miR-30家族在心肌缺血再灌注損傷中作用的研究進展

劉思娜，仇盛蕾，劉鑫毅，周瑩潔，楊悅文，尚菊菊

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI)是指心肌持續缺血后，恢復血液灌注，雖然使大部分瀕臨壞死的心肌得以恢復，有效限制了心肌梗死范圍及心室重構，但也會導致心肌頓抑、室性心律失常、微血管功能障礙甚至心肌細胞死亡、心力衰竭等不良事件的發生，造成部分心肌損傷進行性加重的現象[1-3]。研究表明，最終心肌梗死面積中有高達50%的部分與MIRI的發生有關[4]。MIRI嚴重影響了急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)病人再灌注治療的臨床效果和預后，尋求防治MIRI的有效措施已成為目前研究的重要目標之一。

目前，MIRI的發生機制尚未完全闡明，研究證實其與氧化應激、鈣超載、自噬、細胞凋亡和壞死等密切相關[5]。隨著對疾病認識的深入及技術的發展，針對疾病治療的研究現已擴展到微觀分子水平。微小RNA(microRNA，miRNA)作為表觀遺傳學的一部分已成為新的研究熱點[6]。研究發現，多種miRNA具有心肌保護作用，其中microRNA-30(miR-30)家族是心肌中表達最豐富的miRNA物種之一，其表達水平與MIRI密切相關[7]。現就有關miR-30家族在MIRI中作用的研究進展進行綜述。

1 miR-30家族概述

miR-30家族是miRNA家族中的一個重要成員，由miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e組成，miR-30c又分為miR-30c-1和miR-30c-2，由位于人類染色體1、6和8的6個基因編碼，并在5′端共享一個種子序列，但在3′端有不同的補償序列，這使得miR-30家族成員可以針對不同的基因和途徑執行不同的生物學功能[8-9]。一系列研究表明，miR-30家族在MIRI的自噬、凋亡、壞死等病理過程中發揮不同程度的調節作用[10-14]。研究顯示，miR-30家族在AMI病人或小鼠梗死心肌及心肌細胞缺氧模型中均表達上調[15-17]；而在MIRI病人或小鼠缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌及心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型中表達下調[10，18]。當miR-30家族表達水平失調時，可通過調節不同的靶基因來介導相應的機制；相應的，通過調控miR-30家族的水平來調節基因的表達，可達到減少MIRI的目標。miR-30家族在MIRI治療中的應用日益成為研究熱點。

2 miR-30家族參與MIRI的機制研究

2.1 miR-30家族調節心肌細胞自噬 既往研究發現，自噬參與了MIRI的病理過程。研究表明，在早期心肌缺血階段，自噬對于缺血心肌具有一定的保護作用，幫助細胞度過能量危機；而再灌注期間由于自噬相關蛋白Beclin-1的過度表達，自噬被過度激活，進而導致必需的細胞成分過度降解，細胞損傷加重，從而促進了心肌細胞壞死的發生[19-20]。

關于miRNAs對自噬的調控作用的首次報道是在2009年，Zhu等[21]發現，在腫瘤細胞中自噬特異基因Beclin-1是miR-30a的潛在靶點，miR-30a可通過與Beclin-1的信使RNA3′端的序列(3′untranslated regions，3′UTR)結合，抑制Beclin-1基因表達，進而削弱自噬水平。曾召林等[22]研究報道miR-30家族參與了自噬的誘導激活、囊泡成核、囊泡延伸的不同階段。晏浩等[14]研究發現：在H/R心肌細胞中miR-30a表達水平明顯下降，Beclin-1蛋白及自噬標志蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3-β(microtubule-associated protein 1 light chain 3-β，MAP1 LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)與微管相關蛋白1輕鏈3-α(microtubule-associated protein1 light chain3-α，MAP1 LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ)的比值即LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加；同時過表達miR-30a可顯著抑制Beclin-1蛋白表達及LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化，進而減少自噬來減少心肌細胞死亡；過表達miR-30a還可減少Beclin-1 的C端片段Beclin-1C形成而抑制凋亡。此外，研究還闡述了在MIRI中自噬和凋亡兩種類型的細胞程序性死亡之間拮抗和協同關系的機制：①凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase)介導Beclin-1裂解形成的Beclin-1C，可抑制Beclin-1誘導的自噬，并通過促進線粒體釋放促凋亡因子來促進細胞凋亡[23]；②MIRI時激活的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)可促進Beclin-1與抗凋亡蛋白Bcl-2結合體的釋放而增加自噬[24]。

