中草藥DUS測試應(yīng)用與進(jìn)展

★ 梅瑜 蔡時(shí)可 王繼華（廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所 廣州 510640）

中草藥種質(zhì)資源是自然界的寶藏，也是中藥材開發(fā)利用的物質(zhì)基礎(chǔ)，資源的調(diào)查、收集和鑒定一直備受重視［1］。中國藥用植物資源豐富，達(dá)11 146種，其中多數(shù)為野生資源，人工馴化的品種不多，其中廣為栽培的藥用植物品種僅200多種［2-3］。隨著中醫(yī)藥和大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類對中藥材研究的不斷深入，社會對中藥材的需求量不斷增加，給長期依賴自然采集的中草藥植物資源帶來毀滅性的破壞，部分品種已經(jīng)瀕臨滅據(jù)。中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的穩(wěn)定是保障產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，而選育優(yōu)良種質(zhì)，促進(jìn)其逐漸從野生轉(zhuǎn)變?yōu)榧曳N是整個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈的技術(shù)關(guān)鍵，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一［4-5］。目前，與傳統(tǒng)的農(nóng)作物育種相比，中草藥育種的進(jìn)展還比較落后。在種質(zhì)資源保護(hù)方面，植物新品種特異性（distinctness）、一致性（uniformity）和穩(wěn)定性（stability）（DUS）測試是基于國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）的技術(shù)文件，結(jié)合種質(zhì)資源自身的表觀和育種實(shí)際，用于植物新品種保護(hù)權(quán)的判定［6-7］。DUS測試也是地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品特征特性描述的重要內(nèi)容［8］。目前，開展中草藥DUS測試的研究還不多，但其為更好的保護(hù)和利用種質(zhì)資源提供基礎(chǔ)［9］。

1 植物品種DUS測試現(xiàn)狀

1.1 植物品種DUS測試 根據(jù)植物新品種保護(hù)條例的相關(guān)規(guī)定，授予品種權(quán)的品種必須是列入國家植物新品種保護(hù)名錄，經(jīng)過人工培育的或者對發(fā)現(xiàn)的野生植物加以開發(fā)，具備新穎性、特異性（可區(qū)別性）、一致性和穩(wěn)定性并有適當(dāng)命名的植物品種。植物品種DUS測試是依據(jù)相應(yīng)植物測試技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)，通過田間種子實(shí)驗(yàn)或室內(nèi)分析對待測品種的特異性、一致性和穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)的過程［10］。《中華人民共和國植物新品種保護(hù)條例》要求審批機(jī)關(guān)對品種權(quán)申請的特異性、一致性和穩(wěn)定性進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查。《中華人民共和國種子法》要求申請保護(hù)、審定、登記的品種應(yīng)當(dāng)具備DUS，明確DUS測試指南是品種管理的基本技術(shù)依據(jù)，提高DUS測試的法律地位［11］。

1.2 植物品種DUS測試指南開發(fā)現(xiàn)狀 植物品種DUS測試指南是判定植物新品種的法律依據(jù)，也是品種質(zhì)量控制、授權(quán)監(jiān)管和品種權(quán)糾紛處理的重要標(biāo)準(zhǔn)［12］。目前，我國至少批準(zhǔn)了259項(xiàng)DUS測試指南標(biāo)準(zhǔn)，包括國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布的36項(xiàng)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的176項(xiàng)，國家林業(yè)局發(fā)布的46項(xiàng)，國家煙草專賣局發(fā)布的1項(xiàng)，為農(nóng)業(yè)植物新品種保護(hù)名錄中160個(gè)屬或種和林業(yè)植物新品種保護(hù)名錄中60個(gè)屬或種的DUS測試提供了技術(shù)依據(jù)，見圖1。近年來，中草藥的植物DUS測試指南中發(fā)布的數(shù)量逐漸增加，特別是南藥品種的指南開發(fā)受到重視，如砂仁、穿心蓮和美麗雞血藤（牛大力）等的DUS測試指南也已經(jīng)發(fā)布［13］。

