發酵乳桿菌BLHN3的高密度培養優化

左夢楠 劉 偉,2,3 張菊華,2,3 全 琦

(1. 湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410000；2. 湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南 長沙 410000；3. 果蔬貯藏加工與質量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410000)

發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)不僅可以改善食品風味[1]，增加營養[2]，還具有降膽固醇[3]、抗病毒[4]、提高免疫、促進腸道健康等益生特性[5]。發酵乳桿菌代謝產物如胞外多糖(EPS)、抗菌肽，可以作為食品添加劑[6]、食品防腐劑或抗生素的替代品等[7]，在食品保鮮方面也有重要應用[8]。

高密度培養是制備高效型發酵劑的前提，培養基作為菌體的營養物質來源，優化培養基是獲得乳酸菌高密度培養的關鍵。胡淵等[9]優化了干酪乳桿菌高密度培養的營養成分，活菌數達到2.81×1012CFU/mL，較在MRS培養基中培養提高了8.21倍。鄭柳青[10]對鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01的生長條件進行了響應面優化，其活菌數為9.08×108CFU/mL。Zhang等[11]通過Box-Behnken設計優化了培養基組分9.5 g/L葡萄糖、15.5 g/L水解酪蛋白和7.0 mg/L谷氨酸，保加利亞乳桿菌活菌數達(2.95±0.07)×109CFU/mL。Gutuierrez-Sarmiento等[12]對植物乳桿菌BAL-03-ITTG的培養條件進行了響應面優化，活菌數為7.10×109CFU/mL。Wang等[13]對鼠李糖乳桿菌LS-8的培養基和發酵條件進行了優化，活菌數提高到4.5×109CFU/mL。綜上，優化培養基成分和培養條件對提高發酵乳桿菌的密度具有重要意義。

發酵乳桿菌BLHN3是從自然發酵的剁辣椒中分離篩選出的抗氧化能力較強、產香性能優良的菌株，將其制備成直投式發酵劑應用于剁辣椒加工，有望提升產品發酵品質和生產效率[14]。研究擬采用單因素和響應面優化試驗，以MRS培養基為對照，探究發酵乳桿菌BLHN3菌株的最適培養基組分及生長條件，以期為發酵乳桿菌BLHN3發酵劑的制備提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

發酵乳桿菌BLHN3(LactobacillusfermentumBLHN3)：-80 ℃甘油保藏；

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基、大豆蛋白胨、細菌學蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸粉：生物試劑，廣東環凱微生物科技有限公司；

乳清蛋白粉WPC90：食品級，浙江一諾生物科技有限公司；

菊粉、結晶海藻糖：食品級，鄭州明欣化工產品有限公司；

無水葡萄糖：食品級，西王藥業有限公司；

蔗糖、乳糖：食品級，美國Leprino Foods公司；

可溶性淀粉、D-半乳糖：食品級，安徽山河藥用輔料股份有限公司；

胡蘿卜、平菇、土豆、包菜、西紅柿、黃漿水：市售。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：AS 220.R2型，蘇州培科實驗室儀器科技有限公司；

紫外可見分光光度計：T6新世紀，北京普析通用儀器有限責任公司；

pH計：雷磁PHS-3E型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1C型，蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；

滅菌鍋：LDZM-80L-III型，上海申安醫療器械廠；

冷凍離心機：Avant J-26XP型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

生化培養箱：SPX-150型，中儀國科(北京)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化培養 將甘油管保藏的菌種按體積分數3%接種于10 mL的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h作為第一代菌種，再培養14 h進行傳代培養2次。

1.2.2 活菌數測定 參照GB 4789.35—2016。

1.2.3 菌株生長曲線 將活化菌株以體積分數3%接種量接種至MRS肉湯培養基中，37 ℃發酵靜置培養1 d，每隔2 h取樣，測定pH、OD600 nm值和活菌數。

1.2.4 發酵培養基單因素試驗

(1) MRS培養基組成：細菌學蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母提取粉4 g，葡萄糖20 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL。

