羧基功能化磁性碳納米管的制備及其對豬肉中瘦肉精的萃取

連麗麗，陳柏森，鄧藝輝，王希越，張凌赫，婁大偉

（吉林化工學院 分析化學系，吉林 吉林 132022）

自20世紀80年代以來，鹽酸克倫特羅（CLB）和萊克多巴胺（RAC）等腎上腺素受體激動劑被廣泛用作牲畜食品添加劑，以減少被飼養動物的脂肪、提高其肌肉生長，因此也被稱為“瘦肉精”［1-3］。“瘦肉精”可在動物組織中累積，人類食用被其污染的肉類后會引起疲憊、頭暈發燒、心律失常和新陳代謝紊亂等不良反應，嚴重者會引發癌癥、中樞神經和心血管疾病［4］。因此，我國及許多國家已禁止使用“瘦肉精”作為動物生長促進劑［5］。然而，由于其成本低廉、作用高效，“瘦肉精”作為飼料添加劑仍屢禁不止。因此，開發復雜樣品中“瘦肉精”的檢測方法具有重要意義。

固相萃取（SPE）技術作為最常用的樣品凈化和預富集步驟，結合儀器分析，能夠實現復雜基質中痕量組分的準確分析［6］。近年來，在SPE 基礎上發展起來的磁性固相萃取（MSPE）技術，作為一種新型樣品前處理手段受到了廣泛關注［7］。MSPE技術的關鍵在于制備對目標分析物具有良好吸附性能的磁性吸附劑。Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性納米粒子（NPs）具有較小的尺寸、優異的磁響應性，在其表面進一步修飾多功能基團得到的磁性雜化材料可作為MSPE吸附劑。碳納米管是一維線性結構的納米碳材料，可分為單壁碳納米管和多壁碳納米管（CNT），具有比表面積大、易于功能化修飾、性質穩定等優點［8］。將其與Fe3O4、γ-Fe2O3等磁性NPs相結合構建的磁性碳納米管兼具二者優點，不但具有良好的磁性，而且具有較高的吸附容量，被廣泛應用于環境水、食品、生物樣品中獸藥［9］、雌激素［10］、多環芳烴［11］、農藥［12］和染料［13］的富集與分離。

本文在超聲輔助下，通過氧化-沉淀法合成了羧基功能化磁性碳納米管復合材料Fe3O4-Cys@CNT。與傳統的磁性碳納米管相比，Fe3O4-Cys@CNT具有制備方法簡單、合成時間短、綠色環保及表面富含羧基官能團等優點。將Fe3O4-Cys@CNT 作為吸附劑，建立了豬肉樣品中痕量CLB 及RAC的MSPE/超高效液相色譜（UPLC）分析方法，并將該方法應用于市售豬肉樣品中CLB和RAC的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

配有TUV 紫外檢測器的H-Class 超高效液相色譜儀（美國Waters 儀器公司）；EP115 型烘箱（德國Binder 儀器公司）；JEM-2100F 型透射電鏡（TEM，日本電子株式會社JEOL）；D8 Advanced X-射線衍射儀（XRD，德國Bruker公司）。

鹽酸克倫特羅（CLB，純度99%）、萊克多巴胺（RAC，純度99%）購于美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈（色譜純）購于美國Fisher 公司；半胱氨酸（L-Cys）、CNT（分析純）購于上海阿拉丁公司；其它試劑均為分析純。

1.2 標準溶液配制

稱取5.0 mg CLB、RAC 標準品，置于10 mL潔凈的容量瓶內，加入5.0 mL 甲醇配制成質量濃度為1 000 mg/L的混合標準儲備液，4 ℃下保存。移取100 μL混合標準儲備液于10 mL潔凈的容量瓶內，用甲醇定容至10 mL，得到10 mg/L的CLB、RAC混合工作液，4 ℃下保存備用。

1.3 色譜條件

色譜柱：BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國Waters儀器公司）；檢測波長：210 nm；流動相：乙腈∶1%甲酸水（80∶20）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.4 磁性吸附劑制備

