基于網絡藥理學及分子對接研究益氣養陰清熱方治療2型糖尿病的作用機制

胡洲映 李雙蕾 陳遠瑾 覃海戀 宋石開 胡飛

摘要 目的：運用網絡藥理學及分子對接預測益氣養陰清熱方治療2型糖尿病的作用機制。方法：借助中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、BATMAN-TCM數據庫獲取益氣養陰清熱方6味中藥的化學成分和作用靶點。通過GeneCards數據庫獲取治療2型糖尿病相關靶點;利用R軟件獲取有效成分與疾病相關靶點之交集;利用Cytoscape v3.8.0中CytoHubba插件篩選出核心靶點，利用ClueGo插件對核心靶標進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。借助AutoDockTool、Vina、Pymol軟件，將進行預處理及分子對接。結果：本研究共獲取養陰清熱方相關有效成分70個，活性成分所涉及的相關靶點222個，有槲皮素、山柰酚、木犀草素、漢黃芩素、芒柄花黃素等;對13個核心靶點進行GO生物過程、KEGG富集分析分別得到36條和47條結果，主要與對脂多糖的反應，對缺氧的反應，對氧化應激的反應相關，涉及IL-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。分子對接結果顯示核心成分與核心靶點JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14、ESR1、CXCL8對接良好。結論：益氣養陰清熱方可通過多途徑、多靶點、多通道影響調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗、抑制肝糖異生、降低炎癥反應、保護血管內皮、改善胰島B細胞分泌功能、調節免疫反應等途徑治療2型糖尿病。

關鍵詞 網絡藥理學;分子對接;益氣養陰清熱方;2型糖尿病

Mechanism of Yiqi Yangyin Qingre Formula in Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

HU Zhouying1，LI Shuanglei2，CHEN Yuanjin1，QIN Hailian1，SONG Shikai1，HU Fei1

（1 Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China; 2 The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530023，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Yiqi Yangyin Qingre Formula（YQYYQR） on type 2 diabetes mellitus（T2DM） by network pharmacology and molecular docking.Methods：TCMSP and BATMAN-TCM were used to obtain the chemical constituents and action targets of six Chinese medicinal drugs in YQYYQR.The targets related to the treatment of T2DM were obtained from GeneCards.The common targets were obtained by the R programming language.The core targets were screened out by CytoHubba plug-in in Cytoscape v3.8.0.The core targets were analyzed for Go and KEGG enrichment analyses by the ClueGo plug-in.AutoDockTool，Vina，and Pymol were used for pretreatment and molecular docking.Results：Seventy active constituents of YQYYQR were obtained，and 222 targets were involved in the active constituents，such as quercetin，kaempferol，luteolin，wogonin，and miscanthin.As revealed by GO and KEGG enrichment analyses of 13 core targets，36 entries of biological processes，such as responses to lipopolysaccharide，hypoxia，and oxidative stress，and 47 entries of pathways，such as IL-17 signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Toll-like receptor signaling pathway，and tumor necrosis factor signaling pathway，were obtained.The results of molecular docking showed that the core constituents showed good affinity with the core targets JUN，AKT1，MAPK1，TP53，IL6，MAPK14，ESR1，and CXCL8.Conclusion：YQYYQR can treat T2DM by regulating glucose and lipid metabolism，improving insulin resistance，inhibiting hepatic gluconeogenesis，reducing inflammatory reaction，protecting vascular endothelium，improving islet β-cell secretion，and mediating immune response through multiple channels，multiple targets，and multiple pathways.

Keywords Network pharmacology; Molecular docking; Yiqi Yangyin Qingre Formula; Type 2 diabetes mellitus

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.002

隨著人口老齡化的上升及生活方式的轉變，糖尿病患病率呈迅猛增加的趨勢，據統計，2013年發達國家2型糖尿病（T2DM）的患病率為1.2%，而發展中國家的患病率被認為已是其4倍以上[1-2]。T2DM是一組常見的以血糖增高為主要特征的糖、蛋白類、脂肪物質代謝紊亂的各系統損害的一種內分泌疾病，是由于人體內胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗而引發的[3]。糖尿病作為慢性代謝性疾病，已成為威脅老年人健康的重大公共衛生問題，其致殘率和病死率高，對我國的醫療衛生造成了極大的負擔。

