鬼針草提取物對食道癌細胞的抑制作用及其機理研究

王潔如，勞雅詩，曾鑫海，梁惠芬，劉亞群，楊東娟，鄭玉忠，張振霞

（韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041）

食道癌又稱食管癌，是常見的消化道腫瘤之一，其發病率及死亡率均較高［1］.它的出現與生活環境、飲食習慣、遺傳等因素息息相關；近些年，食道癌患病率呈現逐年上升的趨勢，多發于40歲以上男性［2］.食管癌的典型癥狀表現為進行性咽下困難，逐漸從硬到軟甚至到唾液也難以下咽，食道癌的發生會對患者的正常進食及生活質量產生嚴重影響［2-4］.食道癌中晚期患者難以根治，因此，早期診斷和早期有效治療對于提升患者治愈率至關重要.對于中晚期患者，即使結合手術和放化療等方法，也會給患者帶來很大的副作用，研究顯示食道癌術后不良癥狀發生率很高［5］，但其病發機制仍不清楚［4, 6］.

鬼針草（Bidens PilosaL.）作為一年生或多年生草本植物，莖直立，在我國各省均有分布，種類較多，為荒地雜草之一［7］.作為中國民間常用草藥，鬼針草最早記載于《本草拾遺》，性溫，味苦，無毒，全草均可入藥，有多種生物活性成分和廣泛的藥理作用［8-12］；藥效化學發現鬼針草含有大量黃酮類［11］、酚酸類等成分，具有清熱、解毒、散瘀、消腫等功效.現代研究認為，鬼針草具有抑菌抗炎、抗干眼、抗衰老、抗病毒等作用；在降低患者血壓、減輕靶器官的損害方面具有重要作用［13］；能夠抑制腫瘤細胞增殖，對白細胞增殖具有體外抑制作用［14］；對急性黃疸型肝炎［15］等有一定的治療作用.

本研究以食道癌細胞（KYSE150）為研究對象，研究鬼針草提取物對食道癌增殖、黏附、凋亡的影響，同時在分子層面上探討鬼針草提取物對食道癌的藥理機制.有效推動中藥鬼針草在預防和治療食道癌中的運用，降低食道癌的發病率.

1 材料

試劑：蘆丁（純度≧98%）、金絲桃苷（純度≧98%）、色譜級乙腈、色譜級甲醇、磷酸（AR）；DMEM 培養基、全組分牛血清白蛋白、胰蛋白酶粉；TRNzol Universal Reagent、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、無酶無菌水；反轉錄試劑盒、PowerUpTM SYBRTM Green、噻唑蘭（MTT）、纖連蛋白（FN）、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉、硝酸纖維素膜（NC 膜）、ECL 化學發光試劑（enhanced chemiluminescence）；引物（生工生物工程股份有限公司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、一抗（β-actin Mouse）、一抗（Bax Antibody）、二抗（Goat anti-Mouse IgG）、二抗（Goat anti-Rabbit IgG）.

儀器：高效液相色譜儀、Eclipse XDB 色譜柱、電子天平、PH 酸度計、恒溫水浴鍋、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺式高效冷凍離心機、電熱恒溫鼓風干燥箱、倒置顯微鏡、醫用超凈工作臺、二氧化碳恒溫培養箱、超微量核酸蛋白測定紫外可見光光度計、旋渦混合器、二維搖床、酶標儀、LightCycler?96實時熒光定量PCR儀（羅氏）、電轉印器、電泳儀、醫用低速離心機.

2 方法

2.1 鬼針草提取物的制備

采摘新鮮的鬼針草，置于陽光下曬干.稱量100 g 曬干的鬼針草，剪碎置于鍋中，加入500 mL水，大火煮沸后中火熬煮2 h，撈出濾渣.濾渣繼續加300 mL 水，大火煮沸后中火熬煮1 h，撈出濾渣合并兩次濾液，再用過濾裝置過濾掉殘留的微小濾渣.繼續熬煮濃縮至接近稀稠狀，量取濾液總量，計算得出鬼針草提取物的濃度.

2.2 鬼針草提取物的分析

將標準品用甲醇溶解并稀釋至合適濃度，設置高效液相色譜儀相關參數，色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（Analytical 5 μm 4.6×250 mm）；流動相A：0.1%磷酸水溶液，流動相B：乙腈；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；吸光度：360 nm；柱溫：30 ℃.根據表1的高效液相洗脫程序對液相色譜儀進行方法設置，重復實驗.通過繪制標準曲線，測定樣品中蘆丁和金絲桃苷的濃度，計算其在樣品中所含含量.

