半枝蓮標準湯劑的指紋圖譜建立與抗氧化活性成分的化學模式識別

杜義龍 李賽 李艷榮 潘海峰

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）04-0425-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.08

摘 要 目的 測定半枝蓮標準湯劑中總黃酮的含量，評價其體外抗氧化活性，建立其指紋圖譜，并進行化學模式識別分析。方法 采用紫外-可見分光光度法測定半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量（以野黃芩素計）;采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除實驗考察半枝蓮標準湯劑的體外抗氧化活性;采用高效液相色譜（HPLC）法，以野黃芩苷峰為參照峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》繪制16批半枝蓮標準湯劑的指紋圖譜并進行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 24.0軟件進行Pearson相關性分析，篩選具有體外抗氧化活性的潛在物質，并以其為變量，采用SPSS 24.0、SIMCA 14.1軟件進行聚類分析和主成分分析。結果 總黃酮檢測質量濃度的線性范圍為2.106～21.06 μg/mL（R 2=0.999 3）;精密度、重復性、穩定性（120 min）試驗的RSD均小于2%;加樣回收率為100.62%（RSD=0.55%，n=6）;總黃酮含量為0.634～1.053 mg/mL。DPPH自由基清除實驗的半數抑制濃度（IC50）為1.120～3.602 mg/mL，ABTS自由基清除實驗的IC50為0.684～1.327 mg/mL;相關性分析結果顯示，半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量與DPPH自由基、ABTS自由基清除實驗的IC50均呈負相關，相關系數分別為-0.976、-0.940（P<0.01）。16批半枝蓮標準湯劑共有18個共有峰，相似度為0.964～0.997;共指認出其中4個共有峰，分別為野黃芩苷（8號峰）、野黃芩素（14號峰）、木犀草素（15號峰）、芹菜素（17號峰）。半枝蓮標準湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積與DPPH自由基、ABTS自由基清除實驗的IC50均呈顯著負相關（P<0.05或P<0.01）。聚類分析結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類;主成分分析將16批半枝蓮標準湯劑分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為一類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為一類，S4、S13、S15樣品的綜合評分較高。結論 所建HPLC指紋圖譜及化學模式識別分析方法可用于評價半枝蓮標準湯劑的質量;3～4、8～9、12～15、17號峰及總黃酮是半枝蓮標準湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質基礎。

關鍵詞 半枝蓮;標準湯劑;總黃酮;體外抗氧化作用;指紋圖譜;主成分分析;聚類分析

Fingerprint establishment of Scutellaria barbata standard decoction and chemical pattern recognition of antioxidant components

