推拿對神經病理性疼痛大鼠miR-21-5P、ERK、STAT3的影響*

吳娉婷，肖 易，梁英業，謝柳紅，丁 瑤，盧棟明，陳曉紅，唐宏亮

（1.廣西中醫藥大學 南寧 530000；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院 南寧 530000；3.廣西中醫藥大學附屬防城港醫院 防城港 538000）

神經病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是由軀體感官神經系統的病變或疾病引起的疼痛，流行病學研究的系統回顧報道神經病理性疼痛的患病率為6.9-10%[1]。由于NPP擁有極其復雜的的病理生理學，NPP也被認為是目前神經原性疼痛綜合征臨床治療的主要挑戰[2]。盡管國內外在NPP的發病機制和治療方面已經取得了巨大的進展，但目前治療這一疾病的方法包括藥物干預（三環類抗抑郁藥、曲馬多以及低劑量的阿片類藥物等）、物理療法和脊髓刺激等，其中藥物干預容易誘導強迫性濫用，而物理療法和脊髓刺激的效果有限且適用性不廣。因此深入探索疼痛的發病機制，尋找疼痛治療靶點，對提高疼痛治療效果有著深遠的意義。

MicroRNAs[3]越來越被認為是免疫和神經元基因表達的調節因子，是NPP病理生理學的潛在主開關。且越來越多的證據強調，神經病理性疼痛的誘導和維持伴隨著MicroRNAs表達的變化，而這些MicroRNAs表達的變化似乎與神經損傷、痛覺過敏和神經可塑性相關[4]。最近的研究表明[5]miR-21在神經病理性疼痛晚期損傷的背根神經節（Dorsal root ganglia，DRG）神經元增加，而阻斷miR-21可以緩解神經病理性疼痛。與此同時研究顯示[6]miR-21-5P在DRG神經元中高表達，而鞘內注射miR-21-5P拮抗劑可以降低神經病理性疼痛的超敏反應和炎癥巨噬細胞在DRG中的募集程度。但miR-21-5P在脊髓背角的表達尚不明確。本團隊的前期研究已經反復印證了推拿的鎮痛作用[7-8]，也從神經傳遞角度闡明了推拿的鎮痛機制[9-10]。但其機制尚未完全闡述清楚，還有待進一步研究。因此本實驗從微小RNA角度出發闡明神經病理性疼痛在脊髓背角當中的發病機制以及推拿的鎮痛機制，為完善推拿治療NPP的效應研究提供研究依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

40只健康雄性SD大鼠，SPF級，體重210-240 g，月齡為6周。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養在廣西中醫藥防治醫學分子生物實驗室動物房中，濕度恒定，室溫18-20℃，按時更換墊料以及給予飼料、飲水，適應性喂養7天。本實驗研究過程符合廣西中醫藥大學第一附屬醫院動物使用及倫理委員會審查。

1.2 主要試劑及儀器

microRNA反轉錄試劑盒（TaKaRa），TB Green PCR熒光試劑（TaKaRa），抗STAT3抗體（PTG），抗ERK抗體（PTG），蛋白定量試劑盒（BCA法）（碧云天），IL-1β ELISA試劑盒（賽默飛），Thermo Scientific Piko Real 96 PCR儀（賽默飛公司，美國），Bio-Rad Powerpac HC電泳儀及ChemiDoc MP Touch Hot圖像掃描儀（Bio-Rad公司，美國），電子von Frey 2393及熱板痛覺測試儀（IITC公司，美國），酶標儀（Thermo，美國）。

2 方法

2.1 動物分組

將40只SD雄性大鼠隨機分為5組：正常組（n=8）、假手術組（n=8）、模型組（n=8），假推拿組（n=8）、推拿組（n=8）。

2.2 造模方法

參照課題組前期研究[11]，模型組、推拿組和假推拿組建立大鼠L5脊神經結扎（SNL）模型。按照3 mL·kg-1的大鼠體重配置10%的水合氯醛進行腹腔麻醉后，定位每只大鼠的左側后上棘，剃除該部位及周邊的毛發備皮。常規消毒后于后上棘左側與脊柱垂直切開，約2 cm長，與脊柱平行。分離左側棘旁的筋膜和肌肉后，顯露脊柱。用小咬鉗去除L5橫突，暴露L5脊神經，用5-0可吸收縫線將神經結扎，僅單側結扎。假手術組僅暴露L5脊神經2-3 min，不結扎。最后用生理鹽水清洗手術創口，并給予碘伏消毒，逐層關閉傷口。縫合傷口后將大鼠放入籠中觀察，直至麻醉恢復，以免窒息導致死亡。造模成功的標準為術后大鼠患側出現跛行、撤足、抬足。

