玻色因相關物質研究

古鳳強 暢水平 張淼 楊穎潔 傳雅萍

羥丙基四氫吡喃三醇是玻色因的主要功效成分，具有多種可能的異構體構型。我們采用HPLC法對市售多家玻色因活性成分進行了比較分析，并用實驗驗證了差向異構化反應是其不同構型的產生條件。實驗結果表明：以D-木糖為原料，生成的玻色因是D-木糖衍生物β-構型N式結構，由兩個非對映異構體（比例50/50）組成，市售某些廠家的玻色因產品主成分是其差向異構化產物。

玻色因（Pro-XylaneTM）是歐萊雅集團自主研發的化妝品原料商品名，其活性成分化學名為羥丙基四氫吡喃三醇。目前國內化妝品原料界將羥丙基四氫吡喃三醇等同稱作玻色因。玻色因能夠修復皮膚屏障，促進膠原蛋白再生，增加皮膚彈性和緊致度，從而具有抗衰作用，因此受到了化妝品生產企業和愛美人士的廣泛關注。2019年專利到期后，國內市場上如雨后春筍般出現了眾多的玻色因產品。由于玻色因產品缺乏行業標準，市場上的玻色因產品良莠不齊，其含量差異從30%到90%以上，外觀顏色從無色到橙黃色不等，產品優劣難分，極其容易出現假貨，進而引發化妝品安全事件。

玻色因是歐萊雅的專利產品，市場上尚未有其法定標準品[1]，羥丙基四氫吡喃三醇異構體較多。那么，究竟什么樣結構的玻色因是目標物，亟需進行研究和探討。基于此，我們用D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來蘇糖為原料，采用避免差向異構和增強差向異構化反應的不同實驗[2]，借助高效液相色譜法分析其產物，通過比較譜圖差異，論證差向異構化是造成玻色因異構體的主要原因，根據空間穩定性理論和實驗驗證確定玻色因目標產物主要是D-木糖衍生物β-構型N式結構，由兩個非對映異構體（比例50/50）組成。

市售玻色因液相圖譜比較

儀器、試劑

液相色譜：皖儀LC3000，ELSD檢測器;

色譜柱：ChromCoreHILIC-Amide（5μm，4.6×250mm）;

流動相：乙腈：甲醇：水=80∶15∶5;

流速：1mL/min;

柱溫：30℃;

進樣量：20μL。

測定步驟

取適量樣品，用流動相制成3mg/mL溶液，HPLCELSD

測定，液相色譜圖如圖1～6所示：

從以上譜圖可看出，幾個廠家的玻色因液相色譜出峰個數和位置相同，含量高低有差異。

玻色因合成產物剖析

玻色因是用木糖和乙酰丙酮縮合，再經還原反應而得到的[3]。木糖是五碳糖，在水溶液中，它在一定條件下會發生旋變反應和差向異構化反應[4]。我們在研究玻色因合成工藝的過程中[5-7]，發現反應產物比較復雜，通過核磁檢測分析，這幾種物質結構相似，推斷是同分異構體。

木糖的差向異構體主要包括阿拉伯糖、來蘇糖、核糖（還可以形成核酮糖和木酮糖，只不過形成這兩種糖比較困難，在此不做深入研究）。

比較穩定的五碳糖結構式

從上述結構分析可知，空間結構穩定的五碳糖結構主要包括六種：D-木糖N式、L-木糖A式、D-阿拉伯糖N式、L-阿拉伯糖A式、D-來蘇糖N式、L-來蘇糖A式。

木糖衍生物

不考慮旋光異構體，這是幾個比較穩定的衍生物。根據分子中羥基的位置，結合上述結構分析，D-木糖衍生物β構型N式的穩定性最好，這個是主產品;D-木糖衍生物α-構型N式相對于β-構型要少得多，為次要產品;L-木糖衍生物理論上是可以生成的，但相對于D-木糖衍生物會更少;L-木糖衍生物α構型比β構型穩定。所以，L-木糖衍生物應該以α構型A式為主。

阿拉伯糖衍生物（玻色因類似物——異構體）

從上述結構分析，D-阿拉伯糖衍生物α構型N式比D-阿拉伯糖衍生物β構型N式穩定，N式比A式穩定。所以阿拉伯糖衍生物（玻色因類似物）的穩定性順序為：

D-阿拉伯糖衍生物α構型N式>D-阿拉伯糖衍生物β構型N式>L-阿拉伯糖衍生物β構型A式>L-阿拉伯糖衍生物α構型A式。

即在玻色因合成過程中異構化產物以D-阿拉伯糖衍生物α構型N式為主。其余兩個可能是D-阿拉伯糖衍生物β構型N式和L-阿拉伯糖衍生物β構型A式。

來蘇糖衍生物

從上面結構分析，穩定性的順序為：

L-來蘇糖衍生物β構型A式>L-來蘇糖衍生物α構型A式>D-來蘇糖衍生物α構型N式>D-來蘇糖衍生物β構型N式

由此分析，在合成玻色因的過程中有可能形成的相關物質是L-來蘇糖衍生物β構型A式和L-來蘇糖衍生物α構型A式。

綜上所述，空間結構穩定的五碳糖結構主要包括五種：D-木糖衍生物β構型N式、D-阿拉伯糖衍生物α構型N式、D-阿拉伯糖衍生物β構型N式、D-木糖衍生物α-構型N式、L-來蘇糖衍生物β構型A式。