DU Yilong，LI Sai，LI Yanrong，PAN Haifeng（Hebei Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development， Chengde Medical University， Hebei Chengde 067000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To determine the contents of total flavonoids in Scutellaria barbata standard decoction， evaluate in vitro antioxidant activity， establish the fingerprint and conduct chemical pattern recognition analysis. METHODS The contents of total flavonoids in S. barbata standard decoction （calculated by scutellarein） were determined by ultraviet-visible spectrophotometry. In vitro antioxidant activity of S. barbata standard decoction was investigated by free radical scavenging tests of 1，1-diphenyl- 2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and 2，2′-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） ammonium salt（ABTS）; HPLC method was adopted. Using scutellarin as reference， the fingerprints of 16 batches of S. barbata standard decoction were drawn and evaluated by Similarity Evaluation System of TCM Chromatogram Fingerprint （2004 A edition）， and the common peaks were determined; Pearson correlation analysis was carried out by using SPSS 24.0 software to screen substances with in vitro antioxidant activity. Taking them as variables， cluster analysis and principal component analysis were carried out by using SPSS 24.0 and SIMCA 14.1 software. RESULTS The linear range of total flavonoids were 2.106-21.06 μg/mL（R 2=0.999 3）; RSDs of precision， reproducibility and stability tests （120 min） were all lower than 2%; the recovery was 100.62% （RSD=0.55%，n=6）; the contents of total flavonoids were 0.634-1.053 mg/mL. Median inhibitory concentration （IC50） of DPPH radical scavenging experiment ranged 1.120-3.602 mg/mL， and IC50 of ABTS radical scavenging experiment ranged 0.684-1.327 mg/mL. The results of correlation analysis showed that the content of total flavonoids in S. barbata standard decoction was negatively correlated with the IC50 of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging experiment， and the correlation coefficients were? -0.976 and -0.940 respectively （P<0.01）. There were 18 common peaks in the fingerprints of 16 batches of S. barbata standard decoction; the similarities were 0.964-0.997. A total of 4 common peaks were identified， such as scutellarin （peak 8），scutellarein （peak 14）， luteolin （peak 15）， apigenin （peak 17）.In the HPLC fingerprints of S. barbata standard decoction， the peak areas of peak 3-4， 8-9， 12-15 and 17 were significantly negatively correlated with the IC50 of DPPH free radical and ABTS free radical scavenging experiment （P<0.05）. The results of cluster analysis showed that 16 batches of S. barbata standard decoction could be clustered into two categories， of which S2， S7-S8 and S14-S16 were clustered into one category， S1， S3-S6 and S9-S13 were clustered into one category. By principal component analysis， 16 batches of S. barbata standard decoction were divided into two categories， of which S2， S4， S7 and S14-S16 were clustered into one category， and S1， S3， S5-S6 and S8-S13 were clustered into one. The comprehensive scores were high in the samples of S4， S13， S15. CONCLUSIONS Established HPLC fingerprint and chemical pattern recognition analysis method can be used to evaluate the quality of S. barbata standard decoction; peak 3-4， 8-9， 12-15 and 17 and total flavonoids are the potential material basis for S. barbata standard decoction to scavenge DPPH free radical and ABTS free radical.

KEYWORDS? ?Scutellaria barbata; standard decoction; total flavonoids; in vitro antioxidant effect; fingerprint; principal component analysis; cluster analysis

半枝蓮Scutellaria barbata D. Don為唇形科黃芩屬多年生草本植物，以干燥全草入藥，始載于《外科正宗》[1]。半枝蓮在明代被稱為“解蛇傷之仙草”，主產于我國河南、河北、安徽、四川、浙江等省，主要含有黃酮類、二萜類、多糖類等化學成分，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效[1-2]。現代藥理研究表明，半枝蓮所含有的黃酮類成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[3-5]，是潛在的天然抗氧化劑，臨床應用前景廣泛[1]。

2016年國家藥典委員會提出了“標準湯劑”的概念，是指在中醫藥理論指導下，通過規范化煎煮、固液分離和適當濃縮或適宜方法干燥制得的中藥湯劑[6]。中藥標準湯劑是衡量單味中藥配方顆粒臨床湯劑與對應中藥飲片臨床湯劑是否一致的物質基準[7]。指紋圖譜能夠通過共有峰標定、相似度評價等手段較全面地反映中藥的整體性[8]，故《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》將指紋圖譜作為評價單味中藥標準湯劑與對應中藥飲片臨床湯劑一致性的重要手段[9]。中藥譜效學是著重解決中藥活性成分復雜、藥理作用機制不明的一門學科，可利用多種數據分析中藥藥理活性的物質基礎[10]。化學模式識別分析包括聚類分析和主成分分析等，是用于揭示隱含于化學量測數據內部規律的一種多元分析技術，已被廣泛應用于中藥材及中藥制劑的質量評價[11]。