表1 高效液相洗脫程序

2.3 MTT法檢測細胞活性

將細胞狀態良好的食道癌接種于10 mL 培養皿（含血清和培養基）中，培養48 h，進行細胞傳代，調整細胞濃度為1.2×104個/mL.在96 孔板上標記好加藥濃度、時間等信息，每孔接種200 μL 細胞液，靜置培養24 h.計算及預混含有不同濃度鬼針草提取物（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的新鮮DMEM，培養24 h 后，在避光條件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培養4 h 后，加入150 μL/孔的DMSO.在二維搖床上震蕩15 min，用擦鏡紙擦拭96孔板底部后，在酶標儀490 nm處檢測OD值，利用軟件作圖得出細胞增殖的趨勢.

2.4 黏附性法檢測細胞相互作用

取1 mL 的FN 工作液（0.2 mg/mL）用9 mL 的PBS 溶解稀釋，加入50 μL/孔稀釋后的FN 工作液于96孔培養皿中，用錫紙包裹做避光處理，置于冰箱中4 ℃培養24 h.取1 g的BSA粉末加50 mL的PBS 溶解，調節pH 至7.4 后，用0.22 μm 濾膜過濾除菌，加入100 μL/孔封閉液封閉1 h.每孔加入含有不同濃度鬼針草提取物和DMEM 的混合液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL），培養1.5 h 后，在避光條件下配置5 mg/mL 的MTT，加入20 μL/孔的MTT，培養4 h后，加入150 μL/孔的DMSO.在二維搖床上震蕩15 min， 于酶標儀490 nm 處檢測其吸光度，利用軟件作圖得出細胞的黏附趨勢.

2.5 實時熒光定量PCR檢測細胞基因表達

將細胞濃度調整為1.8×105個/mL 的細胞液接種于6 孔培養皿中，培養24 h，分別加入含有不同濃度鬼針草提取物（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的DMEM 的混合液，繼續培養24 h.用PBS清洗細胞兩次后備用.采用TRIzol 法分離和提取總RNA，用賽默科技的反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA.

在NCBI設計引物，得到所需信息，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成.引物信息如表2 所示，以β-actin為內參，加入正向和反向引物，以及試劑盒中其他反應液，形成PCR反應體系，設置PCR反應程序，進行擴增，得到相關基因的表達量.

表2 引物序列信息

2.6 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達

將細胞接種于10 mL 培養皿中，細胞生長覆蓋率為70%時，用PBS 清洗細胞后，分別加入含有不同濃度鬼針草提取物和DMEM 的混合液（0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），繼續培養24 h，用PBS 清洗細胞兩次后備用.使用RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白；采用BCA法定量蛋白，按試劑盒操作，繪制蛋白標準曲線并測定蛋白濃度，確保等量的細胞進行電泳上樣.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠系統分離蛋白樣品，濃縮膠80 V 恒壓電泳20 min，分離膠120 V恒壓電泳110 min，然后電轉至NC膜.脫脂奶粉封閉60 min，4 ℃孵育一抗16 h以上.一抗濃度分別為Bax（1：2 500）、β-actin（1：5 000）.洗膜后加入二抗（1：10 000），4 ℃孵育2 h，ECL化學發光顯影.進行FCQ拍攝，測定條帶灰度值并計算蛋白相對表達量.

2.7 數據分析

該研究所得數據采用平均值±標準差表示，運用Origin 軟件進行單因素方差統計學分析.各組間數據比較分析采用Tukey檢驗.*表示P＜0.05，為差異有統計學意義.**表示P＜0.01，為差異有顯著統計學意義.

3 結果

3.1 鬼針草提取物的濃度測定

100 g 曬干的鬼針草，加水熬煮，重復兩次，合并濾液繼續濃縮至稀稠狀，量取濾液，計算得到鬼針草提取物物質含量為145.625 mg/mL.

3.2 鬼針草提取物含量分析

根據HPLC 檢測結果，制得蘆丁和金絲桃苷標準曲線，蘆丁Y=15033X+43.683（R2=0.999 9）、金絲桃苷Y=205 66X+37.807（R2=0.999 5）.利用標準曲線計算，可知在鬼針草提取物中，蘆丁含量為0.996 mg/g、金絲桃苷含量為1.390 mg/g.

3.3 鬼針草提取物對食道癌細胞增殖的影響

如圖1（抑制增殖*P＜0.05，**P＜0.01）可知鬼針草提取物對食道癌細胞的抑制作用整體上呈抑制作用加強的趨勢.藥物濃度大于1 mg/mL時抑制作用明顯，且其抑制效果具有顯著的量效關系.初步說明鬼針草提取物能抑制食道癌細胞的增殖活動.

圖1 鬼針草提取物對食道癌細胞增殖的抑制作用

3.4 鬼針草提取物對食道癌細胞黏附的影響

細胞黏附分子使細胞-基質-細胞間發生黏附，以受體-配體結合的形式發揮作用，參與細胞的增殖與分化，是檢驗腫瘤轉、移免疫應答等的必要手段.如圖2（抑制黏附*P＜0.05）所示，在藥物濃度為1.4 mg/mL 時，鬼針草提取物對食道癌細胞參與黏附的活動起顯著的抑制作用，進一步表明鬼針草能抑制食道癌細胞間的信息交流與遷移.

