circ_HECTD1在癲癇模型細胞中的表達及其對細胞凋亡和炎癥反應的影響

呂麥扣，席 聰

癲癇是一種中樞神經系統(tǒng)慢性疾病，由腦部神經元同步化異常放電導致，臨床表現(xiàn)的主要特征為短暫性、反復性、發(fā)作性和刻板性，目前仍缺乏有效的預防和治療措施[1]。神經元損傷是癲癇發(fā)作的最終結果，也是引起癲癇再發(fā)及形成難治性癲癇的主要原因[2]。因此，尋找有效的減輕神經元損傷的方法具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)是一類具有5′末端帽子和3′末端 poly A尾結構的單鏈環(huán)狀、共價閉合的非編碼RNA，可通過多種機制廣泛調控多種疾病的進程[3-4]。研究表明，circRNAs與中樞神經系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。含HECT結構域的E3泛素鏈接酶(HECT domain E3 ubiquitin ligase，HECTD1)在多種細胞中均有表達，且發(fā)揮多種功能[6-7]。研究顯示，在小鼠短暫性大腦中動脈閉塞模型中，缺血腦組織中circ_HECTD1表達升高，急性缺血性腦卒中病人血漿樣本circ_ HECTD1表達升高，抑制circ_HECTD1表達可減少梗死面積，減輕神經元損傷[8]。circ_HECTD1對癲癇的影響及機制尚未明確。因此，本研究建立無鎂癲癇模型細胞，檢測沉默circ_HECTD1表達對海馬神經元細胞活力、凋亡率及炎性因子表達的影響，并進一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康的24 h新生SD大鼠，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物操作按照西安交通大學實驗動物倫理要求進行。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、蛋白酶K均購自美國Gibco公司；四唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司；DNA斷裂的原位末端標記法(TUNEL)試劑盒購自德國Roche公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均購自碧云天生物技術有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、cleaved caspase 3和核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)/p65抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；circ_HECTD1小干擾RAN(si-circ_HECTD1)、小干擾RNA陰性序列(si-NC)購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 海馬神經元的原代培養(yǎng) 取新生24 h的SD大鼠，75%乙醇消毒全身，無菌條件下斷頭取腦，置于解剖液中，光學顯微鏡下使用解剖鑷分離海馬組織，剔除掉腦膜和血管，眼科剪將組織剪成小塊(1 mm3)，加等體積的胰酶消化5 min，期間輕搖2次，用含10%血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，反復吹打至無肉眼可見的團塊。細胞經70 μm濾篩過濾，4 ℃離心，棄掉上清，加入神經元培養(yǎng)基，巴氏管吹打混勻，調整細胞濃度為4×105個/mL，接種于經多聚賴氨酸(0.1 mg/mL)包被的培養(yǎng)皿中，置于5%體積分數(shù)CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)12～24 h后，更換為神經元維持培養(yǎng)基，之后每3～4 d換液1次，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，將生長良好的神經元細胞作為實驗材料。

1.3 實驗分組及癲癇模型的建立 實驗分為4組。對照組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經元，正常細胞外液洗滌(1 min×3次)，加入正常細胞外液，于5 %體積分數(shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，更換為維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂致癇組(無鎂組)：取培養(yǎng)10 d的原代海馬神經元，無鎂細胞外液洗滌(1 min×3次)，于5%體積分數(shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h進行無鎂誘導，恢復維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂+si-NC組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經元，加終濃度為100 nmol/L的si-NC，反應30 min進行無鎂誘導，恢復維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂+si-circ_HECTD1組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經元，加終濃度為100 nmol/L的si-HECTD1，反應30 min進行無鎂誘導，恢復維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測circ_HECTD1、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)表達 應用Trizol法提取細胞總RNA，ODNano Drop 2000分光光度計檢測RNA濃度，OD260/OD280比值在1.8～2.0以內且純度合格RNA用于實驗。按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA。按照試劑盒說明配置PCR反應體系及設置反應條件，其中反應體系為20 μL，所用引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。每組設置5個復孔，以GAPDH作為內參基因，以所得Ct均值，采用2-△△Ct法計算circ_HECTD1、IL-6和IL-1β基因表達。實驗重復3次。

1.5 MTT比色法檢測細胞活力 以1×105個/mL密度接種各組神經元細胞于96孔板，每孔100 μL細胞懸液，細胞培養(yǎng)至單層鋪滿孔底時，向每孔中加MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除孔內培養(yǎng)液，在每孔中加150 μL的DMSO，放置于搖床上低速震蕩10 min使結晶溶解充分。酶標儀測定波長為490 nm處的吸光度值(OD)。每組設置5個復孔，實驗重復3次。