中醫認為，T2DM屬“消渴”“消癉”等中醫范疇，陰虛燥熱為其基本病機。《證治要訣·三消》有云：“三消得之氣之實，血之虛，久久不治，氣盡虛，則無能為力矣。”《儒門事親·三消之說當從火斷》指出：“夫一身之心火，甚于上為膈膜之消;甚于中，則為腸胃之消;甚于下，為膏液之消;甚于外為肌肉之消。”因而“虛”“熱”論治在發病過程當中起著關鍵作用。李雙蕾等[4]認為在消渴其發病機制中，當屬氣陰虧虛，熱毒為患為要，并根據多年治療糖尿病的臨床經驗，精選藥物組成益氣養陰清熱方，該方由生黃芪、黃連、知母、麥冬、連翹、淮山藥組成。方中重用黃芪為君，其性甘溫，入脾胃經，補中益氣。山藥補脾益陰，滋腎固精，黃連清熱解毒，燥濕堅陰，二者為臣;知母苦寒質潤，瀉三焦虛火，滋陰潤燥，麥冬助知母養陰清熱生津，二者相和，共為佐藥;連翹清熱解毒，散結消腫，一清熱毒，二防補益太過，聚而為毒，為佐使之用。全方共奏益氣養陰，清熱解毒之效。

在前期研究發現，益氣養陰清熱方（YiQiYangYinQingReFang，YQYYQRF）能改善血糖、胰島素抵抗，降低炎癥介質水平等途徑調控血糖[4-6]。結合前期研究，本研究運用網絡藥理學方法，整合分析數據庫中藥有效成分與疾病的信息，對中藥復方潛在治療靶點進行預測，進一步探究益氣養陰清熱方治療T2DM的作用機制。

1 資料與方法

1.1 篩選益氣養陰清熱方有效成分及靶點獲取?? 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）獲取益氣養陰清熱方中生黃芪、黃連、知母、麥冬、連翹、淮山藥的有效成分，按照口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18的條件對有效成分進行篩選。在TCMSP中Related Targets標簽獲取各有效成分的靶點，并對所有中藥的有效成分、有效成分對應的靶點、有效成分對應的中藥名進行整合。利用Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-活性成分-靶點”網絡圖。

1.2 靶點基因注釋 將檢索獲取的中藥有效成分作用靶點，通過UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）校進行靶點基因注釋。

1.3 T2DM靶點的獲取 運用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫進行T2DM疾病靶點的選取，輸入“Type 2 Diabetes Mellitus”進行檢索，得到相關靶點。

1.4 獲取基因交集靶點 利用R軟件，對成分相關的靶點與疾病相關靶點取交集，并將篩選到的交集靶點上傳至在線韋恩圖網站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到活性化合物與疾病的交集基因。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡 將交集靶點導入到STRING數據庫（https：//string-db.org/），選定“Homo Sapiens”物種，試驗將置信度評分設置為>0.9（Highest Confidence），并選擇隱藏PPI網絡中斷開連接的節點（Hide Disconnected Nodes in The Network），其余參數默認，構建交集靶點相互作用網絡拓撲。利用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoHubba插件計算網絡中每個節點的拓撲參數（介數、自由度、接近中心性、平均最短路徑長度），并以所有節點這4個參數的中值作為篩選條件。當4個參數均大于中值的節點時被認為是PPI網絡中起核心作用的主要樞紐。

1.6 富集分析 利用Cytoscape 3.8.0軟件中GlueGO插件對核心靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG） 富集分析。設定P<0.05，并采用Bonferroni法進行校正，Kappa Score默認為0.4。

1.7 分子對接 通過以上結果分析，篩選出調控核心成分及核心靶點，用于分子對接的活性成分及靶點，并從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載小分子化合物結構，RCSB PDB（http：//www.rcsb.org/）數據庫下載相關靶點的蛋白結構，利用Auto Dock軟件去除水分子、氫等處理，運用AutoDock MGL Tools 1.5.6、Pymol 2.6、AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接模擬獲取對接能量。