圖1 DUS測試指南數(shù)量

2 中草藥DUS測試現(xiàn)狀

1997年10月01日《中華人民共和國植物新品種保護(hù)條例》的實(shí)施，標(biāo)志著植物育種家的育種成果受國家法律保護(hù)。目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了11批農(nóng)業(yè)植物新品種保護(hù)名錄，191個(gè)屬或種得到了保護(hù)，中草藥植物有補(bǔ)血草屬、龍眼、人參、三七、薏苡屬、生姜、山藥（薯蕷）、石斛屬、靈芝屬、枸杞屬、天麻、何首烏、菘藍(lán)、大麻槿（紅麻）、紫蘇、蛹蟲草、紅花、淫羊藿屬、松果菊屬、金銀花、柴胡屬、黃芪屬、美麗雞血藤（牛大力）、穿心蓮、丹參、黃花蒿、砂仁；國家林業(yè)局發(fā)布了6批林業(yè)植物新品種保護(hù)名錄，206個(gè)屬或種得到了保護(hù)。

自2010年以來，上述27個(gè)屬或種中草藥植物品種權(quán)的申請量為64件，授權(quán)量為9件，其中2016年―2019年品種權(quán)的申請量達(dá)56件，見圖2A，石斛屬品種權(quán)的申請量最多（35件），僅人參、三七和補(bǔ)血草屬品種權(quán)授權(quán)，見圖2B。上述27個(gè)屬或種中草藥植物中補(bǔ)血草屬、龍眼、人參和三七為2016年之前列入保護(hù)名錄的，其余23個(gè)屬或種均為2016年或2019年列入保護(hù)名錄的。可見，植物新品種保護(hù)目錄的建設(shè)推動了中草藥植物的育種進(jìn)程。

圖2 2010年以來中草藥農(nóng)業(yè)植物品種權(quán)申請和授權(quán)量

3 中草藥DUS指南的研制現(xiàn)狀

DUS測試指南是國家植物新品種保護(hù)名錄的基礎(chǔ)，指南的開發(fā)是中草藥新品種進(jìn)行實(shí)質(zhì)審查的必備條件，也是進(jìn)行中草藥資源保護(hù)和合理利用的工作基礎(chǔ)。中草藥DUS測試是植物新品種保護(hù)權(quán)管理的重要組成部分，長期以來由于育種方面研究的滯后，測試標(biāo)準(zhǔn)的研制也相對落后。近年來，中藥草的開發(fā)和種苗培育逐漸重視，開展中草藥新品種保護(hù)的需求也日益增多，測試標(biāo)準(zhǔn)的缺乏制約了中草藥種業(yè)的發(fā)展，急需研發(fā)相應(yīng)的DUS測試標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 DUS測試指南的研制原則 DUS測試指南是主管部門審查新品種DUS的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，和測試機(jī)構(gòu)開展DUS測試工作的技術(shù)手冊［14］。研制指南以審查品種的自身特性，與UPOV總則及相關(guān)TGP 文件進(jìn)行結(jié)合，統(tǒng)一性狀描述，并進(jìn)行規(guī)范化，可作為標(biāo)準(zhǔn)性文件來進(jìn)行特定植物的DUS測試［15］。 因此，測試指南必須以《TGP/7 植物新品種測試指南的研制》《TG1/3 植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試及統(tǒng)一描述總則》和《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則》等為基本原則，參照UPOV其他測試指南。但是隨著育種水平的提高，特別是為數(shù)不多的骨干親本用于種質(zhì)創(chuàng)新，導(dǎo)致后代的遺傳差異縮小，通過表觀形態(tài)學(xué)來鑒定變得十分困難［16］。大部分中草藥品種長期處于自然生長狀態(tài)，基源植物的數(shù)量比較有限，對照品種的數(shù)量往往有限。加之，道地藥材的特點(diǎn)表型往往依賴于特定的自然生態(tài)環(huán)境，給基于形態(tài)學(xué)的測試指標(biāo)體系的建立帶來一定的困擾。隨著高通量測學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大量的基因組數(shù)據(jù)公開發(fā)表，利用這些遺傳信息，比如中藥材條形碼，DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用來確定統(tǒng)一的測試性狀和標(biāo)準(zhǔn)品種，有利于制定出準(zhǔn)確規(guī)范的 DUS 測試指南［17-19］。

