酒糟腐熟專用液態復合菌劑發酵條件研究

馬 倩，何頌捷，陳 靜，左 勇，*，秦世蓉，宋 華，胡 琨

（1.四川師范大學生命科學院，四川 成都 610101；2.自貢檢驗檢測院，四川 自貢 643200；3.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；4.四川施利旺農業科技開發有限公司，四川 宜賓 644000）

酒糟中富含氮、磷、鉀等物質，可作為有機肥的生產原料，利用其生產的有機肥中氮、磷、有機質含量可分別達3%、1%、70%。有研究表明，用酒糟生產的有機肥，與其他微生物菌劑合施，其肥效高于復合肥和普通有機肥［1-2］。不同施肥處理對土壤微生物數量和酶活性的影響差異顯著，一方面表現為酒糟生物有機肥+微生物菌劑＞普通有機肥＞復合肥的趨勢［3］；另一方面表現為隨酒糟生物有機肥施肥量的增加，土壤微生物數量和酶活顯著提高，產量也隨之增加［4］。另外，酒糟和微生物菌劑作為功能微生物的載體，賦予土壤大量的微生物源，起到了“接種”的作用［5］。在拔節期，土壤真菌數量隨酒糟生物有機肥施用量的變化趨勢表明，酒糟生物有機肥不但能增加土壤細菌、放線菌的數量，還能降低土壤有害真菌的數量，改善微生物結構和功能，提高微生物多樣性，從而實現土壤微生物生態平衡［6-7］。

國內外學者就這一課題展開了大量研究［8］。2008年，法國農業科學院教授Parnaudeau等［9］研究發現稀釋或濃縮的酒糟均可作為有機肥，提高土壤肥效，并且酒糟在腐熟過程中的發酵作用對肥效有顯著增強作用。2014年，曹建蘭等［10］利用白酒丟糟發酵生產有機肥時，發現功能微生物對酒糟進行二次發酵生產有機肥的方法是可行的，其研究結果表明酒糟可以作為基質生產生物有機肥，但存在酒糟腐熟周期較長的問題。2017年，林金新等［11］采用多菌種混合固態發酵白酒丟糟，利用不同微生物之間的協同作用，增加腐殖質的含量，提高肥效。

白酒酒糟中含有豐富的纖維素［2］，施用酒糟生物肥后易出現二次發酵而導致燒苗的現象，不利于白酒丟糟有機肥的使用和推廣，而白酒丟糟中含有的大量微生物對酒糟腐熟具有重要作用，因此將能高效降解酒糟的功能菌進行復配，用以制備酒糟腐熟活菌制劑，最終基于酒糟腐熟活菌制劑開發酒糟有機肥。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

貝萊斯芽孢桿菌誘變菌種（UN-5）、里氏木霉，實驗室保存；酒糟來自宜賓某酒企業。

1.1.2 主要試劑

羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、氯化鈉、硫酸銨，成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉、冰醋酸、苯酚，成都科隆化工試劑廠；氫氧化鈉，重慶川東化工集團有限公司。

1.1.3 儀器設備

STARTER2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；YXQ-LS-75S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ME104E/02電子天平：托利多儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喬欣科學儀器有限公司；GZ-250-HS11恒溫恒濕培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司；THZ-98A恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將UN-5和里氏木霉接種到PDA培養基平板上，37℃條件下靜置恒溫培養2～3 d。

1.2.2 菌懸液的制備

將活化好的菌種接種到PDA液體培養基中，37℃、150 r/min條件下振蕩培養24 h。

1.2.3 生長曲線繪制

采用光電比濁法測定原始菌株的生長曲線［12］：菌株在37℃、150 r/min條件下發酵培養24 h，吸取2 mL菌液，每4 h在波長540 nm條件下測定OD540值，繪制菌株UN-5和里氏木霉生長曲線。

1.2.4 纖維素酶活性曲線的繪制

纖維素酶活的測定：將菌液接種至250 mL液體發酵培養基中，在37℃、150 r/min條件下發酵培養24 h，吸取2 mL菌液，12000 r/min離心5 min，取上清液，即為粗酶液［13］。取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL 1% CMC緩沖液，50℃水浴30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷卻后定容至10 mL。對照組加0.5 mL滅活的粗酶液代替粗酶液，其他條件不變，540 nm波長條件下測定OD540值。

1.2.5 拮抗實驗

采用平板對峙法：將UN-5和里氏木霉菌懸液兩兩交叉劃線接種于羧甲基纖維素鈉培養基上［14］，37℃恒溫培養2 d，觀察培養基上十字交叉處是否出現由于菌種相互抑制而導致菌落縮小或消失的現象，以此判斷菌種之間是否存在拮抗作用［15］。