Yang等[25]發現：①在AMI病人血清和缺氧心肌細胞中，miR-30a高度富集，且可通過外泌體在心肌細胞間有效轉運；②抑制缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit，HIF-1α)抑制miR-30a上調；③抑制miR-30a或外泌體釋放可增加Beclin-1、自噬相關蛋白12(autophagy-related protein 12，Atg12)的含量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，從而維持心肌細胞缺氧后的自噬反應；④抑制miR-30a或外泌體釋放可減輕缺氧誘導的心肌細胞凋亡，但其具體機制有待進一步研究。此研究雖在缺氧細胞中進行，但表明了外泌體在miR-30a介導的自噬中的作用。

王竟靖等[26-27]研究發現：①相對于正常組，在缺氧條件下，miR-30a、Beclin-1和LC3-Ⅱ表達均上調(P<0.05)；與正常組和缺氧組比較，在復氧時，miR-30a表達下調，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達上調(P<0.05)，表明心肌細胞在缺氧條件下發生自噬，而在H/R過程中自噬進一步增強；②進一步研究發現，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)AK088388在H/R過程中表達上調，并可通過競爭性結合miR-30a，促進Beclin-1和LC3的表達，進而增強再灌注過程中自噬的發生，最終導致心肌細胞損傷。此研究表明了lncRNA在miR-30a介導的MIRI自噬中的作用。綜上所述，miR-30家族在MIRI自噬中的調節作用主要與miR-30a有關。在缺血再灌注階段，miR-30a的下調可導致Beclin-1表達的提高而引起過度自噬，從而加重細胞損傷；而過表達的miR-30a可下調Beclin-1而抑制自噬泡成核過程，進而減輕心肌細胞過度自噬，改善MIRI。此外，lncRNA AK088388可通過下調miR-30a而增強自噬進而加重MIRI。

在AMI病人血清和缺氧心肌細胞中，miR-30a、Beclin-1表達及自噬水平均上調；抑制miR-30a上調或外泌體釋放可導致Beclin-1表達水平的升高而進一步維持自噬反應。但如果進一步推測，缺氧條件下上調的miR-30a是否不影響Beclin-1表達及自噬水平，或者由于此階段的自噬主要與AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)有關[19]。故上調的miR-30a雖可導致Beclin-1表達下調，但下調程度不足以影響自噬，有待進一步研究。

2.2 miR-30家族調節心肌細胞凋亡和壞死 研究發現，缺血再灌注期間同時存在壞死和凋亡[28]。在缺血早期，凋亡是細胞死亡的主要形式，而在缺血晚期，大部分心肌細胞死亡是由缺血壞死引起的。miR-30家族不僅調控自噬，還參與細胞凋亡和壞死。

Li等[29]研究發現：①氧化應激(oxidative stress)時，miR-30家族的表達水平降低，而腫瘤抑制因子p53表達上調，p53可轉錄激活線粒體分裂蛋白——動力蛋白相關蛋白-1(dynamin-related protein 1，Drp1)，后者可引起線粒體外膜產生的碎裂片增多，并通過啟動線粒體分裂程序傳遞p53凋亡信號；②p53是miR-30家族的潛在靶點，miR-30家族可通過與野生型p53的3′UTR結合，抑制p53及其下游靶基因Drp1的表達來抑制線粒體分裂，進而抑制細胞凋亡。此研究雖然不是在MIRI模型中展開，但卻首先報道了miR-30家族影響心肌細胞凋亡的分子機制。

Forini等[13]研究發現：①在I/R大鼠心肌細胞中，三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)水平降低，而T3給藥可抑制三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)生成率和細胞色素C氧化酶(cytochrome-C oxidase，COX)活性的下降以及線粒體超氧化物歧化酶的升高，即T3可挽救線粒體的活性并限制超氧化物的形成，從而發揮抗線粒體氧化損傷的作用；②在I/R早期T3水平降低的同時，伴隨著miR-30a下調以及其靶點p53的上調，而p53可通過激活凋亡調節蛋白——Bcl-2相關蛋白(bcl-2-associated X protein，Bax)促進線粒體介導的細胞死亡，包括通過促進線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeablisation，MOMP)，進而促進細胞色素C(cytochromes C，Cyt-C)的釋放引起的細胞凋亡，以及通過驅動線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)導致線粒體內膜跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential，delta psi M，△Ψm)喪失，ATP耗竭而引起的細胞壞死，此外，p53可直接增強缺血后線粒體的損傷，從而驅動mPTP和細胞色素C的釋放而引起細胞死亡；③采用T3處理后可逆轉上述現象，而miR-30a基因敲除后可明顯抑制T3的調節作用，即T3可通過誘導miR-30a上調，抑制p53的激活，進而抑制Bax的過度表達，使得線粒體膜去極化受限，線粒體功能得以保留，凋亡和壞死程度降低，從而限制I/R損傷。總之，此研究提示一種由T3介導的以線粒體為靶點的通過調節miR30a/p53軸發揮心臟保護作用的新機制。