目前，有關半枝蓮標準湯劑的研究較少，大多為半枝蓮飲片標準湯劑中野黃芩苷、野黃芩素的含量測定[12]。半枝蓮中的黃酮類成分為其主要活性成分，具有顯著的抗氧化活性[13]，但尚未有半枝蓮標準湯劑中各成分與其抗氧化活性的相關性研究;加之半枝蓮在臨床主要以水煎服，而中藥水煎劑大多具有作用機制復雜、作用靶點多樣、成分不確定等特點[8]，且煎煮過程中的不穩定因素較多[7，14]，故為保證臨床用藥的一致性，對半枝蓮標準湯劑進行全面的質量控制就顯得尤為重要。基于此，本研究采用紫外-可見分光光度法測定了半枝蓮標準湯劑中總黃酮的含量（以野黃芩苷計），同時以體外抗氧化作用為主要藥效基礎，篩選半枝蓮標準湯劑中與抗氧化活性潛在相關的主要化學成分，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立其指紋圖譜，并以篩選出的化學成分為變量進行聚類分析和主成分分析，旨在為半枝蓮標準湯劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1220 infinity Ⅱ型液相色譜儀及配備的雙柱塞串聯泵、真空在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、標準流通池（美國Agilent公司），UV-2600 Probe型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司），AG-245型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-700型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HC-2062型高速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司），Multiskan FC型酶標儀（美國Thexmo Fisher Scientific公司），JA2003型電子分析天平（蘇州德匯科學儀器有限公司），ZDHW型調溫電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

維生素C對照品（批號J1024A，純度>99.0%）、2，2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS，批號M0403A]均購自昆明澤浩科技有限公司;野黃芩苷對照品（批號18032206，純度≥98%）購自成都普菲德生物技術有限公司;野黃芩素對照品（批號140107，純度≥98%）、芹菜素對照品（批號140224，純度≥98%）均購自上海融禾醫藥科技發展有限公司;木犀草素對照品（純度≥98%，HPLC法）由承德醫學院崔鳳俠教授于北京大學醫學部制得;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基（批號464RB-GE）購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司;過硫酸鉀（K2S2O8，批號181027）購自天津市歐博凱化工有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，冰醋酸、甲醇均為分析純，水為純凈水。

16批半枝蓮藥材（編號Y1～Y16）于2019年購自河北安國中藥材市場，經承德民族師范學院生物系董建新教授鑒定為唇形科植物半枝蓮S. barbata D. Don的干燥全草。16批半枝蓮藥材樣品來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 半枝蓮標準湯劑的制備

取洗凈、充分干燥后的半枝蓮藥材 100 g，精密稱定，置于煎藥鍋中，加水1 200 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，文火保持微沸30 min，趁熱用3層紗布濾過;殘渣加水1 000 mL，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，趁熱用3層紗布濾過;合并2次濾液，于60 ℃減壓濃縮至500 mL，即得[14]，共制備16批（編號S1～S16）。

2.2 半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取野黃芩苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇溶解并稀釋，制成質量濃度為1.053 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下半枝蓮標準湯劑，濾過，精密移取濾液1 mL，置于100 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 檢測波長的確定 按2020年版《中國藥典》（一部）“半枝蓮”項下總黃酮含量測定方法操作[2]：取上述對照品溶液、供試品溶液（編號S1），以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于200～600 nm波長內進行掃描。結果顯示，在335 nm波長處，對照品溶液、供試品溶液均有最大吸收，且空白對照無干擾（圖1），故選擇檢測波長為335 nm。

2.2.4 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列線性工作溶液。以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處測定吸光度。以對照品的質量濃度（c）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸。結果顯示，野黃芩苷的回歸方程為A=27.604c-151.63（R 2=0.999 3），表明野黃芩苷檢測質量濃度的線性范圍為2.106～21.06 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液0.3 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻。以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處連續測定吸光度6次。結果顯示，對照品溶液吸光度的RSD為0.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別在室溫下放置0、20、40、60、80、100、120 min時，以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處測定吸光度。結果顯示，待測樣品吸光度的RSD為1.80%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置120 min內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取“2.1”項下半枝蓮標準湯劑（編號S1），共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品含量。結果顯示，總黃酮含量的RSD為1.85%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的半枝蓮標準湯劑（編號S1），每份0.5 mL，共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率。結果見表2。

2.2.9 樣品含量測定 取16批“2.1”項下半枝蓮標準湯劑，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以60%甲醇為空白對照，使用紫外-可見分光光度計于335 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品含量，每樣品平行測定3次。結果見表3。

2.3 體外抗氧化活性的測定

2.3.1 陽性對照溶液的制備 精密稱取維生素C對照品48.4 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為4.84 mg/mL的陽性對照溶液。

