏組大鼠的足三里存在差異表達的miRNA，rno-miR-199a-3p、rno-miR-199a-5p、rnomiR-214-3p和rno-miR-205可能為KOA的“敏化miRNA”，這4條差異miRNA可能參與穴位敏化發生的調控機制。

基于以上發現，皮膚局部微生物、外泌體和遺傳物質可能參與穴位敏化的動態過程，研究其在穴位敏化現象中的生物學機制有助于科學闡釋穴位在內臟-體表相關中的作用，為針灸學發展和臨床運用提供新的科學證據。

5 穴位敏化的動態過程

總結目前研究證據，穴位敏化動態過程中的三個關鍵點分別為臟器（內臟或關節軟組織）-脊髓及脊髓上神經系統（中樞神經）-穴位（皮膚）。臟器損傷時產生傷害性信息傳遞至背根神經節細胞，分兩種途徑將信息傳遞至外周：一是將傷害性刺激信號順向傳入脊髓背角，通過中間神經元激活相鄰的另一個背根神經節，以背根反射的形式將沖動逆傳至外周；二是在內臟傳入傷害性刺激傳入背根神經節細胞后，在分支處以軸突反射的形式逆向傳出至外周。最終由C-類型傷害性感受器傳出至外周的傷害性刺激促使神經末梢釋放SP和CGRP等神經肽，進一步刺激肥大細胞聚集和脫顆粒，并釋放類胰蛋白酶、組胺和5-HT等致痛物質，形成局部“炎性湯”的分子池，導致穴位出現敏化現象[2,11,22]。穴位敏化的形成過程中，脊髓上神經系統，如延髓背柱核、延髓背側網狀亞核、腦干迷走神經運動背核和丘腦腹后外側中核神經元感受野增加，與敏化呈量效關系，抑制其中相應蛋白可以阻斷穴位致敏作用。內臟損傷導致穴位敏化現象的物質基礎如圖1所示。

圖1 參與穴位敏化形成過程的物質基礎圖

6 總結與展望

綜上，穴位是動態變化的,會隨機體功能狀態的變化而改變，其過程稱為穴位敏化。穴位敏化是感知和響應外界刺激的重要前提，是穴位功能增強的外在表象，是提高臨床療效的重要支點，有助于恢復因疾病而減弱的身體機能，可用于臨床預后和疾病監測。穴位敏化的研究是針灸學領域原創性重大科學命題，對揭示針灸作用的科學原理、理論傳承發展和進一步提高臨床療效具有重要意義。

據目前研究成果可知，穴位以神經源性炎癥反應為重要特征，外周和中樞機制介導其發生過程。參與穴位敏化形成過程的傷害性感受器[14]、皮膚微生態[46]、肥大細胞[29,34]和中樞機制[11]分別得到闡明，而穴位敏化現象的完整過程尚不清晰。此外，與穴位敏化相關的最新研究成果在該過程中扮演的角色暫未得到闡述。本研究完整總結了穴位敏化動態過程中的刺激器（傷害性信號、神經肽及炎癥物質）、傳遞者（C類傷害性感受器、肥大細胞）以及反應者（中樞結構及相關受體）。本文首次將最新發現的觸發體表敏化區域炎性反應的關鍵神經元（C類傷害性感受器），DMV中Ch AT+神經元和脊髓背角中的GlyT2納入穴位敏化形成的動態過程中，并以機制圖的形式更加清晰的展示參與穴位敏化形成過程的物質基礎。

回顧近十年研究成果，仍有許多關于穴位敏化的科學問題暫無答案。比如，肥大細胞是介導穴位敏化發生的關鍵細胞，目前研究僅聚焦于穴位或敏化點局部皮膚中肥大細胞在穴位敏化中的作用。然而，肥大細胞在全身分布廣泛，目前已經發現中樞神經系統中的肥大細胞與多種疾病相關。那么，中樞系統中肥大細胞是否參與穴位敏化過程尚未可知。其次，有學者指出，穴位敏化的基礎是局部肥大細胞聚集和脫顆粒，具有一定的“擬針灸”效應。在既往研究中，一些皮膚和神經病理疼痛疾病程度與肥大細胞激活呈正相關，不少研究提出以抑制肥大細胞激活為治療靶點。以上兩個觀點貌似存在矛盾，兩種反應是否啟動不同的機制通路，或者發揮兩種不同效應是否具備一定的轉折點或平衡點也不清楚。最后，目前研究著力于穴位敏化的神經源性炎癥反應的外周和中樞的神經機制研究。已經發現，肥大細胞可以通過外泌體與組織、器官之間進行信息交流，也有研究發現敏化穴位局部攜帶的RNA信息之間存在差異，是否存在不通過神經傳遞作用的其他信號通路介導穴位敏化的動態過程尚需進一步探索。未來的研究如能解答以上問題，相信穴位敏化動態過程的科學基礎將更加清晰，也可為穴位敏化在臨床診治中發揮作用提供更多新的靶點，從而豐富穴位研究和臨床應用的科學研究證據。