1.6 TUNEL法檢測細胞凋亡 種植海馬神經元細胞懸液(1×105個/mL)于包被過的細胞爬片上，按照分組處理培養(yǎng)，然后進行TUNEL染色。細胞爬片樣本經固定液固定1 h、蛋白酶K處理15～30 min及封閉液處理10 min后，使用濾紙吸干爬片上的水分。在爬片上滴加50 μL的TUNEL反應液，置于37 ℃、暗室、濕盒加蓋孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌。在爬片上滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，5 min后吸出，PBS洗滌。在爬片上滴加15 μL的抗淬滅劑封片。熒光顯微鏡下計數(shù)死亡神經元數(shù)目。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3和NF-κB/p65表達 收集各處理組細胞，每孔加適量含PMSF的RIPA細胞裂解液，放置于冰上反應15 min，轉移細胞至離心管，4 ℃離心，收集上清，上清即為細胞總蛋白。應用BCA法測定蛋白濃度。按照4∶1比例將總蛋白與5×上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。根據(jù)蛋白樣品濃度計算上樣體積，經SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，倒去封閉液，加一抗稀釋液(1∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax、cleaved caspase3和NF-κB/p65抗體)，4 ℃孵育過夜，洗膜。加二抗稀釋液(1∶2 000稀釋的HRP標記抗體)，置于搖床上孵育1.5 h，洗膜。膜含蛋白面滴加ECL顯色液，曝光、顯影、定影，Image J軟件分析灰度值。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 circ_HECTD1在癲癇模型細胞中的表達 與對照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組circ_HECTD1表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組circ_ HECTD1表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組circ_HECTD1在癲癇模型細胞中的表達比較 (±s)

2.2 沉默circ_ HECTD1表達對無鎂誘導的神經元細胞活力和凋亡的影響 與對照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組細胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組細胞活力明顯升高，凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組神經元細胞活力和凋亡率比較 (±s)

P<0.05。

2.3 沉默circ_ HECTD1表達對無鎂誘導的神經元細胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3表達的影響 與對照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組Bcl-2表達明顯降低，Bax和cleaved caspase 3表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組Bcl-2表達明顯升高，Bax和cleaved caspase 3表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 各組神經元細胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3表達條帶圖

表3 各組神經元細胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3的蛋白相對表達量比較 (±s)

2.4 沉默circ_ HECTD1表達對無鎂誘導的神經元細胞IL-6和IL-1β表達的影響 與對照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組IL-6和IL-1β表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組IL-6和IL-1β表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組神經元細胞IL-6和IL-1β表達比較(±s)

P<0.05。

2.5 沉默circ_ HECTD1表達對無鎂誘導的神經元細胞NF-κB/p65表達的影響 與對照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組NF-κB/p65表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組NF-κB/p65表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 各組神經元細胞NF-κB/p65表達條帶圖

表5 各組神經元細胞NF-κB/p65的蛋白相對表達量比較 (±s)

P<0.05。

3 討 論

circRNA是一種環(huán)形非編碼RNA，可通過抑制miRNA的功能參與炎癥、神經系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，在人體各組織中，腦組織circRNA含量最高[11]。在神經發(fā)育過程中，在大腦的各部位circRNA水平均較高，提示在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中circRNA可能發(fā)揮重要作用[12-13]。神經細胞損傷包括凋亡和壞死，神經細胞損傷是癲癇發(fā)生發(fā)展的一個重要原因[14-15]。在癲癇發(fā)作后，部分神經元損傷可通過調控Bcl-2/Bax、caspase家族等與凋亡相關的基因途徑實現(xiàn)[16]。Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用抑制細胞凋亡，而Bax發(fā)揮促凋亡作用促進細胞凋亡。Bcl-2量大于Bax量時可抑制細胞凋亡，反之細胞凋亡增加[17]。caspase 3是caspase家族成員之一，發(fā)揮核心作用，其活化后可引起細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，無鎂誘導的神經元細胞中circ_HECTD1表達升高，細胞活力降低，凋亡率升高，而抑制circ_HECTD1表達細胞活力增加，凋亡率降低，提示circ_HECTD1表達升高可能是引起神經元細胞損傷的原因之一。

多項研究表明，腦部炎癥是癲癇形成及發(fā)作的一個重要機制，癲癇和炎癥間存在相互作用[19]。有研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎性因子及相關受體參與癲癇發(fā)作[20]。在大腦中IL-1β及其受體分布廣泛，尤其在海馬中密度最高，有研究報道，在癲癇發(fā)作前IL-1β已升高，且持續(xù)至癲癇活動結束，提示IL-1β可能通過增加神經元敏感性，從而促進癲癇發(fā)生[21]。IL-6是一種糖蛋白，由中樞神經系統(tǒng)產生，在正常狀態(tài)下，IL-6濃度很低，而在神經元異常活動或中樞神經系統(tǒng)損傷時IL-6可大量產生，有研究顯示，在癲癇發(fā)作后，血清中IL-6濃度增加，提示IL-6可能通過影響神經元從而提高癲癇的易感性[22]。有研究顯示，急性缺血性腦卒中circ_HECTD1表達與IL-6、TNF-α等促炎因子相關[23]。本研究結果顯示，抑制circ_HECTD1表達可明顯降低無鎂誘導的神經元細胞IL-1β和IL-6表達。提示抑制circ_HECTD1表達可降低癲癇炎癥反應。

NF-κB是一類可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列結合的蛋白因子，p50/p65異源二聚體是該家族成員之一，也是發(fā)揮主要作用的因子，在神經細胞中廣泛存在，特別是大鼠海馬及皮質區(qū)域[24]。多項研究表明，NF-κB的過度活化可參與急性炎癥過程，參與突觸可塑性變化、神經元凋亡等過程，其過度激活可加重癲癇的發(fā)病[25]。本研究結果顯示，抑制circ_HECTD1表達可明顯降低無鎂誘導的神經元細胞NF-κB/p65表達。

綜上所述，抑制circ_HECTD1表達可降低無鎂誘導的海馬神經元細胞凋亡及炎癥反應，其機制可能與抑制NF-κB信號的過度活化有關。目前，circ_HECTD1對癲癇的影響研究較少，值得進一步深入探究。