基于IKK/IκB/NF-κB信號通路探討養心顆粒干預急性心肌梗死后心室重構的作用機制

姜芊竹，張 琪，楊建飛，萬冬梅，孫 靜，邢露茗，封 笑，周亞濱

近年來，隨著我國人口結構的老齡化，心血管系統疾病的發病率日益升高，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)由于發病急、預后差，嚴重危害中老年人群的健康。冠狀動脈粥樣斑塊破裂形成血栓或者血管痙攣致使冠狀動脈閉阻，相應血管的供血區心肌出現持續性的缺血而導致AMI的發生[1]。隨著診療水平的提高和病人健康意識的增強，近10年來AMI急性期住院病人的死亡率大幅下降，但AMI急性期過后的心室重構嚴重影響病人的預后，表現為梗死區域的心肌厚度及張力下降，非梗死區域的心肌肥厚擴張，心室腔內形態發生改變，進而影響心室的收縮功能，隨之引發心律失常、心力衰竭等[2]。因此，AMI急性期過后對抗心室重構的治療就顯得十分重要。

中醫在治療AMI及其并發癥中積累了大量的臨床經驗，具有獨特的療效，安全性較好的優勢。研究報道，養心顆粒具有明確的治療不穩定型心絞痛的作用[3]。本課題組前期研究表明，養心顆粒可以通過保護心肌細胞、抑制炎性因子的表達來改善心力衰竭大鼠的心肌功能[4]。本研究探討養心顆粒對抗AMI后心室重構的作用，并通過抑制性核因子激酶κB(IKK)/磷酸化IκB(p-IκB)/核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠60只，6～8月齡，體重(250±10)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(黑)2016004。飼養環境：早晚明暗自動切換(07：00～19：00)，獨立通風換氣系統，相對濕度40%～70%，溫度(24±2)℃。

1.2 實驗藥物 養心顆粒粉末，由黑龍江省藥材公司提供，組成(13味)：黃芪、人參、白茯苓、當歸、半夏、川芎、酸棗仁、遠志、茯神、辣桂、五味子、柏子仁、炙甘草，每克粉末含生藥量7 g，以蒸餾水配制成0.4 g/mL藥液，2～8 ℃冷藏保存。馬來酸依那普利片，由揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司提供(批準文號：H32026568)。

1.3 實驗試劑 大鼠基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)酶聯免疫吸附試劑盒(森貝伽生物公司)；兔抗大鼠NF-κB p65、IKK、核因子κB抑制劑(IκB-α)、p-IκBα-抗(Abcam公司)；Trizol(Ambion公司，批號：135306)。

1.4 實驗儀器 酶標儀(美國Awareness公司，型號：Stat Fax-2100)；數字凝膠成像系統(美國Alpha公司，型號：ALPHA1000-2)；光學顯微鏡(日本Nikon公司，型號：YS100)；動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號：R419智能型)；超薄切片機(德國Lecia公司，型號：RM2135)；多功能真彩色病理圖像分析系統(北京航空航天大學圖像中心，型號：CMIA-008)；多道生理記錄儀(普升科技有限公司，型號：MP-160)。

1.5 實驗方法

1.5.1 分組及模型復制 將60只SD大鼠，按照體質量隨機分為假手術組(12只)和手術組(48只)，手術組大鼠按照如下方法復制大鼠AMI模型：腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，采用多道生理記錄儀監測大鼠心電圖(ECG)，剔除ECG不正常者。將大鼠仰臥位固定于手術臺上，經口進行氣管插管，連接智能呼吸機，呼吸頻率90次/min，呼吸氣量比1∶1，潮氣量4～6 mL。用剃毛剪刀清理大鼠左側胸部毛，剪開皮膚，用止血鉗固定，鈍性剝離左側第3肋～第4肋間肌肉，胸腔開2 cm左右小口，輕輕按壓右側胸肋骨，暴露出心臟，鈍性剝離心包膜，在左心耳與肺動脈圓錐左下緣處(左心耳下2～3 cm)進針(3×8弧形針)，用醫用6-0號手術線結扎冠狀動脈左前降支(LAD)。假手術組大鼠只穿線、不結扎[5]。將大鼠心臟放回胸腔，逐層縫合肌肉層，并用負壓管抽盡胸腔內空氣，以免造成氣胸。縫合毛皮層。以大鼠結扎后ECG中S-T段抬高(產生J點位移)或者倒置為模型復制成功的標志。術后腹腔注射青霉素2×105U/d，連續3 d，以預防胸腔感染。