Wang等[12]研究表明，在過氧化氫處理后的心肌細胞和小鼠I/R心肌中，親環素D(cyclophilin D，CypD)水平升高，其基因的敲除可抑制心肌細胞壞死，并減少心肌梗死，保護缺血再灌注損傷的心功能；miR-30b水平降低，miR-30b過表達可降低CypD的表達，從而減少CypD介導的I/R心肌細胞壞死數量；轉錄因子E2F1水平升高，其可通過抑制miR-30b表達，上調CypD水平，進而促進心肌細胞壞死，而這些作用可被E2F1的下調所拮抗，即E2F1的敲除可通過在轉錄水平負調控miR-30b來抑制心肌壞死。總之，此研究結果揭示了一個由E2F1、miR-30b和CypD組成的新的心肌細胞程序性壞死調節通路。

因為CypD是mPTP的必需成分之一，故結合以上3項研究可以得出，miR-30家族可以通過調節線粒體形態和影響線粒體功能達到對MIRI的調控作用[12-13，29-31]。Kim等[32]研究發現：①在心肌梗死小鼠模型中，miR-30-5p家族的表達顯著下調(此結論與先前在缺氧時miR-30家族的表達上調的結論相反，有待進一步研究)；②單個miR-30-5p家族成員在缺氧條件下具有抗凋亡作用，并且直接靶標促凋亡基因Picalm和Skil；③Picalm和Skil的敲除顯著上調磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)和Bcl-2的表達，而顯著下調Caspase-3的表達。已有研究報道Skil可以直接結合并激活p53來誘導凋亡[33]。故此研究表明，過表達miR-30-5p家族可通過直接靶向抑制Picalm和Skil的表達來提高p-AKT和Bcl-2的表達水平，進而抑制Caspase-3的表達而減少心肌細胞凋亡；或者通過抑制Skil直接下調p53的表達，進而抑制心肌細胞凋亡，從而保護心肌細胞。雖然此研究并未在I/R模型中進行，但發現了miR-30-5p家族調控凋亡的新通路，提示研究時需要注意考慮miR-30家族亞型的獨特調節。

過表達的miR-30家族可通過減少其靶向因子p53、CypD、Picalm、Skil等的表達，進而抑制MIRI的細胞凋亡和壞死而保護心肌細胞。T3可以上調miR-30家族的表達，E2F1可以下調miR-30家族的表達。

2.3 miR-30家族與其他 Gambacciani等[18]研究發現，在活體大鼠心肌梗死和I/R模型中，miR30家族成員的水平下調，而DNA甲基轉移酶3a(DNA methyltransferase 3a，DNMT3a)的蛋白水平升高；同時過表達的miR-30c可通過直接與DNMT3a的3′UTR相互作用而導致DNMT3a酶在mRNA和蛋白水平上降低。此研究結果提示miR-30家族可能通過調控DNMT3a，進而調控DNA甲基化的改變而改善MIRI的新機制，其涉及缺血性心肌損傷后的表觀遺傳學調控。DNA甲基化與微小RNA同屬于表觀遺傳學的一部分，受DNMT的調控，MIRI時大量基因的甲基化水平發生變化，導致基因的表達異常，加劇心肌損傷，而DNA甲基化抑制劑能有效改善MIRI，雖然目前在臨床上還沒有甲基化抑制劑應用于心臟疾病治療的研究，但基于miR-30c的可改善MIRI的甲基化抑制劑的研究值得期待[34]。

Zheng等[10]研究發現，在MIRI病人的外周血中miR-30e表達降低；沉默miR-30e (si-miR-30a)的作用機制：①抑制H9c2細胞凋亡，降低凋亡調節因子Bax蛋白表達、Caspase-3活性；②顯著增加自噬相關蛋白LC3、p62、Beclin-1的表達；③增加Notch受體Notch1及其靶基因——堿性-螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)轉錄抑制因子Hes1和p-Akt的表達；④降低誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達，增加氧化應激相關蛋白如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性；用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制自噬后，可逆轉si-miR-30e的①②④作用；促進Notch1表達后，可顯著增強si-miR-30e的①③④作用。miRNA-30e通過自噬和Notch1/Hes1/Akt信號通路在抑制細胞凋亡和氧化應激中，保護心肌免受I/R損傷。