(2) 增菌因子制備方法：胡蘿卜、包菜、土豆、平菇、西紅柿經預處理后加5倍水榨汁，與黃漿水分別經雙層紗布過濾，冷藏備用。

(3) 發酵培養基碳源、氮源、緩沖鹽及增菌因子營養成分的篩選：以MRS培養基為基礎，分別以20 g/L海藻糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、淀粉、菊粉代替MRS培養基中的碳源；在碳源優化的基礎上，分別添加24 g/L的牛肉浸粉、細菌學蛋白胨、乳清蛋白粉、酵母提取粉、大豆蛋白胨代替MRS培養基中的氮源；在碳、氮源優化的基礎上，分別添加9 g/L的檸檬酸銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉/磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀/磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀代替MRS培養基中的緩沖鹽。靜置培養14 h測定活菌數；在前期優化基礎上，研究增菌因子(體積分數10%)黃漿水、胡蘿卜汁、包菜汁、土豆汁、平菇汁、西紅柿汁對菌株生長的影響，保持其他組分不變，靜置培養14 h后測定活菌數。

(4) 發酵培養基成分單因素優化：確定最佳碳源、氮源、緩沖鹽及增菌因子后，分別調整不同組分的添加量，以3%接種量靜置培養14 h，以活菌數為考核指標確定最佳添加量。

1.2.5 發酵培養基響應面優化試驗 在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇對發酵乳桿菌BLHN3活菌數影響顯著的海藻糖、大豆蛋白胨、胡蘿卜汁添加量為自變量，活菌數為響應值，優化發酵乳桿菌BLHN3的培養基。

1.2.6 培養條件優化

(1) 初始pH：將活化菌株以3%接種量接種至初始pH為4.0，6.0，8.0，10.0，12.0的優化培養基中，37 ℃靜置培養1 d，測定活菌數。

(2) 培養溫度：將活化菌株以3%接種量接種至優化培養基中，分別于21，25，29，33，37，41，45，49 ℃靜置培養1 d，測定活菌數。

(3) 接種量：將活化菌株以1%，2%，3%，4%，5%接種量接種至優化培養基中，37 ℃靜置培養1 d，測定活菌數。

(4) 裝液量：將活化菌株以最佳接種量分別接種至裝有15，30，45，60，75，90 mL培養基的三角瓶中，37 ℃靜置培養1 d，測定活菌數。

1.2.7 半連續高密度培養 將活化菌株以3%接種量接種至優化培養基中，37 ℃靜置培養14 h，3 800 r/min離心10 min[15]，再用等量新鮮培養基替換原發酵液，繼續培養2.5～3.0 h，測定活菌數，按式(1)計算比生長速率。

μ=(lny2-lny1)/(t2-t1)，

(1)

式中：

μ——比生長速率，h-1；

y1、y2——t1、t2時的乳酸菌量，CFU；

t1、t2——時間，h。

1.3 數據處理

每組試驗平行3次，采用Origin軟件作圖。利用IBM SPSS Statistics 25軟件進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 發酵乳桿菌生長曲線

由圖1可知，發酵乳桿菌的生長曲線和OD600 nm值曲線變化基本一致。0～2 h為發酵乳桿菌BLHN3生長停滯期，此時期活菌數變化相對較??；2～14 h為發酵乳桿菌BLHN3對數生長期，此時期營養物質豐富、細胞生長旺盛；14～18 h為發酵乳桿菌BLHN3生長穩定期，此時期活菌數基本穩定，細胞死亡數與增殖數趨于平衡；18 h后為生長衰亡期，增殖速率變慢，死亡菌數增多，活菌數呈下降趨勢。從pH變化曲線可知，pH在2～8 h下降迅速，8 h后基本穩定，是因為乳酸菌發酵過程不斷產生乳酸，但過多的乳酸會抑制乳酸菌生長，導致產酸減少。