本研究假手術組12只實驗動物全部存活。手術組模型復制成功且術后存活的大鼠共36只，隨機分為模型組、養心顆粒組、依那普利組，每組12只。

1.5.2 給藥方法 模型復制成功后24 h內，養心顆粒組大鼠每日灌胃養心顆粒12.07 g/kg(分早、晚2次給藥)；依那普利組每日灌胃依那普利混懸液10 mg/kg；模型組和假手術組灌胃等體積的生理鹽水。連續給藥8周。

1.6 觀察指標

1.6.1 蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織病理變化 取實驗大鼠外周血后，立即脫頸處死，迅速開胸暴露心臟，取左心室梗死周圍心肌組織，4%多聚甲醛固定，用10%的EDTA脫鈣處理，梯度濃度乙醇脫水處理后用石蠟包埋，切片后HE染色，封片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理學改變。

1.6.2 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清MMP-2及TIMP-2的含量 于末次給藥后3 h用毛細管引流眼底靜脈叢取靜脈血1 mL，靜置15 min后，低溫離心10 min(3 000 r/min)，取上層血清，采用ELISA法測定MMP-2及TIMP-2含量。

1.6.3 ELISA法測定大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFN-γ的含量 取各組大鼠梗死部位心肌組織，精密稱量0.1 g，加入0.5 mL無菌生理鹽水，在冰浴上低溫勻漿3 min，勻漿液低溫離心10 min(3 000 r/min)，取上清液，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量。

1.6.4 蛋白免疫印跡法(Western Blot)測定大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白的表達 取梗死心肌組織，精密稱量0.2 g，-80 ℃低溫保存。將低溫保存的大鼠心肌組織粉碎后，在液氮中研磨，加入細胞裂解液(Trizol)提取蛋白。加入等體積緩沖液，經10%SDS-PAGE電泳(蛋白上樣量為50 μg)后，恒流電轉到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，Tbs-Tween漂洗，加入5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，Tbs-Tween漂洗3次，加入一抗(NF-κBp65、IKK-β、IκB-α、p-IκBα，1∶1 000)，4 ℃恒溫過夜。次日08：00用Tbs-Tween漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶2 500)，室溫溫育1 h，反復漂洗3次后，加入ECL，暗室曝光后進行光密度掃描，分析條帶分子量及灰度值(β-actin為內參蛋白)。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理變化 假手術組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核明顯，無形態改變及炎性細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，出現形態的改變，表現為伸長、腫脹甚至是壞死，電鏡下可見水腫和炎性細胞浸潤，細胞間可見膠原纖維增生；養心顆粒組和依那普利組大鼠心肌細胞排列整齊度有所改善，腫脹和變形有所減輕，膠原纖維增生和炎性細胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠外周血MMP-2明顯升高，TIMP-2明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，養心顆粒組和依那普利組大鼠外周血MMP-2明顯下降，TIMP-2明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；養心顆粒組與依那普利組大鼠外周血MMP-2、TIMP-2比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比較 (±s) 單位：ng/mL

2.3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量變化 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，養心顆粒組和依那普利組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；養心顆粒組與依那普利組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量比較 (±s) 單位：pg/mL

2.4 養心顆粒對大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織NF-κBp65和p-IκBα蛋白相對表達均明顯升高，IKK-β和IκB-α蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，養心顆粒組和依那普利組大鼠心肌組織NF-κBp65和p-IκBα蛋白相對表達均明顯降低，IKK-β和IκB-α蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；養心顆粒組與依那普利組大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2、表3。