稱取1.7 g FeSO4和0.7 gL-Cys 分別溶于30 mL 超純水中。將上述兩種溶液迅速混合，加入48 mL 1 mol/L 的NaOH，25 ℃超聲5 min 后，在上述溶液中加入0.3 g CNT，在超聲條件下繼續反應20 min。反應結束后，用無水乙醇和超純水反復洗滌產物至潔凈，60 ℃真空干燥6 h，得到Fe3O4-Cys@CNT。

1.5 實際樣品處理

豬肉樣品購自吉林市當地超市。參考國家標準方法（GB/T 5009.192-2003）［14］提取豬肉樣品中的CLB 及RAC。稱取豬肉樣品10 g 于燒杯中，加入20 mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）進行勻漿處理，沉淀蛋白。25 ℃超聲處理20 min 后，在80 ℃水浴條件下加熱10 min，取出冷卻至室溫，于10 000 r/min 離心10 min，上清液轉移至50 mL 離心管中。將殘渣用5 mL 高氯酸溶液（0.1 mol/L）重復提取，合并2 次提取液，用超純水稀釋至50 mL，并用氫氧化鈉溶液（1 mol/L）將其pH調至7±0.1，4 ℃下保存備用。

1.6 磁性固相萃取過程

將20 mg Fe3O4-Cys@CNT 分散到10 mL 上述提取液中，渦旋振蕩10 min，磁分離后棄去上清液。用3 mL醋酸甲醇（15∶85，體積比）對目標分析物進行渦旋洗脫，洗脫時間為10 min。收集洗脫液，氮氣濃縮后用超純水復溶至500 μL，進行UPLC 分析。在此實驗過程中，對pH 值、萃取時間、吸附劑用量、洗脫時間、洗脫溶劑種類及體積等進行了優化并對吸附劑的重復使用性進行了評估。

2 結果與討論

2.1 磁性吸附劑的制備

在超聲條件下，采用溫和的氧化-沉淀法合成Fe3O4-Cys@CNT。在堿性條件下，以Fe2+作為鐵源，空氣中的O2作為氧化劑，在保護劑L-Cys的作用下，O2將Fe2+氧化為Fe3O4。同時，L-Cys可通過—SH 官能團中的S原子與金屬的絡合作用被枝接在磁性材料表面，為磁性NPs提供氨基和羧基［15］。在超聲作用下，Fe3O4-Cys NPs上的氨基和羧基進一步通過氫鍵與CNT結合，并均勻地分散在CNT表面。

2.2 磁性吸附劑的表征

圖1A 為Fe3O4-Cys@CNT 的傅里葉變換-紅外光譜（FT-IR）圖。其中，在568 cm-1處的特征吸收為Fe3O4中Fe—O 鍵的拉伸振動；在3 438 cm-1處的吸收峰由L-Cys 分子和CNT 中O—H 的伸縮振動引起；在1 612 cm-1、1 178 cm-1和1 069 cm-1處的吸收峰分別由C==O、C—N和C—O的伸縮振動引起［16］，表明Fe3O4-Cys 成功地修飾于CNT 表面。Fe3O4NPs 賦予了吸附劑磁性，而L-Cys 分子中的氨基及羧基增強了吸附劑的親水性。

圖1 Fe3O4-Cys@CNT的FT-IR譜圖（A）、XRD譜圖（B）以及TEM圖（C、D）Fig.1 FT-IR analysis（A），XRD patterns（B）and TEM images（C and D）of Fe3O4-Cys@CNT

Fe3O4-Cys@CNT 的XRD 譜圖如圖1B 所示。在2θ= 30.26°、35.42°、43.23°、53.91°、57.23°和62.82°處的特征衍射峰，分別對應立方反尖晶石結構Fe3O4的（220）、（311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面的特征衍射［17］，此外，在2θ= 26.3°處觀察到CNT（002）晶面的特征衍射峰［18］。結果表明，Fe3O4NPs成功地連接在CNT表面，且未發生晶體結構的變化。