2 結果

2.1 潛在活性成分的篩選和作用靶點預測 益氣養陰清熱方有效成分70個，其中黃芪16個，黃連10個，知母11個，連翹19個，山藥12個，麥冬1個。有效成分所對應的靶點258個。“中藥-活性成分-靶點”網絡中對應靶點最多的有效成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、漢黃芩素、芒柄花黃素，分別為對77個、33個、29個、22個、16個。見圖1。

2.2 疾病靶點篩選與共同靶點PPI構建 通過GeneCard以“Type 2 Diabetes Mellitus”作為關鍵詞搜索T2DM相關靶點1 786個（已去掉重合基因）。將1 786個疾病靶點與222個益氣養陰清熱方有效成分作用靶點交集靶點119個。見圖2。將靶點導入STRING建立PPI網絡。見圖3。利用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoHubba插件計算出核心靶點共13個。見表1。

2.3 富集結果分析 13個交集靶點GO生物過程（Biological Process，BP）得到36條通路。見圖4。生物過程富集結果主要包括RNA聚合酶Ⅱ對pri-miRNA轉錄的調控、白細胞趨化調節、RNA聚合酶Ⅱ對pri-miRNA轉錄的正調控作用、細胞對鎘離子的反應、內質網核信號通路等。KEGG富集分析結果共47條通路。調高P值至P≤0.01，Pathway Selection為6%，得到16條通路，主要涉及IL-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。見圖5。

2.4 益氣養陰清熱方核心靶點通路網絡構建 利用Cytoscape 3.8.0軟件，構建益氣養陰清熱方核心靶點—通路網絡。見圖6。圖6可見益氣養陰清熱方可通過多靶點作用于JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等多個靶點并干預AGE/RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。

2.5 益氣養陰清熱方主要成分與AKT1、STAT3、JUN的分子對接認證 選取“中藥-有效成分-靶標-通路”網絡圖中度值高于平均值的4個化合物（槲皮素、山柰酚、木犀草素、漢黃芩素、芒柄花黃素）與核心靶點（JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14）進行分子對接模擬，一般認為其絕對值大于5的時候，小分子和蛋白二者結合的可能性較大[7]。見表2，圖7。結果提示益氣養陰清熱湯的核心成分均與JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等關鍵靶點有較好的親和力。

3 討論

目前針對T2DM的研究主要圍繞肥胖相關的胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷以及通過B細胞凋亡導致的B細胞質量下降等幾個方面的病理改變展開，并與炎癥改變、免疫基因缺陷和線粒體功能受損等具有密切聯系[8-9]。以此將對網絡藥理學分析結果即益氣養陰清熱方治療T2DM的潛在機制結果及潛在藥效物質和關鍵靶點分子對接結果進行討論。

3.1 活性成分及靶標 本研究利用網絡藥理學從多基因、多通絡、多靶點進行整體分析，得出益氣養陰清熱方治療T2DM的有效成分70個，核心主要有：槲皮素、山柰酚、木犀草素、漢黃芩素、芒柄花黃素。槲皮素是多種中草藥中黃酮類化合物，益氣養陰清熱方中，連翹、黃芪、黃連中均含有槲皮素，其具有良好的生物學價值，具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，有研究表明，槲皮素可較好地改善糖脂代謝紊亂及保護胰島功能，其機制可能與干預AKT信號通路及上調SIRT1的活性和蛋白水平有關[10]。槲皮素亦能通過抑制炎癥途徑，特別是核因子κB信號轉導，具有預防糖尿病血管并發癥的潛在作用[11]。研究發現，山柰酚抑制肝糖異生，其機制可能與干預肝臟AKT信號相關[12]。木犀草素可降低PKB/AKT、PRAS40-、p70S6K-和S6的磷酸化，從而降低肝葡萄糖生成）和減少肝臟脂肪變性[13]。漢黃芩素對T2DM小鼠視網膜病變有一定改善作用，并能阻斷高血糖誘導的血管炎癥的發生，其機制可能與抗氧化、增加核因子κB的活化、CAMs的表達、保護內皮屏障功能的破壞等相關[14-15]。研究表明芒柄花青素能顯著提高胰島素敏感性指數，降低HOMA-IR，改善胰島素抵抗，其機制可能與增加SIRT1的表達有關[16]。

