表達的影響

許方方，張 珊，李建玲，蔣 淼

認知功能障礙是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)特征性的臨床表現。人參皂苷Rb1是人參主要活性成分，通過抑制炎癥反應、激活抗凋亡相關通路，從而保護腦細胞功能、改善學習記憶[1-2]。研究發現，臨床常用的吸入性麻醉藥物以及手術創傷刺激可以加重或誘發AD臨床前期、臨床期病人的認知功能障礙[3-5]。本研究通過圍術期給藥，觀察人參皂苷Rb1對APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠肝葉部分切除術后認知功能以及海馬內突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density proteinP-95，PSD-95)、神經元尼氏體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3月齡APPswe/PS1dE9雙轉基因雄性小鼠，體質量30 g，由南京大學動物模式中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。

1.2 主要試劑和儀器 Morris水迷宮裝置(上海吉量軟件科技有限公司)；人參皂甙Rb1(純度>95%，批號：17080421)購自上海同田生物技術有限公司，經生理鹽水稀釋后備用；小鼠單克隆PSD抗體(1∶1 000，Abcam)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，Aggen)。

1.3 分組 本實驗已經通過上海市寶山區仁和醫院倫理委員會的倫理論證(編號：201812)，并在其監督下進行。將3月齡APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠120只隨機分為3組，每組40只，手術組(S組)：小鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥 0.3 mg/kg，麻醉后行肝葉部分切除術；人參皂甙Rb1 組(Rb1 組)：術前5 d注射人參皂甙60 mg/kg；對照組(N組)：術前5 d注射同體積的生理鹽水。從以上各組中隨機抽取8只小鼠，采用Morris水迷宮檢測術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d學習記憶能力。剩余APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠同樣在術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d時間點取標本行蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測海馬內PSD-95的表達及尼氏染色分析尼氏體累積光密度值(IOD)。

1.4 Morris水迷宮行為學測試 實驗程序包括：①定位航行實驗(place navigation)用于測量小鼠獲取空間學習記憶的能力。將小鼠從4個入水點隨機放入水中，通過自動錄像系統記錄小鼠90 s內找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)。②空間探索實驗(spatial probe test)用于測量小鼠對平臺空間位置記憶的能力。拆除平臺，將小鼠從離平臺最遠的象限放入水中，記錄90 s內小鼠在原目標象限的時間百分比。

1.5 手術處理 小鼠翻正反射消失后，消毒，在劍突下腹部正中線切開，進入腹腔游離肝臟左側葉，在遠端蒂部用一號絲線結扎切除肝左側葉。

1.6 尼氏染色 腹腔注射戊巴比妥深度麻醉小鼠，迅速開胸暴露心臟，經左心室向主動脈插管，剪開右心房，甲醛50 mL經升主動脈快速沖洗，斷頭，液氮速凍組織切片(5 μm)4 ℃丙酮固定15 min，純蒸水沖洗3次，每次5 min，用1%甲苯胺藍水溶液置50 ℃溫箱中染色30 min，純蒸水沖洗3次，每次5 min，95%乙醇迅速分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照分析，并用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析尼氏體IOD值。

1.7 Western Blot檢測 在各時間點將小鼠麻醉后斷頭，冰上取海馬組織，經0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，置于含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA裂解液)中裂解，離心后取上清液，部分上清液用于蛋白質濃度的測定(BCA法測定)，余上清液置100 ℃煮沸變性結束后，上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、加一抗孵育過夜，HRP標記二抗處理。ECL發光液孵育、膠片曝光、顯影、定影。用BIO-RAD Quantity One 4.5.0軟件檢測目的蛋白PSD-95的條帶及內參β-acting條帶的灰度值，將目的蛋白灰度值和內參灰度值的比值作為目的蛋白表達的相對水平。

2 結 果

2.1 水迷宮實驗結果 與Rb1組比較，S組和N組術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d平均逃避潛伏期延長(P<0.05)；S組和N組術后各時間點平均逃避潛伏期比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1A。與Rb1組比較，S組和N組術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d目標象限時間百分比及游泳距離明顯縮短(P<0.05)，詳見圖1B、圖1C。各組之間小鼠游泳速度比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1D。