圖1C 和圖1D 為Fe3O4-Cys@CNT 的TEM 圖。由圖可見，Fe3O4-Cys 為單分散的球形結構，其粒徑約為20 nm，CNT為細長管狀，管內徑約為5 nm，管壁厚約為5 nm，Fe3O4-Cys NPs均勻地分布在CNT表面。

2.3 固相萃取條件的優化

2.3.1 萃取條件的優化考察了溶液pH 值（pH 3～11）對目標分析物萃取效率的影響。如圖2A 所示，在pH 值為5、7、9 時2 種目標物的回收率較好且在pH 9 時達到最佳。CLB 的酸度系數（pKa）值為9.9，RAC 的酸度系數pKa1值為8.9、pKa2值為10.3［19］，經測定Fe3O4-Cys@CNT 的零點電位（pHpzc）為6.5。因此，在強酸性介質中，磁性吸附劑與目標分析物之間的靜電斥力增強，使得萃取效率大大降低。隨著pH值的增大，吸附劑與目標物之間的靜電斥力逐漸降低，CLB及RAC與CNT之間的氫鍵作用及π-π作用［20］使得Fe3O4-Cys@CNT在較寬的pH值范圍內對二者均具有較高的萃取效率。在強堿性（pH 11）介質中，Fe3O4-Cys@CNT表面的負電荷與帶負電的分析物之間靜電斥力增強，使得吸附劑對分析物的萃取效率下降。因此，選擇最佳pH值為9。

圖2 溶液pH（A）、吸附劑用量（B）、洗脫溶劑種類（C）和洗脫時間（D）對目標物回收率的影響Fig.2 Effects of pH value（A），adsorbent mass（B），eluent type（C）and elution time（D）on the recoveries of analytes C：1.methanol；2.acetonitrile；3.acetic acid/methanol（15∶85）；4.acetic acid/acetonitrile（15∶85）；5.ammonia/methanol（10∶90）

進一步考察了吸附劑Fe3O4-Cys@CNT 質量（5～30 mg）對CLB 及RAC 萃取效率的影響。由圖2B 可看出，隨著吸附劑質量從5 mg增至10 mg，萃取效率快速增加，當吸附劑質量增至15 mg時萃取效率達到平衡。因此，選擇吸附劑Fe3O4-Cys@CNT的最佳用量為15 mg。此外，在5～30 min范圍內對萃取時間進行了優化。由于吸附劑具有足夠的吸附位點，CLB及RAC在前5 min能夠被快速萃取，并在10 min時達到吸附平衡。因此，選擇最佳萃取時間為10 min。

2.3.2 洗脫條件的優化考察了甲醇、醋酸/甲醇（15∶85，體積比，下同）、氨水/甲醇（10∶90）、乙腈、醋酸/乙腈（15∶85）5 種溶劑對目標分析物萃取效率的影響。如圖2C 所示，以醋酸/甲醇（15∶85）和醋酸/乙腈（15∶85）作為洗脫溶劑時目標物的萃取效率高于甲醇和乙腈，由于乙腈毒性較大，因此選擇醋酸/甲醇（15∶85）作為洗脫溶劑。此外，酸性/堿性甲醇的洗脫效果均優于甲醇。一方面，在甲醇中加入酸/堿溶液，破壞了分析物與吸附劑間的氫鍵作用，使分析物與洗脫溶劑的親和力增強［21］。另一方面，CLB 及RAC 均為極性化合物，在甲醇中添加酸/堿溶液提高了洗脫溶劑的極性，從而能夠更好地將目標分析物從吸附劑表面洗脫［22］。進一步考察了洗脫時間在2～20 min 范圍內對萃取效率的影響。如圖2D 所示，當洗脫時間為10 min 時，2 種目標物的萃取效率達到最優且不再增加（RAC 和CLB 的萃取效率分別為85.87%、83.06%），因此選擇洗脫時間為10 min。同時考察了洗脫溶劑體積（0.5～4 mL）對萃取結果的影響，當洗脫溶劑體積為3 mL 時，Fe3O4-Cys@CNT 對CLB 及RAC的萃取效率最佳。