2.3 干預方法

推拿組選擇足少陽膽經上的“環跳”、“陽陵泉”和“懸鐘”三個穴進行干預。干預時用布袋將大鼠束縛防止掙扎，然后使用按摩推拿手法模擬儀（中國人民共和國發明專利號：ZL 200710187403.1）從造模后第1天開始進行推拿治療。按摩推拿手法模擬儀按摩頭選用直徑10 mm的圓形光滑接觸面，刺激力量為4 N，手法模擬點法、揉法和撥法。每天1次，每次每穴每法1 min，每側共9 min，每次治療18 min（雙側），連續干預7天；假推拿組的大鼠同樣用布袋束縛防止掙扎，每天給予雙后肢18 min的輕輕撫摸，連續干預7天。正常組、模型組以及假手術組只觀察7天，不做任何干預處理。

2.4 觀察指標

2.4.1 大鼠患側機械痛閾值（PWMT）的測定

將大鼠提前放入鐵籠中適應環境，當大鼠停止自我梳理和探索活動時選用4 g、6 g、8 g、10 g、15 g、26 g、60 g、100 g的von-Frey纖維絲依次從鐵籠底部伸進去刺激大鼠的患側足，當大鼠出現抬足或舔趾等陽性反應行為時，記錄所對應的纖維絲的刺激強度。連續測3次，每次測量間隔15 s，取平均值即為機械痛閾值。于術前第1天及術后第3、7天進行PWMT測量。

2.4.2 大鼠患側熱痛閾值(PWTL)的測定

按Hargreaves[12]法測定。當測試儀達到預設溫度52.5℃時，將大鼠按組別依次放進測試儀的有機玻璃動物籠內，等大鼠停止自我梳理和探索活動時按下計時器，當大鼠患側足出現舔足、回縮或跳躍時測試儀上顯示的時間即為大鼠熱痛閾值（PWTL）。在沒有反應的情況下，在30 s時將大鼠從熱板上取出，以避免組織損傷。每只大鼠測量3次，每次測量時間隔5 min，取平均值作為熱痛閾值。于術前第1天及術后第3、7天進行PWTL測量。

2.4.3 蛋白免疫印跡

使用蛋白免疫印跡法檢測干預7天后的大鼠脊髓（L4-6）中ERK、STAT3的蛋白相對表達量。按照每100 mg組織加入1 mL蛋白裂解液的方法取L4-6段脊髓放入蛋白裂解液中進行低溫勻漿，4℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清液。各樣本蛋白濃度使用BCA蛋白濃度試劑盒測定。用SDS-PAGE分離蛋白，轉膜。5%脫脂奶粉封膜1 h，加入稀釋后的抗體（STAT3一抗，1∶1000；ERK一抗，1∶1000），放置4℃冰箱孵育過夜。清洗后孵育二抗（1∶5000）1 h。滴加ECL溶液，使用Bio-Rad ChemiDoc MP Touch Hot圖像掃描儀采集圖像。使用Image J軟件分析圖像結果。

2.4.4 酶聯免疫吸附

使用酶聯免疫吸附法檢測干預7天后的大鼠血清中IL-1β含量，所有操作步驟按照試劑盒的操作說明進行。終止反應后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

2.4.5 熒光定量PCR

使用熒光定量PCR法檢測干預7天后的大鼠脊髓（L4-6）中miR-21-5P mRNA表達。用Trizol試劑提取總RNA，然后按照PCR產品試劑盒的操作說明進行實驗。miR-21-5P、β-actin基因序列引物由TaKaRa公司提供，引物序列見表1。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個循環；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃；50℃ 30 s。將所得Ct值按照2-△△ct方法進行數據處理。

表1 熒光定量PCR的引物序列

2.5 統計學分析

數據采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，結果以均數±標準差（±s）表示。數據符合正態分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Tamhane’s T2檢驗。不符合正態分布的數據采用秩和檢驗。以P〈0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠的PWMT比較

術前各組大鼠的機械痛閾值無顯著差異。術后第3天，機械痛閾值結果顯示模型組、假手術組、假推拿組和推拿組較正常組相比均下降，模型組較假手術組下降（P〈0.05），且正常組及假手術組顯著高于模型組，數據顯示正常組為（54.00±5.07）、假手術組為（38.87±8.54）、模型組為（12.75±1.66）；與模型組、假推拿組相比，推拿組的機械痛閾值升高（P〈0.05），且推拿組顯著高于模型組為（39.37±8.07）、假推組為（22.37±5.04）。術后第7天，結果顯示模型組與假推組的機械痛閾值較正常組降低，模型組的機械閾值較假手術組降低（P〈0.05），且發現大鼠模型組的機械痛閾值為（16.50±2.87），推拿組的機械痛閾值為（45.87±8.11），推拿組和模型組相比痛閾明顯提高（P〈0.05），提示推拿有助于緩解SNL大鼠的疼痛，且能恢復SNL大鼠的痛閾。如表2，圖1所示。