圖2 鬼針草提取物對食道癌細胞黏附特性的抑制作用

3.5 鬼針草提取物對相關基因表達的影響

鬼針草提取物對食道癌增殖具有抑制作用，可能與凋亡基因表達有關聯.結果如圖3（促進基因表達*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）所示，鬼針草提取物能刺激細胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達量呈劑量依賴的上升趨勢，其中對Bak和Bax的影響比后兩者更加顯著，說明鬼針草對細胞促凋亡基因的影響有差異，可能是由于不同凋亡基因的作用機制不同.

圖3 鬼針草提取物對基因表達的影響

3.6 鬼針草提取物對BAX蛋白表達的影響

以β-Actin 為內參，研究鬼針草提取物對BAX 蛋白表達量的影響，如圖4 和圖5（促進蛋白表達*P＜0.05）所示，鬼針草提取物能誘導BAX 蛋白表達水平呈上升趨勢，且濃度越高，上調越明顯.與Bax基因的mRNA表達量趨勢相似，從蛋白水平上驗證了鬼針草對食道癌細胞凋亡的誘導效應.

圖4 鬼針草提取物對BAX蛋白表達的影響

圖5 鬼針草提取物對BAX蛋白表達量的影響

4 結論與討論

鬼針草為中國民間常用草藥，主治多種炎癥，具有清熱解毒、散瘀活血的功效［7］.近年研究發現，鬼針草提取物具有抗腫瘤作用［16］，但其作用機制尚不清楚.鬼針草主要成分是黃酮類化合物，在降低血壓、調節血脂、抗腫瘤以及抗炎等方面具有顯著的藥理作用［17］.鬼針草黃酮類物質中，主要有槲皮素、蘆丁［18］、金絲桃苷、木犀草素等，其中蘆丁和金絲桃苷具有一定的抑癌作用［19-21］，因此鬼針草在抗癌研究上具有良好的前景.

為此，本文研究了鬼針草對食道癌的抑制作用及機制.結果顯示，高濃度的鬼針草提取物能抑制食道癌的細胞增殖，對食道癌細胞黏附活動起到一定抑制作用，破壞了食道癌細胞間的信息交流與轉移，從而導致細胞凋亡.說明鬼針草作為民間常用草藥在預防以及治療癌癥中具有抑制癌細胞增殖擴散、誘導細胞凋亡的作用，從而發揮其藥性.

我國是世界上食管癌高發地區之一，且只能早發現早治療，其治愈率也不高.對此，本文進一步研究鬼針草對不同的細胞凋亡基因的調節作用.結果顯示，鬼針草提取物能誘導細胞凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達量呈上升趨勢，其中對前兩者的影響比后兩者的更顯著，說明鬼針草對細胞凋亡基因的影響有差異.本文還研究了鬼針草提取物對BAX 蛋白表達量的影響，結果表明BAX蛋白表達量呈上調趨勢，說明鬼針草可以通過調控BAX 蛋白表達誘導細胞凋亡.通過查閱大量文獻，Bax促凋亡基因不是單獨起作用，而是與P53、Bcl-2等基因通過不同比例而共同誘導細胞凋亡［22］；對于正常細胞來說，通過下調Bax/Bcl-2 的比例抑制正常細胞的凋亡［23］；對于癌細胞來說，可以通過Akt/Bcl-2/Bax信號通路誘導癌細胞凋亡，抑制增殖，進而發揮抗腫瘤的作用［24］.從總體而言，鬼針草可能主要是通過增加Bax的mRNA 量，導致其蛋白表達量的增加，從而誘導細胞發生凋亡.因為，食道癌細胞周期調節的關鍵蛋白Cyclin D1 與Cyclin E 的表達下調，將食道癌阻滯于G0/G1期，其機制可能系BAX 蛋白上調所介導的［25］.流式細胞術檢測試驗表明，凋亡蛋白BAX 蛋白的上調激活了線粒體通路，破壞線粒體膜電位，導致了凋亡的發生［26］.

綜上所述，鬼針草提取物對食道癌的增殖、轉移、擴散具有一定的抑制作用；對細胞促凋亡基因Bak、Bax、Fas、P53的mRNA 表達量呈上升趨勢；進一步上調BAX 蛋白表達量，誘導細胞凋亡.目前，國內在鬼針草的作用機制這方面的研究較少，如細胞膜、靶細胞、BMP、Wnt等信號通路，有待進一步深入探究分析，后續研究可以主要集中在鬼針草對食道癌產生抑制機制的信號通路，或以小鼠模型加以驗證，進一步完善鬼針草的作用機制，為后續治療食道癌提供一定實驗依據.