2.3.2 DPPH自由基溶液的制備 精密稱定DPPH12.0 mg，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為0.12 mg/mL的DPPH自由基溶液。

2.3.3 ABTS自由基溶液的制備 精密稱定ABTS 41.0 mg、K2S2O8 18.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，得ABTS貯備液和K2S2O8貯備液;分別精密吸取上述單一貯備液各2.5 mL，置于100 mL量瓶中，加水定容，搖勻，即得ABTS自由基溶液，避光儲存12～16 h，備用。

2.3.4 樣品溶液的制備 取16批“2.1”項下半枝蓮標準湯劑，濾過，取續濾液，即得樣品溶液。取上述樣品溶液，加水稀釋，制得質量濃度（以生藥量計）分別為0.50、0.75、1.00、1.50、2.50、3.75、5.00 mg/mL的系列樣品溶液A，用于DPPH自由基清除率的測定;同法制得質量濃度（以生藥量計）分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50 mg/mL的系列樣品溶液B，用于ABTS自由基清除率的測定。

2.3.5 DPPH自由基清除率的測定 取“2.3.1”項下陽性對照溶液、“2.3.4”項下系列樣品溶液A各50 μL，加至96微孔板中，再加入“2.3.2”項下DPPH自由基溶液100 μL，避光反應30 min后，使用酶標儀于517 nm波長處測得吸光度（A）;用水代替樣品溶液，同法測得吸光度（B）。按公式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=

[（B-A）/B]×100%[15]。每樣品平行操作3次，取平均值。由于各批半枝蓮標準湯劑對DPPH自由基的清除率與其質量濃度不成線性關系，因此采用SPSS 24.0軟件中的Probit方法對DPPH自由基清除率進行回歸分析。結果顯示，擬合后的方程為Probit（P）=Intercept+Bx（式中，Intercept表示截距，B表示斜率，P為DPPH自由基清除率，x為半枝蓮標準湯劑稀釋后的質量濃度;Probit=0.50時，半枝蓮標準湯劑的相應濃度以生藥量計）。經χ 2檢驗后，得到半數抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50），其值越小表示半枝蓮標準湯劑的體外抗氧化活性越強[10]。結果見表4、圖2A。

2.3.6 ABTS自由基清除率的測定 取“2.3.1”項下陽性對照溶液、“2.3.4”項下系列樣品溶液B各50 μL，加至96微孔板中，再加入“2.3.3”項下ABTS自由基溶液100 μL，避光反應6 min后，使用酶標儀于734 nm波長處測定吸光度（A）;用水代替樣品溶液，同法測定吸光度（B）。按“2.3.5”項下公式及方法計算ABTS自由基清除率的IC50[15]。每樣品平行操作3次，取平均值。結果見表4、圖2B。

2.3.7 相關性分析 采用SPSS 24.0軟件以Pearson相關性分析評價半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量與IC50的相關性，結果見表4。由表4可知，半枝蓮標準湯劑中總黃酮的含量與DPPH、ABTS自由基清除實驗的IC50均呈負相關（P<0.01），相關系數分別為-0.976、-0.940，表明半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量越高，其體外抗氧化活性越強。

2.4 半枝蓮標準湯劑HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 以ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%冰醋酸溶液為流動相（A）、甲醇-乙腈混合溶液（8 ∶ 2，V/V）為流動相（B）進行梯度洗脫（0～20 min，10%B→28%B;20～30 min，28%B→35%B;30～40 min，35%B→40%B;40～50 min，40%B→50%B;50～60 min，50%B→70%B）;檢測波長為335 nm;流速為1 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下半枝蓮標準湯劑，濾過，精密移取濾液10 mL，置于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密移取5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，以12 000 r/min離心10 min，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取野黃芩苷、芹菜素、野黃芩素、木犀草素對照品適量，置于100 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并定容，混勻，制成上述成分質量濃度分別為77.5、7.5、8.6、30.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.4 精密度試驗 取“2.4.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.50%（n=6），表明方法精密度良好。