為進一步確定玻色因產品和相關物質的結構，我們分別以D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來蘇糖為原料，在避免或加強差向異構化反應的條件下與乙酰丙酮反應，經還原后得到產物，經HPLC、NMR測定，分析論證確定玻色因產品和相關物質的結構。

實驗論證

試劑、儀器

木糖：濟南圣泉集團股份有限公司

乙酰丙酮：南京東方之珠工貿有限公司

碳酸氫鈉、硼氫化鈉、氫氧化鈉：科密歐試劑

常規實驗室儀器。

實驗步驟

（1）將40.0g純化水抽入100mL反應瓶中，攪拌下于60～70℃依次投入D-木糖10.0g，加入6.6g乙酰丙酮，分批加入12.0g碳酸氫鈉，反應1h，過濾除鹽;反應液在30～40℃加入硼氫化鈉2.5g還原，再除鹽;母液濃縮，得到產品。由此方法[8，9]合成的產物液相色譜圖（如圖7所示）。

（2）將（1）中碳酸氫鈉換成5g氫氧化鈉，其他與上述步驟相同，合成產物液相色譜圖（如圖8所示）。

（3）以D-阿拉伯糖作原料，操作步驟與（1）相同，合成產物液相色譜圖（如圖9所示）。

（4）將（2）和（3）產物混合，液相色譜圖（如圖10所示）。

（5）以L-來蘇糖為原料，操作步驟與（1）相同，合成產物液相色譜圖（如圖11所示）。

（6）將（1）中產物制成固含量為50%玻色因樣品，送某知名第三方檢測公司與羥丙基四氫吡喃三醇標準品進行比較分析，NMR氫譜和碳譜結果（如圖12和圖13所示）。

結果與分析

（1）玻色因產品構型鑒定

以D-木糖為原料，以碳酸氫鈉作堿，采用避免差向異構化的方法，經還原得到的產品，先后經高效液相色譜（HPLC，圖7）、核磁共振氫譜（1H-NMR，圖12）和碳譜（13C—NMR，圖13）等測定方法確定了產品結構和質量，測試結果如下：

由圖7可知，采用避免差向異構化得到的玻色因產品純度高達98%，先后在10.0min、11.1min、15.7min和17.1min出現四種少量的差向異構化產物。

圖12是產品1H-NMR（馬來酸為內標物）測試圖，其測試結果如下：1H-NMR（400MHZ，D2O）δ1.11～1.14（dd，3H），1.41～1.81（m，2H），3.08～3.15（m，1H），3.17～3.23（m，1H），3.28～3.35（m，1H），3.47～3.53（m，1H），3.83～3.88（m，1H），3.9～3.98（m，1H）。上述數據證明該產品的氫化學位移值與羥丙基四氫吡喃三醇的氫化學位移預測值一致。同時，我們采用馬來酸為內標物，通過核磁共振氫譜（1H-NMR）測定玻色因的含量為97.8%，與HPLC的分析結果基本一致。

圖13是產品13C-NMR譜圖，羥丙基四氫吡喃三醇一共8個碳，譜圖中出現15個核磁碳峰，7位碳為手性碳，還原過程中產生兩個非對映異構體。從核磁碳譜計算可知，兩個非對映異構體比例為50/50，該核磁碳譜數據與歐萊雅公開的玻色因[9]一致。

綜上所述，以D-木糖為原料，采用避免差向異構化的方法，經還原得到的產品才是合格的玻色因產品。

（2）差向異構化反應探索

為了進一步搞清玻色因產品中出現的四種差向異構化產物的出現條件和產物的結構類型，我們進一步設計了三個驗證實驗，實驗結果如下：

圖8和圖7比較可知，強化差向異構化反應后，圖7的主產物減少，其他4個差向異構體大幅增加。

圖9是以D-阿拉伯糖為原料，其15.07min和15.60min出峰的兩個物質，是D-阿拉伯糖衍生物N式結構，11.74min和12.39min的峰應該是D-阿拉伯糖衍生物A式異構體。

圖10是D-木糖差向異構化反應與D-阿拉伯糖為原料的產物混合后液相譜圖，基本包含了兩個混合產物中的所有峰，15.29min和16.06min峰與圖9中相同位置的峰相對應，但比例正好相反，說明在3.2的反應中發生了差向異構，產生了阿拉伯糖的一個副產物。

圖11是L-來蘇糖為原料的產物色譜圖，由于來蘇糖樣品不多，加之非常不穩定，所以投料很少，峰面積比較小。盡管如此，也能看出來，15.08min、15.62min出現的兩個峰與圖8中相同位置的峰非常吻合，17.02min峰面積很小，不排除與圖8中的16.23min的峰一致。說明，來蘇糖不穩定，差向異構化也很嚴重。

如圖8～圖10的結果分析表明，以D-木糖、D-阿拉伯糖和L-來蘇糖等五碳糖為原料，與乙酰丙酮進行反應，在增強差向異構化條件下，均容易形成相互的差向異構化產物。

結論

本文通過比較市售不同廠家玻色因液相色譜圖，發現出峰個數和位置相同，但含量不同。為探究目標產物及其產生機理，以D-木糖、D-阿拉伯糖、L-來蘇糖為原料，在避免差向異構和增強差向異構化反應的條件下，與乙酰丙酮進行反應，再用硼氫化鈉還原，產物經HPLC、NMR測定，根據空間穩定性理論分析和實驗結果確定玻色因目標產物主要是D-木糖衍生物β-構型N式結構，由兩個非對應異構體（比例50/50）組成。市面上有些樣品的主成分是木糖差向異構化反應的產物。