3.2 中草藥DUS測試指南的特性 目前，功能植物的開發(fā)越來越多，多種類別的植物具有了新的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對開展新品種保護(hù)權(quán)的需求也日益嚴(yán)重。但是，這些植物大多還沒有相應(yīng)的植物新品種DUS測試指南，特別是具有藥用功能的中草藥品種尤為突出。中草藥DUS測試指南的研制和其它植物，特別是農(nóng)作物相比較，既有共性也有特性。特性在于以下幾方面：一是中藥草講究道地性，種植在不同區(qū)域的品種在形態(tài)上差異不明顯，但是在藥效及經(jīng)濟(jì)價(jià)值上相差甚遠(yuǎn)；二是中草藥的藥用成分與種植年限密切相關(guān)，測試周期長；三是中草藥的品種選育歷史較短，可用于作為對照品種的數(shù)量有限；四是其主要的價(jià)值在于藥用成分，而這方面的指標(biāo)并不是DUS測試的主要目標(biāo)。中藥材的生產(chǎn)過程中對道地性要求較高，《藥品化義》就有明確的記載，對種植的區(qū)域有嚴(yán)格的界定［20］。生態(tài)環(huán)境對中草藥表型和有效成分的影響比較突出，給DUS指南中測試環(huán)境的要求較為嚴(yán)格［21］。現(xiàn)在由于引種和連作障礙的影響，很多著名的藥材得到推廣，如陽春的春砂仁被引種到廣西，云南，但是在藥效和經(jīng)濟(jì)價(jià)值方面產(chǎn)業(yè)巨大。另外，標(biāo)準(zhǔn)品的性狀因品種而異，大部分物種的的品種質(zhì)量性狀之間存在極顯著差異，例如芝麻的標(biāo)準(zhǔn)品可明顯區(qū)分出不同類型［22］。但是部分品種受到環(huán)境的影響，存在一定變異，例如水稻測試指南中的52個(gè)測試性狀中的數(shù)量性狀的受環(huán)境條件的影響較大［23］。中草藥的DUS測試在測試地點(diǎn)的選擇上尤為重要。大部分中草藥藥效成分的積累與種植年限有關(guān)，如牛大力是南方的藥用植物，一般要3～5年以上才具有藥用功能，導(dǎo)致中草藥的DUS測試存在工作周期長，質(zhì)量難控制等問題［21］。

3.3 中草藥DUS測試指南研制進(jìn)展 中草藥對測試指標(biāo)特殊性導(dǎo)致中草藥DUS測試指南的研制和開發(fā)相對困難，目前已經(jīng)開發(fā)出測試指南的中草藥僅有20多種［13］。長期以來，選育出來的中草藥新品種數(shù)量較少，作為指南中對照品種品種也就不多。目前，發(fā)布的藥用植物的指南中，對照品種的數(shù)量均比較有限。剛剛發(fā)布的穿心蓮測試指南中共有18個(gè)測試指標(biāo)，而對照種僅有3個(gè)，而且均為地方品種；砂仁僅有2個(gè)參照品種。對照種數(shù)量上的缺乏，性狀的差異較大，度量值的范圍相對寬松，將影響測試的精確性。中草藥的用途主要是在藥用成分方面，高含量也是育種的主要目標(biāo)之一。但是，藥用成分在現(xiàn)在發(fā)布的指南中，大多是作為選測的指標(biāo)，如穿心蓮的內(nèi)酯成分，而藥用物質(zhì)含量的高低是否和形態(tài)相關(guān)，還沒有相關(guān)的研究。以形態(tài)上的指標(biāo)作為中草藥新品種的保護(hù)，這在應(yīng)用上的價(jià)值沒有得到體現(xiàn)。隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，一些高通量檢測技術(shù)，如基因組和代謝組分析在中草藥的DUS測試上可以發(fā)揮重要的作用。