2.4.5 穩定性試驗 取“2.4.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4.6 重復性試驗 取半枝蓮藥材（編號S1），共6份，按“2.1”項下方法制備半枝蓮標準湯劑，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以野黃芩苷峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.00%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4.7 指紋圖譜的建立 取16批半枝蓮藥材，按“2.1”項下方法制備半枝蓮標準湯劑，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，將16批半枝蓮標準湯劑的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》進行分析，以各色譜峰保留時間及峰面積適中的S1樣品為參照，設定時間窗寬度為0.20，以中位數法生成對照指紋圖譜，采用多點校正法生成疊加指紋圖譜。結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑共有18個共有峰，其HPLC疊加指紋圖譜見圖3，對照指紋圖譜見圖4。

2.4.7 共有峰指認 取“2.4.3”項下混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，得混合對照品溶液的HPLC圖（圖5）。將對照指紋圖譜（圖4）與該圖進行比對，共指認4個共有峰，分別為野黃芩苷（8號峰）、野黃芩素（14號峰）、木犀草素（15號峰）、芹菜素（17號峰）。

2.4.8 相似度評價與共有峰峰面積差異分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）》進行相似度評價。結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.994、0.996、0.992、0.996、0.989、0.993、0.964、0.994、0.997、0.982、0.996、0.982、0.993、0.993、0.990、0.965，均大于0.96，表明不同批次半枝蓮標準湯劑所含主要成分的種類基本一致。16批半枝蓮標準湯劑共有峰峰面積的RSD為20.52%～68.66%，表明不同批次半枝蓮標準湯劑所含主要成分的含量存在一定差異。結果見表5。

2.5 體外抗氧化活性相關化學成分的篩選

以16批半枝蓮標準湯劑的DPPH、ABTS自由基清除實驗的IC50為因變量，共有峰峰面積為自變量，采用SPSS 24.0軟件進行Pearson相關性分析。結果顯示，半枝蓮標準湯劑的HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積與DPPH、ABTS自由基清除實驗的IC50均呈負相關（P<0.05或P<0.01），相關系數為-0.811～-0.555;同時，結合“2.3.7”項下結果可知，半枝蓮標準湯劑中總黃酮含量與DPPH、ABTS自由基清除實驗的IC50均呈負相關，表明半枝蓮標準湯劑中的3～4、8～9、12～15、17號峰以及總黃酮是半枝蓮標準湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質基礎。結果見表6。

2.6 聚類分析

以16批半枝蓮標準湯劑指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用組間連接聚類法，以Pearson相關性為度量標準，使用SPSS 24.0軟件進行聚類分析。結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類。結果見圖6。

2.7 主成分分析

以16批半枝蓮標準湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用SPSS 24.0軟件進行主成分分析。結果顯示，KMO檢驗和Bartlett檢驗的KMO度量值為0.576（P<0.001），提示各變量間存在顯著相關性，可進行主成分分析。前3個主成分的特征值均大于1，累計方差貢獻率為88.406%，表明前3個主成分可以代表半枝蓮標準湯劑中上述10個變量的大部分信息。結果見表7。

采用SPSS 24.0軟件進行因子載荷矩陣分析。結果顯示，主成分1與3～4、9、17號峰峰面積及總黃酮含量呈正相關;主成分2與3、8、12～14號峰峰面積及總黃酮含量呈正相關;主成分3與14～15、17號峰峰面積及總黃酮含量呈正相關。結果見表8。根據下式計算各主成分得分值：F=ZX×A（式中，F表示主成分得分，ZX表示原始數據標準化后得到的標準化矩陣，A表示標準化的正交特征向量矩陣）;同時，結合各主成分貢獻率建立綜合評分（F綜）模型：F綜=0.539 46×F1+0.238 73×F2+0.105 88×F3。綜合評分可反映半枝蓮標準湯劑的整體質量，評分越高，則質量越好，體外抗氧化活性越強[11]。結果顯示，S4、S13、S15樣品綜合評分較高，表明這3批半枝蓮標準湯劑總體質量較好，體外抗氧化活性較強。結果見表9。

