心肌梗死大鼠奧美沙坦酯灌胃后AT1受體和gp91phox表達變化的實驗研究

劉建云，司曉燕，徐 鵬，李 勛

左室重構系心肌梗死(MI)后非梗死部位心肌細胞日趨肥大，間質進行性纖維化，左室不斷擴張所造成的，其后果是導致左室收縮功能下降，進而出現心力衰竭[1]。雖然心肌梗死后介入治療及新型藥物的使用對心肌梗死后心功能有一定的改善，但心肌梗死后心功能減退仍然是危害重大的公眾健康問題[2]。探究心肌梗死后左室重構機制，對于預防心肌梗死后左室重構，防止心力衰竭的發生發展及改善心肌梗死病人的預后至關重要。腎素-血管緊張素系統(RAS)已被證實以超氧陰離子自由基(O2-)為媒介誘導左室重構，而尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)也被多項研究證實在心肌梗死后左室重構中發揮重要作用[3-5]。而RAS與NOX之間及其與左室重構之間的聯系目前尚未清晰。本研究通過檢測心肌梗死大鼠灌胃奧美沙坦酯(OLM)后，非梗死部位心肌組織中的血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)1型(AT1)受體mRNA、NOX亞單位中gp91phoxmRNA及其蛋白的表達程度、O2-濃度、NOX活性，并進行線性相關分析，旨在探究RAS和NOX在心肌梗死后表達的變化及二者之間的聯系，及其對左室重構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol、逆轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的引物序列、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPHD)均購于Invitrogen生命技術公司(美國)；O2-及NOX檢測試劑盒均購自碧云天生物試劑有限公司(中國)；蛋白預染Marker、免抗-NOX2/gp91phox、HRP-Goat anti-Rabbit IgG均購自KPC公司(美國)；無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠，體質量270～380 g，購自蘇州大學附屬第一人民醫院動物實驗中心。

1.2 大鼠心肌梗死模型制備 大鼠稱重后隨機分為對照組、奧美沙坦酯組、安慰劑組。3%戊巴比妥(2 mL/kg)腹腔注射，全身麻醉后開胸，對照組僅用5-0線穿繞而不結扎左前降支(LAD)血管，其余兩組用5-0線結扎LAD，建立心肌梗死模型，奧美沙坦酯組于術后第2天予奧美沙坦酯(10 mg/kg，每天1次)灌胃4周；安慰劑組經灌胃注入等容積蒸餾水4周。

1.3 檢測左室質量指數(LVMI) 4周后共25只大鼠存活，其中對照組10只，安慰劑組6只，奧美沙坦酯組9只。稱重后摘出心臟并留取左室，可見梗死區為灰白地圖狀梗死灶(見圖1)，稱重。計算LVMI：LVMI=左室質量(mg)÷體質量(g)。

圖1 各組左室標本(左室前壁觀)

1.4 檢測AT1受體mRNA及NOX亞單位gp91phoxmRNA表達程度 將左室的非梗死部位中心肌組織的總RNA提取出后，以qRT-qPCR法檢測。引物序列，①AT1受體：正向引物GAGTCCTGTTCCACCCGATCACCGATCAC，反向引物GGATGACGCCCAGCTGAATCAGCACATCC，擴增長度1 046 bp；②gp91phox：正向引物CAGCCTGCCTGAATTTCAACT，反向引物GGAGAGGAGATTCCGACACACT，擴增長度254 bp；③β-actin：正向引物CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反向引物 TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，擴增長度241 bp。反應體系如下：待檢測cDNA模板2 μL，靶基因AT1受體或gp91phox和β-actin正向、反向引物各2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)25 μL，單蒸水18 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)1 μL。兩步法PCR擴增條件：95 ℃，30 s，1個循環，完成預變性；95 ℃，5 s變性后退火，60 ℃，34 s，40個循環。使用熒光實時定量功能PCR儀來跟蹤反應，應用軟件(Real-Time PCR System)繪出各組基因的擴增、溶解曲線。采用2-△△Ct法分析各組基因表達程度的變化[6]。

1.5 NOX亞單位gp91phox蛋白表達分析 裂解左室中非梗死部位的心肌組織后離心，提純蛋白并測定其濃度。將電泳之后的所有樣本轉膜到備好的硝酸酯纖維素膜，使用雙蒸水來洗膜，10 min×3次將免抗-Nox2/gp91phox(一抗)和GAPHD予封閉液稀釋(1∶100)。分別將轉膜后樣本放至上述稀釋液中，并置于4 ℃恒溫搖床上孵育過夜，再次洗膜，5 min×3次，將膜置于用封閉液稀釋的HRP-Goat anti-Rabbit IgG(二抗)溶液(1∶500)中，搖床25 ℃恒溫孵育2 h，再洗膜5 min×3次。加入發光底物膠片感光顯影后，采用凝膠分析軟件測算條帶灰度，得出所測蛋白同GAPHD的灰度比值。

1.6 O2-濃度及NOX活性的檢測 采用WST-1還原法。裂解左室中非梗死部位的心肌組織后離心取出上清液，檢測A450(450 nm波長處的吸光度)，計算公式：O2-濃度=A450÷蛋白含量(RLU/mg)。然后加入NADPH試劑(1 mmol/L)5 μL再測A450。計算公式：NOX活性=[加NADPH后A450-加NADPH前A450]÷蛋白含量(RLU/mg)。