圖1 發酵乳桿菌BLHN3生長曲線

2.2 發酵培養基單因素試驗

2.2.1 最佳碳源 由圖2(a)可知，相同添加量下，不同種類糖源對發酵乳桿菌生長的影響不同。海藻糖對發酵乳桿菌BLHN3的促生長作用最佳，活菌數為4.90×109CFU/mL；乳糖、D-半乳糖、蔗糖的促生長效果差異不顯著，活菌數為3×109CFU/mL左右；葡萄糖中的活菌數為2.07×109CFU/mL；淀粉和菊粉的促生長效果較差，活菌數分別為2.00×108，5.50×108CFU/mL。不同乳酸菌代謝糖類及代謝途徑有差別，葡萄糖是異型發酵乳桿菌的最佳碳源[16]，唾液乳桿菌BBE 09-18在麥芽糖中生長效果最好，活菌數可達1.88×109CFU/mL[17]；黃秀敏等[18]研究發現乳桿菌對單糖利用率較高，可能是乳桿菌對單糖的代謝能力比較強。綜上，不同乳酸菌對糖類的偏好性不一樣，因此選擇海藻糖作為發酵乳桿菌BLHN3最佳碳源。

2.2.2 最佳氮源 由圖2(b)可知，牛肉浸粉和大豆蛋白胨對發酵乳桿菌的促生長效果最好，二者無顯著差異，細菌學蛋白胨和酵母浸粉次之，乳清蛋白粉的效果最差。孫媛媛等[19]研究表明，酵母粉復合大分子肽的蛋白胨是發酵乳桿菌的最適氮源。氮源是乳酸菌生長中的關鍵成分，且在乳酸菌規模化應用中的成本高，考慮到以牛肉浸粉作氮源的成本較高，因此選擇價格低廉、促生長效果好的大豆蛋白胨作為發酵乳桿菌BLHN3的氮源，活菌數可達5.23×109CFU/mL。

2.2.3 最佳緩沖鹽 由圖2(c)可知，當緩沖液為檸檬酸銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀時，發酵液活菌數最高，效果最顯著，其次是檸檬酸鈉/磷酸氫二鉀，乙酸鈉、磷酸二氫鉀/磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀三者無顯著性差異，而磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸鈉促生長效果最差。常用的緩沖鹽體系有檸檬酸鹽、磷酸鹽和乙酸鹽等，多種緩沖鹽組分效果更佳，與Chen等[20]的結論一致。檸檬酸鹽可以增強乳酸菌細胞EMP途徑中碳通量和ATP的產生，檸檬酸銨還可作為乳酸菌生長的無機氮源[21-22]。因此，選擇檸檬酸銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀為發酵乳桿菌BLHN3最佳緩沖鹽。

2.2.4 最佳增菌因子 由圖2(d)可知，相同體積分數下，胡蘿卜汁的促生長效果最顯著，其次是黃漿水和土豆汁。胡蘿卜汁營養豐富，含有大量多糖、蛋白質、β-胡蘿卜素，可作為促生長因子提高乳酸菌菌群豐度[23]。Kun等[24]研究發現雙歧桿菌在純胡蘿卜汁上生長效果良好。大豆黃漿水是豆腐生產過程中的副產物，富含蛋白質、糖、大豆異黃酮、皂苷等多種成分，是適宜微生物生長的優良基質[25]。土豆中含有淀粉、膳食纖維、鈣、磷、鐵等，程方方[26]研究表明腸膜明串珠菌C27最適增菌因子為土豆汁。在以相同體積分數的平菇汁、西紅柿汁和包菜汁為增菌因子的試驗中，發酵乳桿菌生長效果較差，可能是因為平菇汁成分不適合發酵乳桿菌的生長，包菜汁中營養物質較單一、西紅柿汁pH較低等阻礙其生長。尤倩倩[27]發現平菇汁、西紅柿汁對干酪乳桿菌的促生長效果不顯著。吳祖芳等[28]研究表明植物乳桿菌 H17在西紅柿汁和Na2CO3溶液共同培養下菌體量有顯著提升。因此，選擇胡蘿卜汁作為發酵乳桿菌BLHN3的最佳增菌因子。