以16批半枝蓮標準湯劑HPLC指紋圖譜中3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積及總黃酮含量為變量，采用SIMCA 14.1軟件繪制主成分分析得分圖和載荷圖。結果顯示，第1、2、3主成分所反映的信息與上述主成分分析結果一致;16批半枝蓮標準湯劑被分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為Ⅰ類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為Ⅱ類;結合載荷圖可知，Ⅰ類樣品中3～4、9、15、17號峰對應成分及總黃酮的含量較高，Ⅱ類樣品中8、12～14號峰對應成分的含量較高。結果見圖7。

3 討論

本研究對16批半枝蓮標準湯劑中的總黃酮含量進行了測定，參考2020年版《中國藥典》（一部），以野黃芩苷為對照品，通過紫外吸收光譜掃描發現，野黃芩苷對照品和半枝蓮標準湯劑供試品于335 nm波長處均有最大吸收，且空白對照無干擾，故選擇335 nm為檢測波長。16批半枝蓮標準湯劑中總黃酮的含量為0.634～1.053 mg/mL，表明不同產地半枝蓮中總黃酮含量差異較大，質量參差不齊，可能與藥材的產地、采收、加工方式等因素不同有關[16]。

本研究通過DPPH、ABTS自由基清除實驗，考察了16批半枝蓮標準湯劑的體外抗氧化活性。結果顯示，不同批次樣品DPPH自由基清除實驗的IC50為1.120～3.602 mg/mL，ABTS自由基清除實驗的IC50為0.684～1.327 mg/mL，后者更小，表明半枝蓮標準湯劑對ABTS自由基的清除能力相對較強。不同批次半枝蓮標準湯劑DPPH自由基清除實驗的IC50值、ABTS自由基清除實驗的IC50值的RSD分別為32.96%、17.52%，表明不同批次半枝蓮標準湯劑的體外抗氧化活性差異較大，可能與不同批次半枝蓮藥材的內在質量不一致有關。

本研究建立了16批半枝蓮標準湯劑的指紋圖譜，相似度均大于0.96，共有峰峰面積的RSD為20.52%～68.66%，表明不同批次半枝蓮藥材所含化學成分種類基本一致，但含量差異較大，可能與產地、貯藏等因素的不同導致各批藥材內在質量存在差異有關[17]。

本研究將16批半枝蓮標準湯劑的體外抗氧化活性測定結果與其指紋圖譜中的18個共有峰峰面積及總黃酮含量進行Pearson相關性分析。結果顯示，3～4、8～9、12～15、17號峰對應成分及總黃酮是與DPPH自由基和ABTS自由基清除有關的潛在物質，其中野黃芩苷（8號峰）、野黃芩素（14號峰）、木犀草素（15號峰）、芹菜素（17號峰）及總黃酮的抗氧化活性已有文獻報道[18-23]，可考慮在后續研究中進一步優化實驗條件，將野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素及總黃酮含量作為評價半枝蓮標準湯劑質量的指標。本研究以3～4、8～9、12～15、17號峰峰面積及總黃酮含量為變量進行聚類分析和主成分分析。聚類分析結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑可聚為兩類，其中S2、S7～S8、S14～S16為一類，S1、S3～S6、S9～S13為一類;主成分分析結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑分為兩類，其中S2、S4、S7、S14～S16為Ⅰ類，S1、S3、S5～S6、S8～S13為Ⅱ類，Ⅰ類樣品中3～4、9、15、17號峰對應成分及總黃酮的含量較高，Ⅱ類樣品中8、12～14號峰對應成分的含量較高。綜合評分排序結果顯示，16批半枝蓮標準湯劑的綜合評分排序與其體外抗氧化活性趨勢基本一致，表明綜合評分模型可用于評價半枝蓮標準湯劑的整體質量。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜及化學模式識別分析方法可用于評價半枝蓮標準湯劑的質量;3～4、8～9、12～15、17號峰對應成分及總黃酮是半枝蓮標準湯劑清除DPPH自由基和ABTS自由基的潛在物質基礎。

參考文獻

[ 1 ] 李娜，王平，孫鐵鋒，等.半枝蓮化學成分、藥理作用及質量控制研究進展[J].中國中藥雜志，2020，45（21）：5117- 5128.