1.2.6 耐酸性實驗

配置不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）的羧甲基纖維素鈉培養基，取5 mL待測菌懸液分別接種于培養基上，37℃恒溫培養24 h［16］。用紫外分光光度計測定培養前、后的OD540值［17］，以培養前、后的OD540值之差表示菌種的耐酸性（差值越大說明耐酸性越強）。

1.2.7 菌劑有效活菌數的測定

將菌懸液用10倍梯度稀釋法分別稀釋至10-9、10-8和10-73個梯度，每個梯度分別取0.1 mL涂布于羧甲基纖維素鈉培養基，并做3個平行，與涂布無菌水的平板對比（復合菌劑的有效活菌數以數量級最大的表示）［18］。

1.2.8 復合菌劑的制備

按照1.2.1和1.2.2的方法分別制備菌株UN-5和里氏木霉菌懸液，根據1.2.4～1.2.7的實驗結果將活性處于較高階段的UN-5和里氏木霉按一定配比混合，制備成酒糟腐熟發酵液態復合菌劑，通過單因素和正交實驗，對復合菌劑的制備條件進行優化［19］。

（1）菌種配比對菌劑酶活的影響：制備單菌種菌懸液，按1∶1、1∶2、1∶3、2∶1和3∶1比例將單菌種菌懸液進行混合，37℃恒溫培養2 d，測定復合菌劑纖維素酶活。

（2）培養基pH對菌劑酶活的影響：調整培養基的pH分別至2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，于37℃恒溫培養2 d，UN-5和里氏木霉按2∶1混合，測定復合菌劑纖維素酶活。

（3）培養時間對酶活的影響：制備單菌種菌懸液，UN-5和里氏木霉按2∶1混合，于37℃下分別培養12、24、36、48和60 h，測定纖維素酶活。

（4）復合菌劑的制備條件優化：在菌種配比、培養基pH和培養時間單因素實驗結果的基礎上進行正交實驗，實驗選取以上3個因素，以復合菌劑的纖維素酶活為指標，采用L9（34）正交實驗設計對復合菌劑制備條件進行優化［20］，采用SPSS 19.0數據處理系統對正交實驗數據進行一般線性模型分析［21］。

根據單因素實驗結果，對影響菌劑酶活的幾個因素即菌種配比、培養pH和培養時間為實驗因素，以纖維素酶活為實驗指標設計正交實驗，見表1。

表1 復合菌劑制備正交實驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 生物量和酶活性曲線

從圖1可知，生長曲線和酶活性曲線都是先增長，達到峰值后稍有下降直至平衡。培養前4 h菌體還處于遲緩期生長繁殖緩慢階段，4 h后菌體濃度快速增加，在12 h左右進入對數期，菌體濃度增長速率加快，超過24 h后菌群增殖和死亡數量趨于平衡進入穩定期，OD540值緩慢增加。隨后，菌群進入衰亡期，生理代謝活動趨于停滯，酶活開始下降且OD540值趨于平穩。UN-5在培養至24 h之前，纖維素酶活隨培養時間而增加；培養24 h后由于發酵液中底物消耗較多和產物的反饋抑制，酶活緩慢下降一段時間后達到平衡，在培養24 h左右時UN-5纖維素酶活達到最高，為105.8 U，達到最高后酶活和生物量都稍有下降后趨于平穩。

圖1 UN－5菌株生長曲線和酶活性曲線

由圖2可知，前期里氏木霉較UN-5生長速率緩慢，達到衰亡期的時間更長，在32 h后才進入衰亡期，酶活表現也隨生物量的增加而增加，在28 h左右酶活達到最高，為53.5 U；由于里氏木霉為霉菌，因此衰亡較快，達到衰亡期后酶活也呈下降趨勢。

圖2 里氏木霉生長曲線和酶活性曲線

2.2 拮抗及耐酸性實驗結果

進行拮抗實驗是為了探明兩株菌共存時二者是否存在拮抗作用，影響微生物的生長及活性，從而影響復合菌劑對酒糟腐熟發酵的效果。結果（圖3）表明，菌株UN-5和里氏木霉在平板上生長交叉處未出現明顯的菌落萎縮或消失現象，表明兩株菌之間不存在拮抗作用，可進一步用于復合菌劑的制備。

圖3 拮抗實驗結果

對兩株菌的耐酸性進行實驗，結果（圖4）表明，兩株菌在低pH下仍能生長，但相較于pH較高的環境，生長明顯受到了抑制。其中UN-5菌株比里氏木霉的耐酸性更強，在pH 2.0時仍能正常生長，而里氏木霉在pH 2.0時則無法生長。原始酒糟的pH在3.0～4.0，通過耐酸性實驗表明UN-5和里氏木霉有較強的耐酸性，兩株菌適合投入到酒糟的腐熟發酵中使用。