圖2 各組心肌細胞NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達條帶圖

表3 各組大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達比較 (±s) 單位：ng/mL

3 討 論

心室重構是慢性心力衰竭的主要病理基礎。心室長期負荷過重，心肌收縮與舒張功能下降，不能維系正常的心排血量，導致心室發生代償性形態的改變[6]。大量研究表明，中藥復方可以通過多靶點、多信號通路改善梗死后的心室重構[7-8]。《金匱要略》中最早對此提出了“胸痹”“心水”“支飲”的概念，根據本課題組的臨床經驗，心室重構的病人多見氣虛血瘀，其次為氣陰兩虛，少見痰阻血瘀證、氣滯血瘀證和陽虛水泛證。根據心神失養、氣虛血瘀的病機，周亞濱教授擬方養心顆粒用于臨床多年，療效及安全性頗佳[9]。

養心顆粒基礎方來源于《證治準繩·雜病證治類方》之養心湯，由養心安神藥與補氣活血藥組成，主治心虛血少、驚惕不寧。方中人參、黃芪為君藥，人參定志安神、益肺補脾，黃芪益衛固表、補氣升陽。臣藥為白茯苓、茯神、川芎和當歸。白茯苓與茯神兩藥合用寧心安神；川芎行氣活血、止痛祛風，當歸補血活血，兩藥合用補血養心。佐為遠志、半夏、五味子、辣桂、酸棗仁、柏子仁。遠志可安神寧心、祛痰開竅；半夏燥濕化痰，以散擾心之痰涎；五味子生津斂汗、安神寧心，以收攝耗散之心氣；辣桂助陽補心，加強補氣之功效，可引諸藥入心經；酸棗仁、柏子仁兩藥合用安神養心、補斂心氣。使藥為炙甘草，可和胃補脾，益氣復脈，奏補土養心之效，助參芪成益氣之功。

心肌組織細胞外基質降解在心室重構過程中扮演著重要角色。MMP-2是MMPs家族重要的成員之一，是能特異性地使細胞外基質降解的蛋白水解酶，TIMP-2可抑制MMP-2的活性，進而降低心肌組織細胞外基質的降解[10-12]。因此，MMP-2/TIMP-2存在一個動態的平衡，這個動態的平衡對維持心肌組織的完整結構和穩態內環境具有重要的生理意義[13]。本研究結果表明，養心顆粒可以明顯降低細胞外基質的降解，部分恢復心室重構過程中MMP-2/TIMP-2的失衡。

炎癥反應是AMI后心室重構的發病機制中的關鍵環節[14]。炎性細胞因子受到細胞內外環境改變的刺激而激活后，促進下游炎性信號通路的啟動與傳導，進而誘導心室重構的發生與發展[15]。TNF-α、白細胞介素類(ILs)等炎性細胞因子在心肌組織中的大量堆積，會降低心肌收縮力，并能導致心肌組織血管內皮的損傷，使流經心肌組織的血液處于高凝狀態。由此可見，此類炎性因子在心肌組織中蓄積水平是衡量心室重構嚴重程度的重要客觀指標。與此同時抑制炎性反應也是心室重構的主要治療手段之一[16]。

IKK/IκB/NF-κB信號通路介導了AMI后心肌細胞的炎癥反應和凋亡，是梗死后心室重構逐漸形成過程中的主要發病機制[17]。NF-κB是一類心肌細胞內具有多項轉錄功能的蛋白，其中NF-κBp65是其主要的活性形式。生理狀態下，IκB與NF-κBp65在胞漿中結合成無活性的三聚體[18]。AMI發病后，刺激信號由心肌細胞外的IKK介導，活化的IKK復合物使IκB分子N端第32位和第36位的Ser磷酸化，導致IκB的分子結構改變，p-IκB與NF-κB p65的三聚體解離，釋放出游離的NF-κB p65進入心肌細胞核調控多個炎性相關靶基因的轉錄[19]。同時，細胞核內促炎性基因的高表達，進一步促進了相關炎性因子(如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)的合成和釋放，導致心肌組織進一步損傷，這就形成了炎性因子激活和核內轉錄的惡性循環。因此，多靶點治療抑制心肌細胞炎性連鎖反應對抗心室重構的治療就顯得格外重要，這也是中醫藥多靶點起效的優勢所在[20]。

本實驗結果得出，養心顆粒可以通過降低心肌組織的炎性細胞因子水平同時抑制IKK/IκB/NF-κB信號的傳遞來緩解AMI后的心室重構，其作用效果與依那普利相當。