與S組同時間點比較，# P<0.05；與N組同時間點比較，＊ P<0.05。

2.2 尼氏染色結果 Rb1組小鼠術后7 d、14 d、21 d、28 d海馬CA1區神經細胞排列密集，胞漿中尼氏體豐富；與Rb1組比較，S組和N組術后21 d、28 d神經元內尼氏小體部分溶解或消失，胞漿著色變淡神經元細胞排列紊亂，尼氏體表達明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

與Rb1組同時間點比較，＊ P<0.05。

圖2 APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠術后海馬CA1區尼氏染色結果(×400)

2.3 Western Blot檢測3組PSD-95蛋白表達 與Rb1組比較，S組和N組術后3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d PSD-95蛋白表達逐漸降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；S組和N組比較，術后3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d PSD-95蛋白表達，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖4。

與Rb1組同時間點比較，＊ P<0.05。

3 討 論

β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)的沉積，tau 蛋白高磷酸化是AD特征性病理改變。研究發現，手術創傷刺激引起的中樞神經系統炎性因子高表達可以誘發和加劇Aβ的異常聚集[5]。揮發性麻醉藥物(異氟醚、地氟烷)通過上調Aβ前體蛋白切割酶β分泌酶(BACE)的活性，促進Aβ寡聚化進而誘導神經細胞凋亡[6-7]。圍術期低溫使神經元骨架蛋白tau蛋白過度磷酸化，造成神經元丟失，進而提示手術麻醉有可能是誘發和加劇AD高風險人群發病的潛在因素[8]。在本實驗中，手術組及對照組AD模型小鼠術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d逃避潛伏期逐漸延長、目的象限時間百分比縮短，提示術后認知功能異常。人參皂苷是人參的生物活性成分之一，已發現大約有50多種，其中Rb1主要作用在中樞神經系統，對免疫細胞、細胞因子、一氧化氮、活性氧(ROS)等炎癥介質均有抑制作用，通過多種途徑不同環節在增強免疫力、活血、抗氧化、延緩衰老等方面發揮著重要的藥理作用[9-13]。研究發現，人參皂苷Rb1通過改變β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)裂解途徑，減少Aβ的生成，抑制Aβ誘導的神經毒性反應[14]；通過抑制細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達，激活抗細胞凋亡因子Bcl-2，保護神經元細胞從而改善癡呆鼠的認知功能[2]。因此，從理論上講，人參皂甙Rb1有可能成為治療AD病人術后認知功能下降的潛在藥物。既往研究顯示，人參皂甙Rb1在60 mg/kg時可以有效改善老年鼠術后認知功能下降[15]。本研究結果顯示，與手術組及對照組同時間點比較，人參皂甙Rb1組小鼠術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d找到安全平臺的逃避潛伏期明顯縮短，提示通過圍術期給藥，人參皂甙Rb1可以改善AD模型小鼠術后的記憶功能。

學習記憶與海馬內突觸相關蛋白表達水平密切相關，PSD-95位于突觸后膜與F-actin骨架蛋白、神經遞質受體和信號蛋白分子共同形成復合物參與突觸后信號的轉導和整合[16]。因此，本實驗采用Western Blot檢測海馬內PSD-95的表達水平，結果顯示，與Rb1組比較，手術組及對照組術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d PSD-95蛋白條帶密度逐漸變小變淺，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示人參皂甙Rb1在保護突觸功能及防止突觸丟失中起重要作用。

神經元尼氏小體是反映神經元功能變化的重要指標，當神經元功能受損時，尼氏小體會溶解甚至消失。研究發現，人參皂甙Rb1可以通過上調神經元周期蛋白D1(Cyclin D1)表達、激活非磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路，進而保護神經元細胞的活性[17-18]。在本實驗中，尼氏染色結果顯示，人參皂甙Rb1組小鼠術后7 d、14 d、21 d、28 d海馬CA1區神經元細胞排列密集、整齊，胞漿中尼氏體豐富，提示神經元活性功能正常，而手術組與對照組術后21 d、28 d小鼠海馬CA1區神經元細胞排列紊亂，尼氏體表達減少。據此推測，人參皂苷Rb1通過誘導尼氏體的表達，進而維持神經元細胞形態和功能的穩定性。

綜上所述，人參皂甙Rb1可能通過誘導突觸相關蛋白PSD-95及神經元尼氏體的表達，改善突觸結構，保護神經元活性，提高AD模型小鼠術后學習記憶能力。