圖1 推拿對NPP大鼠機械痛閾值的影響

表2 推拿對NPP大鼠機械痛閾值的影響（±s，g，n=8）

表2 推拿對NPP大鼠機械痛閾值的影響（±s，g，n=8）

注：與正常組比較，#P〈0.05；與假手術組比較，*P〈0.05；與模型組和假推拿組比較，+P〈0.05。

組別正常組模型組假手術組推拿組假推組術前1天52.87±6.97 50.75±8.32 51.00±7.32 53.62±7.5 50.37±5.62術后3天54.00±5.07 12.75±1.66#*38.87±8.54#39.37±8.07#+22.37±5.04#術后7天52.12±5.27 16.50±2.87#*44.25±6.11 45.87±8.11+26.00±4.34#

3.2 各組大鼠的PWTL比較

術前各組大鼠的熱痛閾值無顯著差異。術后第3天，熱痛閾值結果顯示模型組、假手術組、假推拿組和推拿組較正常組相比均下降，模型組較假手術組下降（P〈0.05），且正常組及假手術組顯著高于模型組，數據顯示正常組為（27.09±5.80）、假手術組為（21.64±1.54）、模型組為（12.20±1.36）；與模型組、假推拿組相比，推拿組的熱痛閾值升高（P〈0.05），且推拿組顯著高于模型組為（23.01±0.98）、假推組為（16.73±1.81）。術后第7天，結果顯示模型組與假推組的熱痛閾值較正常組降低，模型組的機械閾值較假手術組降低（P〈0.05），且發現大鼠模型組的熱痛閾值為（16.43±1.27），推拿組的熱痛閾值為（27.98±2.19），推拿組與模型組相比對熱刺激的耐受明顯提高（P〈0.05），提示推拿有助于緩解SNL大鼠的疼痛，且能提高大鼠對熱刺激的閾值。如表3，圖2所示。

表3 推拿對NPP大鼠熱痛閾值的影響（±s，g，n=8）

表3 推拿對NPP大鼠熱痛閾值的影響（±s，g，n=8）

注：與正常組比較，*P〈0.05；與假手術組比較，#P〈0.05；與模型組和假推拿組比較，△P〈0.05。

組別正常組模型組假手術組推拿組假推組術前1天29.06±1.29 30.50±1.78 30.34±1.19 30.44±1.67 29.55±1.59術后3天27.09±5.80 12.20±1.36*#21.64±1.54*23.01±0.98*△16.73±1.81*術后7天27.26±7.48 16.43±1.27*#28.34±1.29 27.98±2.19△20.42±2.70*

圖2 推拿對NPP大鼠熱痛閾值的影響

3.3 各組大鼠脊髓背角中miR-21-5P mRNA表達的比較

術后第7天，模型組脊髓miR-21-5P mRNA的表達相較于正常組及假手術的表達升高（P〈0.01），且推拿組miR-21-5P mRNA的表達較模型組顯著下降（P〈0.01）。如表4，圖3所示。

表4 推拿對NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達的影響（±s，2-△△ct，n=8）

表4 推拿對NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達的影響（±s，2-△△ct，n=8）

注：與正常組及假手術組比較，*P〈0.01；與模型組比較，**P〈0.01。

組別正常組模型組假手術組推拿組假推組miR-21-5P表達水平1.00±0.00 6.53±1.12*2.47±0.80 1.10±0.41**1.83±0.57

圖3 推拿對NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達的影響

3.4 各組大鼠脊髓背角中ERK、STAT3蛋白表達的比較

術后第7天，模型組脊髓背角ERK、STAT3的表達相較于正常組及假手術組的表達升高（P〈0.01）。經推拿干預后，推拿組的ERK表達下降，與模型組相比表達差異明顯（P〈0.05），推拿組的STAT3表達同樣下降，與模型組相比差異具有顯著性（P〈0.01）。如圖4所示。

圖4 推拿對NPP大鼠脊髓組織中ERK、STAT3蛋白表達的影響

3.5 各組大鼠血清中IL-1β表達的比較

術后第7天，模型組IL-1β的表達相較于正常組及假手術組的表達升高（P〈0.05）。經推拿干預后，推拿組的IL-1β表達降低，與模型組相比差異具有統計學意義（P〈0.05）。如表5，圖5所示。