A～F分別為檸檬酸銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉/磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀/乙酸鈉/檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀/磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀；字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 營養成分添加量 由圖3(a)可知，發酵乳桿菌BLHN3活菌數隨海藻糖添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當海藻糖添加量為30 g/L時，發酵液活菌數達最大值；當海藻糖添加量>30 g/L時，活菌數下降，可能是初始底物糖濃度過高抑制了乳酸菌快速生長[29]。由圖3(b)可知，發酵乳桿菌BLHN3活菌數隨大豆蛋白胨添加量的增加逐漸增加，當大豆蛋白胨含量>34 g/L時，活菌數保持穩定，表明乳酸菌可通過分解利用外源蛋白質高效增殖[30]。由圖3(c)可知，發酵乳桿菌BLHN3活菌數隨緩沖鹽添加量的增加先上升后下降，當緩沖鹽添加量為9 g/L時活菌數達最大值，與王建等[31]的結論一致。由圖3(d)可知，發酵乳桿菌BLHN3活菌數隨胡蘿卜汁添加量的增加先上升后趨于平緩，當胡蘿卜汁添加量為10%時活菌數最高。

圖3 菌株在不同培養基成分添加量下的活菌數

2.3 發酵培養基響應面優化試驗

2.3.1 響應面試驗設計與結果 基于單因素試驗結果，選擇對發酵乳桿菌BLHN3影響顯著的碳源海藻糖添加量、氮源大豆蛋白胨添加量以及胡蘿卜汁添加量為自變量，以活菌數為響應值，設計三因素三水平響應面試驗，試驗因素與水平設計見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 響應面因素水平

表2 響應面試驗設計及結果

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行二次響應面回歸分析，得到發酵乳桿菌活菌數與各因變量的模擬方程：

Y=+5.75-0.14A+1.61B-0.32C+0.53AB-0.060AC+0.37BC-0.99A2-0.72B2-0.68C2。

(2)

2.3.3 響應面分析 由圖4可知，當胡蘿卜汁添加量和大豆蛋白胨添加量不變時，隨著海藻糖添加量的升高，發酵液活菌數先升高后下降。當胡蘿卜汁添加量和海藻糖添加量不變時，隨著大豆蛋白胨添加量的增加，發酵液活菌數逐漸升高。當海藻糖添加量和大豆蛋白胨添加量不變時，隨著胡蘿卜汁添加量的增加，發酵液活菌數先升高后趨于平緩。根據等高線圖可知，AB、BC的等高線呈橢圓形，說明AB、BC的交互作用顯著；AC的等高線接近圓形，說明AC的交互作用不顯著。

圖4 各因素交互作用對活菌數的影響

通過回歸模型預測高密度培養的培養基最優組成為海藻糖30.0 g/L、大豆蛋白胨34.0 g/L、胡蘿卜汁9.96%，活菌數預測值為6.05×109CFU/mL。為便于操作，將胡蘿卜汁修正為10%，并進行驗證實驗，發酵乳桿菌高密度培養的活菌數可達(6.05±0.05)×109CFU/mL，比MRS培養基的活菌數提高了2.91倍，證明所建模型的適用性。

2.4 培養條件優化

2.4.1 初始pH 由圖5(a)可知，當pH為6時，發酵乳桿菌活菌數最高，表明此時發酵乳桿菌的生長效果最好，與發酵乳桿菌LF-8001最適初始pH一致[32]。當pH>6時，發酵乳桿菌活菌數開始下降；當pH>8時，活菌數急速下降；當pH為12時，活菌數僅7.33 lg(CFU/mL)。不同微生物對pH有一定的耐受性，過酸或過堿的環境均不利于乳酸菌生長[33]。因此，選擇pH 6作為菌體生長最佳初始pH。