2.4 吸附劑的重復使用性

為考察Fe3O4-Cys@CNT 的穩定性和重復使用性，將吸附劑連續用于提取液中CLB 及RAC 的萃取。結果表明Fe3O4-Cys@CNT 復合材料性質穩定，重復4個循環后，萃取效率降低不超過3%，重復5個循環后，萃取效率降低13.6%，說明Fe3O4-Cys@CNT能夠重復使用4次。

2.5 方法評價

2.5.1 線性關系、檢出限及定量下限在10 mL 空白豬肉提取液中添加不同質量濃度的CLB 及RAC標準溶液，在最佳MSPE條件下進行樣品前處理及UPLC檢測。以目標物的峰面積（Y）與其質量濃度（X，μg/L）進行線性回歸，繪制標準工作曲線。并分別以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）計算得到該方法的檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結果表明，CLB 和RAC均在0.5～100 μg/L范圍內線性關系良好（r≥0.997 4），LOD和LOQ分別為0.15 μg/L和0.50 μg/L。

2.5.2 準確度與精密度在10 mL 空白豬肉樣品提取液中添加CLB 及RAC 標準溶液，配制3 個濃度水平（1、10、100 μg/L）的加標樣品溶液，在優化條件下進行樣品前處理及檢測（每個水平平行測定3 次）。結果表明，在3 個加標水平下，CLB 的回收率分別為112%、100%和95.1%，RAC 的回收率分別為96.6%、104%和98.7%，相對標準偏差（RSD）均小于11%。說明該方法具有良好的準確度和精密度。

2.5.3 與其他方法的對比表1為所建立的MSPE/UPLC方法與檢測CLB及RAC的文獻方法的比較結果。與文獻方法相比，本方法的線性范圍更寬，檢出限比多數文獻方法更低。此外，Fe3O4-Cys@CNT合成時間僅需25 min，經充分干燥后即可使用，且具有制備方式綠色、簡便、成本低廉等優勢。由于具有磁性，Fe3O4-Cys@CNT能夠通過磁分離的方式從溶液中快速、方便地分離，從而提高了樣品前處理的效率。

表1 建立的MSPE方法與其他用于測定不同樣品中CLB及RAC方法的比較Table 1 Comparison of the developed MSPE method with other methods for the determination of CLB and RAC in different samples

2.6 實際樣品測定

從當地市場隨機抽取5 份（1 號、2 號、3 號、4 號、5 號）豬肉樣品，采用本方法測定其中CLB 及RAC 的含量。其中3 號和5 號樣品中檢出CLB，質量濃度分別為0.76 μg/L 和1.5 μg/L，均低于國家標準（GB/T 5009.192-2003）規定的最高允許添加量［14］。圖3A 為5 號陽性豬肉樣品的色譜圖，圖3B 為1號豬肉空白樣品、加標及加標萃取后的色譜圖。由圖可見，經MSPE處理后，目標物的峰形良好，峰信號顯著增強，雜峰減少，表明有效去除了基質干擾。

圖3 5號陽性豬肉樣品（A）與1號豬肉樣品（B）的色譜圖Fig.3 Chromatograms of a No.5 positive pork sample（A）and a No.1 pork sample（B）

3 結 論

本研究在超聲輔助條件下，使用低成本、環保的化學試劑，通過簡便的氧化-沉淀法制備了羧基功能化磁性碳納米管復合材料Fe3O4-Cys@CNT。該材料兼具Fe3O4及CNT 的優勢，L-Cys 的成功修飾使吸附劑表面具有豐富的活性基團，這些特點使得Fe3O4-Cys@CNT 易于固液分離，具有萃取時間短（萃取和洗脫時間共20 min）、萃取效率較高（RAC 和CLB 的萃取效率分別為85.87%、83.06%）等優勢。以Fe3O4-Cys@CNT 作為吸附劑，建立了同時檢測豬肉樣品中痕量CLB 及RAC 的MSPE/UPLC 方法。該方法對CLB及RAC的LOD均為0.15 μg/L，回收率為95.1%～112%，RSD小于11%，為復雜食品和生物樣品中瘦肉精的檢測提供了新思路。