3.2 PPI網絡拓撲分析

CytoHubba分析結果看出，核心靶點有JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等。c-Jun N-Terminal Kinases（JUKS）是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族的成員，肥胖引起的慢性炎癥激活JNK及其相關通路，導致糖、脂代謝受損，阻斷胰島素信號轉導，降低胰島素靶細胞的胰島素敏感性[17-18]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K-AKT信號通路中的關鍵蛋白。其磷酸化與糖、脂代謝密切相關[19]。研究發現，MiR-423-5p通過抑制肝臟中FAM3A-ATP-AKT通路，促進肝臟糖異生和脂質沉積，并誘導葡萄糖不耐受、胰島素抵抗和高血糖。功能失調的AKT會導致糖脂代謝紊亂[20]。

MAP激酶又稱細胞外信號調節激酶（Extracellular Signal Regulated Kinases，Erks）是多種生化信號的整合點，參與細胞增殖、分化、轉錄調控和發育等多種過程[21]。過量攝入熱量可導致T2DM樣疾病小鼠脂肪組織中氧化應激的積累，并促進衰老樣改變，從而導致TP53表達增加和炎癥介質生成增加[22]。研究表明IL-6與胰島素抵抗和胰島素分泌障礙有密切相關[23]。

3.3 富集結果分析 KEGG通路富集結果中，較為關鍵的是IL-17信號通路、AGE/RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路等。研究表明，T2DM可能是一種由細胞因子介導的先天免疫性疾病和炎癥反應，炎癥介質的釋放是誘導發生胰島素抵抗以及影響胰島素分泌的重要因素[24]。白細胞介素-17（IL-17）家族是由IL-17A-F組成的細胞因子亞群，在急性和慢性炎癥反應中起著至關重要的作用[25]。肥胖相關2型糖尿病患者的T細胞炎癥的特征是循環Th17細胞數量增加，Th17衍生細胞因子產生增加，Th17標志基因激活，此外，T2DM患者血漿DPP4活性的增加與循環Th17細胞DPP4的分泌增強有關，因而IL-17信號通路在糖尿病炎癥反應中起著重要作用[26-27]。AGEs/RAGE信號通路是導致糖尿病多種組織細胞損傷的重要機制，其可誘導下游不同的信號通路，如JAK/STAT、PKC/PI3K/AKT、MAPK/Erk和Src/RhoA/Cdc42等，它們可激活各種轉錄因子，參與炎癥的基因轉錄，與糖尿病微血管和大血管并發癥發病密切相關[28]。

綜上所述，我們推測益氣養陰清熱湯可能通過作用于IL-17信號通路、AGE/RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路在T2DM的治療中發揮調控血糖，改善胰島素抵抗，調節免疫，抑制炎癥反應等作用。因而選擇通路中的關鍵靶點與益氣養陰清熱湯關鍵有效成分進行分子對接以分析它們之間的親和力進一步論證。

3.4 分子對接預測結果 分子對接是計算蛋白質-配體相互作用最廣泛的方法，本研究結果提示，益氣養陰清熱湯的核心成分均與JUN、AKT1、MAPK1、TP53、IL6、MAPK14等關鍵靶點有較好的親和力，佐證其有可能通過作用于以上幾種關鍵靶點而治療T2DM。

前期研究和臨床觀察已證實益氣養陰清熱方在治療T2DM中具有可觀的臨床療效。本研究運用網絡藥理學與分子對接技術，預測益氣養陰清熱方治療T2DM的起效機制，挖掘其潛在作用機制，研究結果得出益氣養陰清熱方通過多成分，多靶點，多通路調節糖脂代謝、改善胰島素抵抗、抑制肝糖異生、降低炎癥反應、保護血管內皮、改善胰島B細胞分泌功能、調節免疫反應等途徑治療T2DM，并為后續的益氣養陰清熱方藥理機制提供了生物學研究的依據。本研究以數據挖掘和數據分析為基礎的預測性研究，具有一定的局限性，因而亟須通過進一步基礎研究進行驗證，并積極回歸臨床，更好地發揮中醫藥的優勢。

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（2020-12-24收稿 本文編輯：魏慶雙）