2.4.2 培養溫度 由圖5(b)可知，當培養溫度<37 ℃時，隨著培養溫度的升高，活菌數逐漸增加，表明發酵乳桿菌隨培養溫度的升高，生長得越快，可能是因為隨培養溫度的升高，細胞流動性在一定范圍內得到提升，物質運輸能力進一步加強，有利于乳酸菌細胞生長代謝等[34]；當培養溫度>37 ℃時，隨培養溫度的升高，活菌數快速降低，49 ℃時活菌數降至7.22 lg(CFU/mL)。培養溫度過高導致乳酸菌的細胞膜流動性、蛋白質活力和酶活性受損[35]，發酵乳桿菌因失活而生長受到抑制，活菌數降低；培養溫度為37 ℃時活菌數最高，表明此溫度是發酵乳桿菌較適宜的培養溫度，與對鼠李糖乳桿菌grx10[36]、發酵乳桿菌IMAU 10129[37]的研究結果一致。因此，選擇37 ℃作為菌體最佳生長溫度。

2.4.3 接種量 由圖5(c)可知，當接種量<3%時，隨著接種量的增加，發酵液活菌數上升；當接種量>3%時，隨著接種量的增加，發酵液活菌數不再增加，反而越來越低。因此，選擇3%作為菌體最佳接種量。

2.4.4 裝液量 由圖5(d)可知，當裝液量為30 mL時，發酵乳桿菌活菌數最高，是因為發酵乳桿菌在適量氧氣存在下進行有氧呼吸，加快了能量代謝水平，促進自身生長繁殖[38]。當裝液量為15 mL時，發酵液活菌數最低，與Siciliano等[39]研究一致，表明過高的溶氧量對細胞存活和生長具有負面作用。當裝液量>30 mL時，隨著裝液量的增加，溶氧量越少，發酵液活菌數逐漸下降，但變化不顯著。因此，選擇30 mL作為菌體最佳裝液量，即培養體積分數約為1/5。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 半連續高密度培養

由圖6可知，在優化培養基的基礎上進行半連續高密度培養工藝的探索，將培養至對數后期的發酵液離心，補充等量新鮮培養基換液培養后可明顯提高發酵液活菌數，離心前活菌數為9.77 lg(CFU/mL)，選擇14 h進行離心更換新鮮培養基后培養2.5～3.0 h，相同條件下重復培養多次，發酵液活菌數持續增加，最高可達10.08 lg(CFU/mL)。乳酸菌多次離心換液后比生長速率變化一致，均呈下降趨勢，表明隨著菌體濃度的增加，抑制了菌體的迅速生長。發酵液活菌數在第4次離心培養后開始下降，說明隨著培養時間的延長，大部分菌體已進入衰亡期，半連續高密度培養重復進行2～3次為最佳，與于修鑑[40]的結果一致。此時細胞仍保持增殖活力，乳酸菌活菌數仍可繼續上升，之后活菌數開始下降，細胞活力顯著降低。因此，離心培養2～3次可作為半連續培養收獲菌體最佳批次，活菌數可達10 lg(CFU/mL)，較離心前提高一個數量級。

圖6 發酵乳桿菌BLHN3半連續高密度培養

3 結論

試驗表明，以MRS培養基為基礎，發酵乳桿菌BLHN3在海藻糖30.0 g/L、大豆蛋白胨34.0 g/L、胡蘿卜汁體積分數10%、檸檬酸銨/乙酸鈉/磷酸氫二鉀緩沖鹽類物質下的活菌數最高，為6.05×109CFU/mL，是MRS培養基的2.91倍；發酵乳桿菌BLHN3的最佳培養初始pH為6、培養溫度為37 ℃、接種量為3%(體積分數)、裝液量為30 mL(即培養體積分數1/5)；并對發酵乳桿菌進行半連續高密度培養，較離心前培養活菌數顯著提高(P<0.05)，表明發酵乳桿菌BLHN3經高密度培養，有望成為具有應用潛力的發酵劑。后續將深入探究其冷凍干燥特性，制備直投式發酵劑，以便其應用于剁辣椒的工業化生產。