表5 推拿對NPP大鼠血清中IL-1β表達的影響（±s，pg·mg-1，n=8）

表5 推拿對NPP大鼠血清中IL-1β表達的影響（±s，pg·mg-1，n=8）

注：與正常組、假手術組比較，△P〈0.05；與模型組比較，*P〈0.05。

組別正常組假手術組模型組假推組推拿組IL-1β表達水平0.09±0.33 9.12±0.83 30.95±0.58△20.53±0.73 18.01±0.93*

圖5 推拿對NPP大鼠血清中IL-1β表達的影響

4 討論

4.1 推拿治療疼痛的中醫機制

中醫學認為疼痛有虛實之分，即所謂“不通則痛”和“不榮則痛”。“不通則痛”多為“實痛”，多因外感六淫、痰濁凝滯、跌仆外傷，或食積蟲擾等阻滯臟腑經脈，氣血運行不暢所致；“不榮則痛”多為“虛痛”，多因陽氣虧虛，精血不足，臟腑經絡失養所致。而推拿手法作用于經絡腧穴，可行氣活血、疏經通絡，從而達到治療疼痛的效果。正如《素問·血氣形志篇》曰：“形數驚恐，經絡不通，病生于不仁，治之以按摩醪藥[13]。”另外，推拿手法通過對機體體表的溫熱刺激，產生熱效應，從而加速氣血的流動達到散寒止痛的功效，如《素問·舉痛論》曰：“寒氣客于背俞之脈則脈泣，脈泣則血虛，血虛則痛……按之則熱氣至，熱氣至則痛止矣[14]。”筋骨關節受損的疾病通過推拿治療能起到理筋整復、松解粘連與滑利關節的作用，正如《醫宗金鑒·正骨心法要旨》曰：“因跌撲閃失，以至骨縫開錯……宜用按摩法。按其經絡，以通郁閉之氣……其患可愈[15]。”環跳穴為多氣多血之經的足少陽膽經與足太陽膀胱經的交會穴，主腰胯疼痛、下肢痿痹等腰腿疾患。正如《針灸甲乙經·陰受病發痹》云：“腰脅相引痛急……脛痛不可屈伸……環跳主之”，因此，推拿環跳穴可起到祛風化濕、疏通經絡之效[16]。陽陵泉為足少陽膽經的合穴，膽的下合穴，八會穴之筋會，是足少陽膽經氣血匯聚之所。據《針灸大成》記載：“陽陵泉，主治下肢經筋病癥之要穴[17]”，因此，推拿作用于陽陵泉穴可以促進局部的血液循環以及炎癥介質的分解、稀釋，從而緩解局部的疼痛癥狀。懸鐘穴是足三陽之大絡，為八會穴之髓會，是人體髓氣匯聚的地方，古有記載，《針灸甲乙經》：“脛酸痛，按之不可，名曰胕髓病，以镵針針絕骨出其血立已。”可見干預懸鐘穴具有疏調肝膽氣機、通經活絡、祛風止痛、補髓壯骨之功效。因此推拿是緩解神經病理性疼痛的一種有效措施。