圖4 耐酸性實驗結果

2.3 菌種配比對菌劑纖維素酶活的影響

UN-5為貝萊斯芽孢桿菌經復合誘變的突變株，里氏木霉屬于霉菌，由于兩種菌的增菌時間、菌株大小、纖維素酶活不同，對兩株菌不同配比混合發酵液纖維素酶活進行測定。結果（圖5）表明，UN-5比例大時，復合菌劑酶活較高；UN-5比例減小，復合菌劑酶活也隨之下降。當UN-5∶里氏木霉高于2∶1時，復合菌劑的酶活高于單獨UN-5酶活；當比例小于1∶1時，復合菌劑的酶活低于UN-5菌株單獨酶活，高于里氏木霉單獨酶活；當比例為2∶1時，復合菌劑酶活最高，為120.66 U；當比例為3∶1時，復合菌劑酶活略微下降，因此初步判斷UN-5∶里氏木霉最佳比例在1∶1～3∶1。

圖5 不同菌種配比對纖維素酶活的影響

2.4 培養基pH對菌劑纖維素酶活的影響

培養基pH對復合菌劑纖維素酶活的影響結果如圖6所示。復合菌劑酶活隨pH升高而增強。當pH為2.0時，強酸環境抑制了菌株的活性，復合菌劑的纖維素酶活較低，僅為16.86 U。隨著pH增加，酸性環境對菌株的抑制作用減小，菌劑的酶活隨之增強，當pH為4.0～7.0時，酶活增強效果不如pH為2.0～4.0時明顯，考慮到酒糟中呈酸性環境，選擇培養基pH為4.0～5.0來確定最優發酵pH。

圖6 培養基pH對纖維素酶活的影響

2.5 培養時間對酶活的影響

兩株菌混合發酵時培養時間對制成的復合菌劑酶活的影響結果如圖7所示。復合菌劑纖維素酶活變化曲線趨勢與單菌液酶活曲線相似，由于兩種菌的相互作用，在培養8～24 h酶活增加較快，在混合培養24 h時酶活達到最高，為110.65 U。培養超過32 h后由于底物消耗較多和產物的反饋抑制，復合菌劑的酶活開始下降，故確定復合菌劑的最佳培養時間范圍為24～32 h。

圖7 培養時間對纖維素酶活的影響

2.6 生物有機肥中有效活菌數

生物有機肥有效活菌數是評價微生物肥料質量的關鍵指標，在酒糟制備有機肥的過程中加入微生物菌劑有利于提高成品中有效活菌數的含量。

如圖8所示，經堆肥腐熟后，投用UN-5的有機肥中有效活菌數達到了0.5 億/g，投用里氏木霉的有機肥中有效活菌數為0.4 億/g左右。由于里氏木霉是霉菌，單個菌體較大，同體積內的有效活菌數較UN-5少，投用復合菌劑中有效活菌數只有1.3 億/g左右。

圖8 單菌種和復合菌劑有機肥中有效活菌數

2.7 正交實驗結果

根據單因素實驗結果，選擇影響菌劑酶活的幾個關鍵因素，菌種配比、培養pH和培養時間為實驗因素，以纖維素酶活為實驗指標，采用L9（34）正交表進行正交實驗，結果見表2。

表2 復合菌劑制備條件優化正交實驗結果

由表2可見，采用極差法分析正交實驗（極差越大對纖維素酶活影響越大），對纖維素酶活影響由高到低為C因素＞B因素＞A因素。從各因素水平均值可見，A2、B2、C2均值最高，最佳組合為A2B2C2。由表3可見，A因素、B因素、C因素對纖維素酶活影響在0.05水平達到顯著（P＜0.05），影響由高到低依次為C因素、B因素、A因素，與極差分析結果一致。根據正交實驗結果，取A2、B2和C2進行驗證實驗，得到復合菌劑纖維素酶活為125.24 U，符合方差分析結果，且有效活菌數達到10.3億/g。

表3 方差分析

綜上，考慮實驗誤差，對纖維素酶活影響由高到低依次是培養基pH、菌種配比、培養時間；從各因素水平均值可見，A2、B2、C2均值最高，最佳組合為A2B2C2，即培養時間28 h、菌種配比2.5∶1、培養基pH為5.0時，制得復合菌劑纖維素酶活最高。

3 結論

對UN-5和里氏木霉的復配研究結果表明：菌株UN-5和里氏木霉之間不存在拮抗作用，且兩株菌均有較強的耐酸性，單菌在培養24 h左右時，纖維素酶活性達到最高水平，分別為105.8和53.5 U。通過單因素和正交實驗優化復合菌劑制備條件，結果表明，對復合菌劑酶活影響強弱順序為：培養基pH＞菌種配比＞培養時間，得到復合菌劑最佳制備條件為UN-5∶里氏木霉為2.5∶1、培養基pH為5.0、培養時間為28 h。經此條件制備的復合菌劑纖維素酶活達125.24 U，有效活菌數為10.3 億/g，可直接用酒糟腐熟，進而生產生物有機肥。