2 結 果

2.1 LVMI比較 安慰劑組LVMI高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組指標比較

2.2 AT1受體mRNA及gp91phoxmRNA表達程度比較 安慰劑組AT1受體mRNA的表達程度高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)；安慰劑組gp91phoxmRNA的表達程度高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.3 gp91phox蛋白表達程度比較 安慰劑組gp91phox蛋白同內參GAPHD的灰度比高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

圖2 3組gp91phox及內參GAPHD蛋白的表達

2.4 O2-濃度及NOX活性比較 安慰劑組O2-濃度高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)；安慰劑組NOX活性高于對照組及奧美沙坦酯組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

2.5 gp91phoxmRNA和AT1受體mRNA表達程度、O2-濃度和NOX活性及gp91phoxmRNA之間的相關性分析 gp91phoxmRNA和AT1受體mRNA呈正相關(r=0.729，P<0.05)，O2-濃度和NOX活性呈正相關(r=0.843，P<0.05)，O2-濃度和gp91phoxmRNA亦呈正相關(r=0.735，P<0.05)。

3 討 論

心肌梗死發生后激活RAS和NOX以維持血流動力學的穩定，然而他們被激活后同時引發了非梗死部位心肌肥厚、心腔擴大、收縮力降低、順應性下降，進一步引發心力衰竭，嚴重時可致死亡[7-8]。激活后的RAS加速了AngⅡ的合成，而幾乎所有的AngⅡ參與心血管調節作用的必經之路就是AT1受體，因此，AT1受體的含量會在心肌梗死后增多，本研究中安慰劑組非梗死部位的組織中AT1受體mRNA的表達程度高于對照組，也證實了這一點。亦有研究發現心肌梗死后非梗死部位的心肌組織中AT1受體密度也會增大[9]。此外，本研究還得出安慰劑組非梗死部位的NOX活性和O2-濃度均較對照組升高；且NOX亞單位gp91phoxmRNA和蛋白表達程度較對照組均升高，由此推測，AT1受體及NOX于心肌梗死后合成均增多。曾有研究發現NOX可間接被AngⅡ激活，而具體途徑尚不明確[10]。本研究中，安慰劑組大鼠非梗死部位中AT1受體mRNA與gp91phoxmRNA的表達程度呈正相關，提示AT1受體及NOX之間并不是孤立的，而且本研究中O2-濃度亦與gp91phoxmRNA的表達程度及活性均呈正相關，因此認為心肌梗死后被激活的RAS產生了過多的AngⅡ，由AT1受體介導作用于NOX亞單位gp91phox，從而使NOX合成增多且活性增高，進而產生過量O2-。心肌重構系過多的O2-導致心肌氧化應激反應加劇，進而引發細胞膜和細胞內蛋白均被破壞，因此加快了心肌細胞的壞死甚至凋亡，此結論早已被證實[11]。該研究中，安慰劑組大鼠LVMI高于對照組，且先前的研究明確了LVMI和NOX活性之間存在正相關，故測定NOX活性可用來評估心肌梗死后心臟發生左室重構的嚴重程度[5]。心肌梗死后，NOX激活產生的過量O2-參與了左室重構的發生發展過程，而且起到了舉足輕重的作用，而RAS系統激活后產生的AngⅡ是心肌梗死后NOX被激活的重要源頭，AT1受體與NOX亞單位gp91phox之間的聯系可能是心肌梗死后NOX被AngⅡ激活的重要通路。

本研究發現，奧美沙坦酯組非梗死部位的心肌組織中，AT1受體mRNA的表達程度低于安慰劑組，提示奧美沙坦酯除可阻斷AT1受體外，還能通過減少AT1受體的數目來產生效應，曲秀芬等[12]的研究也得出了相似結論。此外，本研究中奧美沙坦酯組大鼠予奧美沙坦酯灌胃4周后，非梗死部位的心肌組織中gp91phoxmRNA及其蛋白的表達程度、NOX活性及O2-濃度同安慰劑組相比均減低。有研究在心肌梗死面積相似的前提下敲除大鼠gp91phox基因，發現敲除后大鼠左室重構程度較野生型明顯減輕[13]。從本研究大鼠解剖得到的左室標本也可以看出，安慰劑組較對照組左室前壁梗死灶變成灰白色，明顯變薄呈地圖狀，切開后幾乎僅見到纖維組織，非梗死部位的心肌較對照組明顯肥厚，左心腔內徑大于對照組，且該組LVMI較高，顯而易見，左室發生了重構；而奧美沙坦酯組與安慰劑組相比，左室心肌纖維化區域面積明顯縮小，左心腔內徑無明顯擴大，且LVMI較低，左室重構程度較輕。至此，RAS系統可以激活NOX被進一步證實，AT1受體被奧美沙坦酯阻斷后能使NOX的表達程度減低，并使其活性下降，致使O2-的產生減少，從而延緩左室重構。

心肌梗死后，RAS和NOX介導的左室重構在進行性的心力衰竭的演化過程中均扮演著關鍵性的角色。心肌梗死使RAS系統激活后，AT1受體數量及密度均增加，過量的AT1受體作用于NOX亞單位gp91phox，進一步激活NOX，二者協同作用造成左室重構程度加劇，而奧美沙坦酯可抑制這一過程。雖然RAS系統抑制劑的廣泛應用使心肌梗死后心力衰竭病人得到獲益，但心力衰竭仍是世界范圍內高發且危害重大疾患之一，而NOX抑制劑仍在研發中。本研究證實了RAS系統可以激活NOX，使心肌梗死后左室重構機制得到進一步充實，使NOX的調節及其在左室重構過程中的作用更加明朗，強化AngⅡ阻滯劑應用可能會使心肌梗死后的左室重構得到進一步延緩、抑制甚至逆轉。