LncRNA SIL對肺泡上皮細胞增殖和遷移的抑制作用研究

張萬方，潘鵬濤，何金嬌，朱艷平，王選年

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是以肺部蜂窩狀結構改變引起限制性通氣障礙為主要特征的一種間質性肺部疾病。大量研究證明lncRNA與肺纖維化有重要的關系，例如，lncRNA PFAR[1]，lncRNA ZEB1-AS1[2]，lncRNA ITPF[3]，lncRNA PFRL[4]以及lncRNA PFAL[5]等參與了肺纖維的發生過程。轉化生長因子(transforming growth factor, TGF-β1)是誘導肺泡上皮細胞間質轉化的關鍵因子[6]。使用TGF-β1誘導后，肺泡上皮細胞標志蛋白E-Cadherin(E.cad)的表達量降低，間質細胞標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Collagen-1的表達量升高[7]。LncRNA SIL是突觸極蛋白2(SYNPO2)第四個內含子[8]，前期研究顯示lncRNA SIL在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化組織中表達降低，推測lncRNA SIL可能是肺纖維化的潛在抑制因子。該文研究了lncRNA SIL在TGF-β1誘導肺泡上皮細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)中的表達變化，并構建了lncRNA SIL真核表達載體，通過研究過表達lncRNA SIL后肺泡上皮細胞生長特性以及標志蛋白表達的變化，分析lncRNA SIL在肺纖維化發生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料肺泡上皮細胞株(A549)購自上海生物科學研究所；鼠抗人抗體PCNA、E.cad 、α-SMA和Collagen-1購自美國Abcam公司；鼠抗人抗體GAPDH 購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠二抗購自美國Abcam公司。熒光顯微鏡80i購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1RNA 熒光原位雜交(RNA fish) 細胞RNA fish采用廣州博銳生物科技有限公司 lncRNA FISH 試劑盒，按照說明書的要求進行原位雜交實驗。具體步驟如下：細胞通過4%的多聚甲醛室溫固定10 min，每孔加入1 ml 預冷的0.5% Triton X-100 的PBS，4 °C靜置 5 min；加入1× PBS清洗細胞 3次，每次5 min，加入RNA探針37 °C孵育過夜，避光42 ℃，SSC緩沖液清洗細胞3次，每次5 min，清洗、避光，加入DAPI 染色液，室溫染色10 min, 使用熒光顯微鏡觀察并拍照記錄(80i, 日本Nikon公司)。

1.2.2轉染 合成的全長lncRNA SIL連接在pCMV-sport6載體上，使用Lipo3000將lncRNA SIL重組質粒轉染到A549細胞中，pCMV-sport6空載體做為陰性對照，在轉染后4～6 h更換完全培養液，同時加入TGF-β1(5 μmol/L)誘導，分別在誘導24、48 h收材作進一步檢測。

1.2.3RT-PCR 收集處理后的A549細胞，加入TRIzol消化，提取RNA。使用Nanodrop 2000檢測RNA的純度和濃度，并逆轉錄成cDNA。以逆轉錄的cDNA為模板，加入引物、2×qPCR MasterMix (SYBR Green)和ddH2O，混勻后放入熒光定量PCR儀中，反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，40個循環。根據公式2-△△Ct，以GADPH為內參進行定量分析。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列表

1.2.4細胞劃痕實驗 收集細胞、計數并以5×105個/L的密度鋪板，待細胞密度達到70%時轉染，24 h后使用無菌20 μl槍頭劃線，隨后PBS洗細胞3次，加入0.5%血清的DMEM培養基培養，分別于0、24、48 h采集細胞遷移圖像，觀察細胞傷口愈合情況并計算細胞的遷移率[9]。

1.2.5Western blot 取處理后的細胞，裂解細胞提取總蛋白。SDS-PAGE電泳后，轉膜，室溫封閉1～2 h，加入一抗 PCNA (1 ∶1 000)，E.cad (1 ∶1 000)，α-SMA (1 ∶1 000)，Collagen-1 (1 ∶500)，GAPDH (1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標記的二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h。加入ECL試劑進行顯色。

1.2.6免疫熒光實驗 在24孔板中放入蓋玻片，接種A549細胞，待細胞長到70%～80%時轉染，48 h后，使用4%多聚甲醛固定細胞5 min，PBST洗滌3次，每次5 min，加入含有1% BSA的封閉液室溫封閉1 h，加入PBST清洗3次，每次5 min，加入一抗(1 ∶200)，4 ℃封閉過夜，避光條件下加入Cy3標記的二抗(1 ∶500)，室溫孵育1 h，加入PBST洗滌3次，每次5 min。避光加入DAPI室溫孵育10 min，固定到載玻片上，于熒光焦顯微鏡下觀察拍攝照片[10]。