[ 2 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2020：122-123.

[ 3 ] 吳曉龍，崔思遠，王琰，等.中藥半枝蓮有效成分抗腫瘤作用機制研究進展[J].中華中醫藥雜志，2018，33（4）：1459-1462.

[ 4 ] 莫宗成，王敏，羅先欽，等.白花蛇舌草半枝蓮配伍抗腫瘤作用研究[J].天然產物研究與開發，2016，28（2）：210- 215.

[ 5 ] 石夢瑩，盧小路，熊思會，等.半枝蓮抗腫瘤藥理研究進展[J].世界中醫藥，2016，11（4）：741-743.

[ 6 ] 李艷，白明，宋亞剛，等.中藥標準湯劑的研究與思考[J].中草藥，2018，49（17）：3977-3980.

[ 7 ] 代云桃，靳如娜，吳治麗，等.基于標準湯劑（物質基準）的經典名方制備工藝和質量標準研究[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（2）：164-174.

[ 8 ] HUANG Z Q，CHEN P，SU W W，et al. Antioxidant activity and hepatoprotective potential of quercetin 7-rhamnoside in vitro and in vivo[J]. Molecules，2018，23（5）：1188.

[ 9 ] 國家藥品監督管理局.關于發布《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》的通告[EB/OL].[2022-01-05].http：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/qtggtg/20210210145-

45318.html.

[10] 李艷榮，周維維，王子怡，等.山楂葉提取物抗氧化活性及譜效關系研究[J].中國藥學雜志，2020，55（20）：1673- 1679.

[11] 王琪，李曉琦，黃萌萌，等.基于指紋圖譜及多成分含量的化學模式識別法評價不同產地梔子藥材的質量[J].中草藥，2019，50（11）：2690-2699.

[12] 田宇柔，馮玉，麻景梅，等.半枝蓮飲片標準湯劑質量評價體系的建立[J].中藥新藥與臨床藥理，2019，30（7）：851- 857.

[13] 汪琛媛，段賢春，李瑛，等.半枝蓮黃酮類化學成分分析[J].安徽醫學，2019，40（8）：848-851.

[14] 楊立偉，王海南，耿蓮，等.基于標準湯劑的中藥整體質量控制模式探討[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（8）：1-6.

[15] SHENG J W，SUN Y L. Antioxidant properties of different molecular weight polysaccharides from Athyrium mul-? ? ?tidentatum（Doll.）Ching[J]. Carbohyd Polym，2014，108：41-45.

[16] 夏云嶺，張振凌，張洪坤，等. HPLC法同時測定半枝蓮飲片中4種黃酮類成分的含量及主成分分析[J].中國藥房，2019，30（20）：2839-2844.

[17] 鄭孟凱，唐映紅，陳建真，等.基于HPLC指紋圖譜及主成分分析、聚類分析研究不同地區市售麻黃藥材的質量差異[J].中華中醫藥雜志，2016，31（4）：1420-1426.

[18] 姜蔚.野黃芩苷藥理作用及機制研究進展[J].中國藥理學通報，2018，34（12）：1634-1637.

[19] 王晶.黃芩素和野黃芩素的合成及其抗氧化性研究[D].無錫：江南大學，2012.

[20] 王繼雙，何焱，張文靜，等.木犀草素的藥理作用研究進展[J].生命科學，2013，25（6）：560-565.

[21] 姚芳芳，張銳，傅瑞娟，等.槲皮素和芹菜素對高尿酸血癥大鼠血尿酸及抗氧化能力的影響[J].食品科學，2011，32（5）：287-290.

[22] 廖月霞.半枝蓮黃酮活性成分雙向調節腫瘤免疫作用及機制[D].揚州：揚州大學，2014.

[23] 焦燕.半枝蓮中黃酮類成分的研究[D].北京：首都師范大學，2009.

（收稿日期：2021-08-26 修回日期：2021-12-23）

（編輯：陳 宏）