3.4 新技術(shù)在中草藥DUS測試指南的應(yīng)用 近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，測序技術(shù)日益成熟，大量的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組信息得到公開。中草藥的真?zhèn)闻袆e方法一直是研究的熱點(diǎn)，同時(shí)分子證據(jù)也是區(qū)分藥用植物及其基源植物的重要方法。目前利用基因序列進(jìn)行中藥材的檢測應(yīng)用非常廣泛，技術(shù)成熟。從早期使用細(xì)胞器的部分基因序列如葉綠體atpA、psaB、rpoA和rpoC1等基因的序列來鑒別藥材的真?zhèn)危@些數(shù)據(jù)為開展中草藥的DUS測試指南的開發(fā)提供大量的分子標(biāo)簽。隨著DNA、RNA和蛋白質(zhì)測序成本越來越低，其應(yīng)用也越來越廣泛，利用全細(xì)胞器基因組的序列也相對容易。利用基因組序列開發(fā)的SSR、SNP等分子標(biāo)記可以應(yīng)用于作物品種之間的分辨，目前國際新品種保護(hù)聯(lián)盟已將 SSR標(biāo)記用于新品種的DUS測試中。隨著基因組學(xué)研究的深入，SNP等新型的分子遺傳標(biāo)記將在DUS測試上發(fā)揮更大的作用。在檢測方面，高通量的SSR、SNP檢測平臺的不斷升級，效率和準(zhǔn)確率不斷增加，而成本越來越低，受到測試人員的喜愛。同時(shí)，表型組學(xué)的發(fā)展，大量的植物表型數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)、代謝組數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，大數(shù)據(jù)的支撐為中草藥的DUS測試指南的研制提供了新的思路。

目前，中草藥DUS測試指南的開發(fā)和制定受到重視，已經(jīng)在鼓勵有條件的機(jī)構(gòu)共同開展指南的研制。因此，中草藥的DUS測試指南的研發(fā)將會迎來新的發(fā)展。

4 展望

種子是中藥產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)和源頭，直接關(guān)系中藥材質(zhì)量的優(yōu)劣和產(chǎn)量的穩(wěn)定，更關(guān)系到中醫(yī)藥事業(yè)的安全性和有效性［19,24］。隨著市場對中藥材需求的增加，中草藥的種植面積和品種都在日益增加，對種子的需求不斷擴(kuò)大。與傳統(tǒng)種業(yè)相比，中草藥大多數(shù)品種還處于自繁自種的現(xiàn)狀，品種往往魚目混雜、質(zhì)量低劣，新品種選育發(fā)展嚴(yán)重緩慢，育種水平低下。我國中藥用植物有11 146種，多數(shù)為野生資源，由于對野生資源保護(hù)意識薄弱，過度的開采利用致使藥用植物資源瀕危狀況日益嚴(yán)重［3］。通過人工選育或者野生植物引種馴化，將野生種轉(zhuǎn)變?yōu)榧曳N并推廣種植，可從根本上緩解對野生資源的壓力。中草藥DUS測試不僅可以對其資源進(jìn)行有效的保護(hù)，更是通過指南的研制，促進(jìn)對中草藥良種的培育與推廣起到重要的作用。結(jié)合中草藥自身的特點(diǎn)，開發(fā)適合的DUS測試指南將是植物新品種保護(hù)的重要工作之一。中草藥DUS的測試將為中藥材產(chǎn)業(yè)的持續(xù)利用與開發(fā)發(fā)揮積極的指導(dǎo)作用。