2 結果

2.1 lncRNA SIL在TGF-β1誘導的肺泡上皮細胞間質轉化中表達降低在培養的肺泡上皮細胞A549中加入TGF-β1誘導EMT，并分別通過RNA fish與RT-PCR檢測lncRNA SIL的表達情況。結果顯示，TGF-β1誘導48 h后細胞中的lncRNA SIL的表達量與陰性對照組和轉染lncRNA對照組相比熒光強度和數量均降低(圖1A)。RT-PCR檢測TGF-β1誘導24 h和48 h后lncRNA SIL的表達情況，結果顯示，lncRNA SIL的表達量隨著TGF-β1的誘導時間的延長逐步降低，方差分析顯示，3組之間lncRNA SIL的表達量差異有統計學意義(F=298.8,P<0.01)，誘導24 h細胞lncRNA SIL的表達量低于未誘導組(F=14.4,P<0.05)，誘導48 h細胞lncRNA SIL的表達量低于與誘導24 h(F=10.25,P<0.01)(圖1B)。

2.2 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549遷移lncRNA SIL基因序列全長為1 914 nt，由上海生工生物工程有限公司合成，構建重組真核表達載體pCMV-lncRNA SIL。將構建的重組質粒pCMV-lncRNA SIL轉染到肺泡上皮細胞A549中，其中空載體pCMV為陰性對照。結果顯示，與空載體pCMV對照組相比，轉染lncRNA SIL后細胞的遷移能力降低，見圖2。

2.3 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549增殖lncRNA SIL對A549細胞增殖方面作用的研究結果顯示：轉染后，過表達lncRNA SIL組細胞的增殖能力低于對照組；細胞增殖相關蛋白PCNA和Ki67表達變化的研究顯示，過表達lncRNA SIL后，PCNA的表達量與對照組相比降低；Ki67 mRNA表達水平也比對照組降低，免疫熒光結果圖中可以看出過表達lncRNA SIL組細胞Ki67蛋白的熒光信號比對照組減少，見圖3。

2.4 過表達lncRNA SIL抑制間質細胞標志蛋白的表達lncRNA SIL在TGF-β1誘導的EMT過程中對相關細胞標志蛋白表達變化的研究結果顯示。當使用TGF-β1對細胞進行誘導時，標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達量比未誘導組升高。當TGF-β1誘導并同時轉染lncRNA SIL后，標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達量與轉染空載體pCMV相比降低，標志蛋白E.cad的表達量與轉染空載體pCMV相比升高。由此說明lncRNA SIL能夠抑制TGF-β1誘導的EMT，也揭示出lncRNA SIL很有可能通過抑制EMT最終達到抑制肺纖維化的目的。

圖1 LncRNA SIL在TGF-β1誘導的肺泡上皮細胞A549間質轉化中表達降低 ×400

圖2 過表達lncRNA SIL抑制肺泡上皮細胞A549遷移 ×40與空載體pCMV組比較：**P<0.01

3 討論

LPF是一種慢性、進行性、不可逆性的肺間質組織異質性疾病，隨著年齡增長顯著增加，男性發病率更高，發病機制不清楚，致殘率、病死率高，診斷后的平均生存期僅為2～5年[11]。因此研究肺纖維化的發病機制對臨床診斷和治療具有重要的意義。

LncRNA通常指一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉錄本，雖然lncRNA不具有編碼蛋白的功能，越來越多的研究[12]發現，lncRNA與細胞生長、增殖、遷移、侵襲以及藥物耐性等多種重要生命過程有重要的關系。近年有研究[13]發現一些lncRNA參與到了肺纖維化發生的調控中，例如lncRNA DNM3OS在TGF-β誘導的肺肌細胞激活中發揮重要作用；lncRNA sirt1 AS能夠抑制TGF-β1介導的EMT[4]；lncRNA H19在IPF患者以及博來霉素處理小鼠的肺組織中表達上調，缺失lncRNA H19可改善博萊霉素誘導的肺纖維化[14]等。LncRNA SIL是近年來新發現的lncRNA，本實驗的前期研究結果顯示lncRNA SIL在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中表達降低，因此推測其可能參與了肺纖維化的調控。本文為研究lncRNA SIL對TGF-β1誘導的EMT過程的影響，首先利用TGF-β1誘導A549細胞進行上皮間質轉化，并檢測誘導后lncRNA SIL的表達量的變化。結果顯示，TGF-β1誘導后細胞中lncRNA SIL表達量低于對照組，此結果與前期動物模型中的結果一致。為了進一步證明lncRNA SIL的作用，構建了lncRNA SIL真核表達載體，通過向A549細胞中轉染lncRNA SIL，分析過表達lncRNA SIL后對細胞的增殖與遷移能力的影響。結果顯示，過表達lncRNA SIL后細胞的增殖與遷移能力均比對照組降低；對相關標志蛋白的研究結果從另一方面證明了lncRNA SIL的作用，結果顯示，過表達lncRNA SIL后，與對照組相比間質細胞標志蛋白α-SMA和Collagen-1的表達降低，而肺泡上皮細胞標志蛋白E.cad的表達升高。以上結果證明lncRNA SIL很可能是一種肺纖維化的抑制因子，其通過抑制肺泡上皮細胞的增殖、遷移和轉化最終達到抑制肺纖維化的目的。

圖3 過表達lncRNA SIL對A549細胞增殖能力的影響

圖4 過表達lncRNA SIL對抑制間質細胞標志蛋白的表達與空載體組比較：*P<0.05