3 中醫藥調控miR-30家族防治MIRI研究

2016年，Li等[35]研究發現，在小鼠I/R心肌細胞中，miR-30a的表達明顯下調，Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達上調；丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)可通過上調內源性miR-30a的表達，降低Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenases，LDH)漏出率，并提高p-Akt的表達及心肌細胞活力，從而減輕心肌自噬，保護心肌細胞；抑制磷脂酰三磷酸肌醇(phosphatidylinositol 3-Kinases，PI3K)表達(PI3K抑制劑LY294002處理后)可使Beclin-1的表達增加，p-Akt蛋白表達減少。提示Sal B誘導的miR-30a抗自噬作用機制可能與PI3K/Akt信號通路有關。此研究表明了中藥有效成分Sal B在miR-30a介導的MIRI自噬中的作用。

Liu等[36]研究發現，在大鼠I/R心肌模型和H/R心肌細胞模型中，miR-30a表達增高，Beclin-1的表達水平和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低，自噬受到抑制，心肌細胞凋亡增加；蛇床子素(osthole)可減少心肌細胞膠原含量，減輕心肌腫脹、壞死和心肌纖維化，從而減緩心肌損傷；蛇床子素可通過下調miR-30a的表達，提高Beclin-1的表達水平而增強自噬，并可減輕心肌細胞凋亡；自噬抑制劑3-MA顯著逆轉蛇床子素對細胞凋亡的保護作用，提示自噬在蛇床子素抑制H/R細胞損傷中起重要作用。此研究表明了蛇床子素在miR-30a介導的MIRI自噬中的作用，但該研究結果與上述研究有爭議，有待進一步驗證。

Wang等[37]研究發現：①在叔丁基過氧化氫(tert-Butyl hydroperoxide，TBHP)誘導的H9c2大鼠I/R心肌細胞中，miR-30c-5p的表達水平下調；②三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)及其活性成分人參皂苷Re可通過顯著上調miR-30c-5p的表達水平，抑制p53的表達而減少細胞凋亡，并可增加心肌細胞存活率及減少LDH釋放而減輕細胞損傷，從而改善MIRI。Sal B和PNS可通過上調miR-30家族的表達分別減輕心肌細胞自噬與凋亡，而蛇床子素通過下調miR-30a的表達增強自噬而減輕心肌細胞凋亡，進而改善MIRI。詳見圖1。

圖1 miR-30家族在心肌缺血再灌注損傷中的研究

4 小 結

miR-30家族作為非編碼RNA中的一員與心肌I/R損傷的關系密切。miR-30家族通過調節相關基因及其調節因子表達而參與影響MIRI的自噬、凋亡、壞死等病理過程。總體而言，在發生MIRI時miR-30家族表達下調，而通過上調miR-30家族的表達可改善MIRI。此類基于表觀遺傳學調控的病理生理學相互作用的分子和細胞效應的研究，將為不斷完善MIRI病理機制，研究新的診斷標志物和治療靶點，進一步開發抗MIRI新藥提供實驗依據和理論依據。

中醫藥治療作為我國的特色醫療手段，已經成為MIRI治療中不可缺少的組成部分[38]。丹酚酸B、蛇床子素、三七總皂苷等中藥有效成分可通過調節miR-30的表達水平進而影響MIRI，此類強調基因和環境因素等相互作用的表觀遺傳學調控的研究，對解釋及豐富中醫“證候”“天人相應”的發病觀以及“辨證論治”的個體化治療觀等中醫理論具有重要意義；對闡明中醫藥治療MIRI的分子水平作用機制，即單藥作用多靶點效應及中藥配伍、復方等多藥聯合調配后的發揮整體藥效的多靶標共同作用提供了新的切入點；對創新中藥新藥研發以及研究中醫藥治療心血管疾病及其相關預后干預帶來新思路[6，39-40]。

然而，目前關于miR-30家族在MIRI中的作用研究尚處于初始階段，且miR-30家族在MIRI中的作用關系大都集中在體外研究，序列的不保守性和一些實驗方法的限制阻礙了體內實驗的進展，大部分研究還局限在基礎實驗階段，其臨床效果還有待進一步驗證。未來需要更多的研究去探索揭示MIRI的機制，并需要將這些研究成果與臨床實際相結合，為MIRI的防治提供新思路與新策略。