4.2 NPP與miR-21-5P及ERK、STAT3蛋白的關系

MicroRNA參與多種生物調控過程，包括細胞增殖、分化和凋亡以及炎癥反應等，而在神經病理性疼痛動物模型中MicroRNA的調節異常，提示MicroRNA在神經病理性疼痛的發生發展中起著至關重要的作用。Chang等[18]通過微陣列分析評估了大鼠DRG中差異MicroRNA的表達，與假手術組相比，SNL組在神經損傷后7d觀察到83個差異MicroRNA。有文獻報道miR-183在SNL大鼠模型中表達顯著下調，而過表達miR-183可通過抑制miR-183的靶基因來緩解疼痛樣行為[19]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族細胞外信號調節激酶的關鍵組成部分，通過調節代謝途徑、細胞增殖、分化和凋亡來控制某些神經活動，ERK還影響神經彈性特性、神經生長以及腦損傷時的神經和認知過程[20]。研究發現，在神經病理性疼痛的幾種動物模型中，ERK在神經元、微膠質和星形細胞中被激活，且ERK的抑制劑可以在不同的時間點減輕疼痛[21]。因此，ERK是神經性疼痛產生、痛覺信號傳遞等過程中的關鍵性因子[22]。STAT3主要分布在神經系統中，可調節多種神經遞質受體和離子通道蛋白的表達，其過度活化與大鼠神經病理性疼痛癥狀同步，抑制其活化可作為治療神經病理性疼痛的新靶點[23]。與此同時，在慢性疼痛的背景下，一些報道將p-STAT3的激活與炎癥細胞因子或生長因子聯系起來。例如在疼痛的實驗模型中[24]，p-STAT3或STAT3激活水平的增加與DRG神經元中通道的TNF-α上調有關。Bernal等[25]證實神經損傷時，DRG中的STAT3被激活，且存在于非軸突化神經元中。Dominguez等[26]在脊髓結扎的大鼠模型發現脊髓背角的小膠質細胞會出現IL-6和p-STAT3的高表達，并伴隨著機械痛敏和熱痛潛伏期的減小或縮短。IL-1β是主要由單核-巨噬細胞合成的促炎癥細胞因子，參與多種炎癥反應的發生，IL-1β促進炎癥的發生，從而誘導軸突損傷和傷害性纖維的自發活動，導致非典型信號轉導到DRG，因此，在神經損傷和炎癥刺激后，IL-1β水平升高，所以，IL-1β在神經病理性疼痛中發揮重要作用[27-28]。Mei等[29]發現IL-1β在周圍神經損傷小鼠體內的mRNA和蛋白水平均迅速上調，而與野生型同窩小鼠相比，缺乏IL-1β的小鼠損傷后的傷害感受敏感性降低，且在IL-1β敲除小鼠的坐骨神經損傷部位注射微量重組IL-1β可使機械痛閾恢復到損傷野生型小鼠的水平。與此同時，有研究表明抑制miR-21-5p可逆轉PI3K/AKT和ERK通路的異常激活[30]。而抑制了ERK的表達可以降低STAT3的激活，最終抑制肝癌的增殖[31]。同時，抑制了STAT3的表達后又可以下調IL-1β的表達[32]。以上實驗皆證實了NPP與miR-21-5P及ERK、STAT3蛋白密切相關。因此，我們推測miR-21-5P、ERK、STAT3、IL-1β之間存在關聯性，而推拿可能通過影響miR-21-5P、ERK、STAT3及IL-1β的表達，從而達到鎮痛的目的。

5 結果分析

SNL大鼠模型是一個可靠的、可重復的誘導周圍神經病變的嚙齒動物模型，因此該模型在神經病理性疼痛的研究中被廣泛應用。因SNL模型造模時傷口過深，為排除因手術造成的炎癥損傷及疼痛，所以設置假手術組。同理，本研究設置假推拿組的目的是為了與推拿組對比，從而驗證經絡腧穴及推拿手法的治療療效。本研究觀察到，SNL大鼠在造模后第3天有明顯的跛行、抬足及啃咬術后一側腳趾等疼痛行為表現，同時SNL大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值均有所降低，造模后第7天推拿組SNL大鼠的行為學表現較第3天有所好轉，機械痛閾值與熱痛閾值較第3天同樣有所提高，這說明在推拿的干預下，SNL大鼠疼痛行為的發生下降，同時能夠提高SNL大鼠的機械痛閾值和熱痛閾值，推拿的鎮痛效果顯著。本實驗通過qPCR觀察到SNL大鼠損傷7天后，L4-6脊髓背角的miR-21-5P表達明顯升高，經推拿干預后miR-21-5P的表達水平降低；通過WB觀察到造模后SNL大鼠脊髓背角中ERK、STAT3表達升高，推拿干預后ERK、STAT3的表達水平均有所降低；通過ELISA觀察到SNL大鼠造模后IL-1β表達水平上升，經推拿干預后IL-1β的表達水平降低。這表明miR-21-5P、ERK、STAT3在SNL大鼠中被激活，然后誘導了炎癥反應的發生，導致疼痛感。經過7天的推拿干預后，miR-21-5P、ERK、STAT3和IL-1β的表達均顯著減少，這表明推拿可以通過降低miR-21-5P、ERK、STAT3的表達來抑制SNL大鼠的炎癥反應，從而減輕SNL大鼠對疼痛的感知。

綜上所述，推拿可緩解神經病理性疼痛，其機制可能與通過下調miR-21-5P、ERK、STAT3的表達，減少炎癥因子IL-1β的表達相關。本研究在一定程度上為臨床推拿治療神經病理性疼痛提供了實驗依據，但本實驗還未證實miR-21-5P/ERK/STAT3的上下游關系，今后將用miR-21-5P抑制劑或基因敲除等方式進一步探究miR-21-5P與ERK、STAT3及推拿鎮痛的關系。