鰻魚肉粉中氨基甲苯咪唑基體標準物質的研制

羅春連

(福建省工業產品生產許可證審查技術中心，福建 福州 350003)

中國是全球最大鰻魚養殖國，鰻魚產量占全球總產量的80%以上[1]。鰻魚在生長過程中易受寄生蟲感染[2]，這些寄生蟲會影響鰻魚的生理學和生活史許多特征，甚至導致種群崩潰[3]。甲苯咪唑(Mebendazole，MBZ)是一種苯并咪唑類廣譜抗寄生蟲的合成藥物，通過對蟲體腸細胞漿微管的摧毀進而阻斷細胞對葡萄糖的轉運和吸收[4]，對鉤蟲[5]、蛔蟲[6]、蟯蟲[7]、鞭蟲[8]、線蟲[9]等多種寄生蟲具有良好的驅除效果，是鰻魚養殖中寄生蟲感染的主要治療藥物[10-11]。但MBZ及其主要代謝產物羥基甲苯咪唑(Hydroxy-mebendazole，MBZ-OH)和氨基甲苯咪唑(Amino-mebendazole，MBZ-NH2)會在動物體內殘留且具有生物毒性[12-15]，因此MBZ是動物源性食品獸藥殘留的重要監控對象。目前國外多數國家規定水產品中MBZ的最大殘留限量為0.1 mg/kg[16]，日本肯定列表對其限量為0.02 mg/kg[17]，美國和加拿大執行的最新規定為0.05 mg/kg。因為中國GB 31650—2019未規定該獸藥在水產品中的最大殘留限量，據美國食品藥品管理局(FDA)消息，近年來因烤鰻中頻繁檢出MBZ-NH2，美國對中國多家出口企業相關產品實施自動扣留，導致中國鰻魚出口損失較大。

目前，對MBZ的測定只使用純品標準物質進行定量檢測[11-12]，難以有效避免樣品基質效應對檢測結果的干擾[18]。基體標準物質是一種新型標準物質，它將目標分析物與樣品基質進行結合，具有實際樣品特性以及足夠均勻性和穩定性特征值，由于其目標化合物比基體更接近真實檢測樣品，能夠有效降低檢測過程中的基質效應，保障檢測結果的準確性，被廣泛用于實驗室質量控制工作[19-20]。中國食品類基體標準物質的研究正值起步發展階段，研制出的基體標準物質主要涉及谷物[21]、水產品[22]、乳制品[23]、茶葉[24]、畜禽肉[25]等，食品類標準物質覆蓋面窄，與實際需求仍有巨大缺口[26]，且國家標準物質資源共享平臺中未發現鰻魚肉中MBZ及其代謝物的基質標準物質。研究擬以鰻魚肉組織對MBZ及其代謝產物MBZ-OH和MBZ-NH2的代謝規律為基礎，通過真空冷凍干燥均勻化技術，制備鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質，以期為鰻魚制品中MBZ-NH2的量值溯源、分析檢測、質量控制、實驗室能力驗證、分析方法的準確性評估和驗證等提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰻魚(Anguillidae)：長樂聚泉食品股份有限公司；

包裝材料：采用雙層平口袋包裝，其中外包裝袋材質為鋁箔復合材料，內包裝袋材質為聚乙烯；

MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2標準品：色譜純，德國 Dr.Ehremstorfer公司；

乙腈、甲酸、冰乙酸：色譜純，德國Merck公司；

超純水：符合GB 6682—2008 Ⅲ級水標準，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜—串聯質譜儀：Xevo TQ-S型，配有電噴霧離子源，美國Waters公司；

高速冷凍離心機：Allegra V-15R型，美國Beckman Coulter公司；

電動肉丸機：YQ-6型，中國佛山俊凌廚具電器廠；

拍擊均質器：stomacher350型，英國Seward公司；

電子分析天平：BSA124S型，德國Sartorius公司；

渦旋振蕩器：VORTEX1型，德國IKA公司；

MCX固相萃取柱：60 mg/3 mL，美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 候選物的制備 取適量的獸藥MBZ水劑，用水稀釋后均勻潑灑入池，使魚池中MBZ質量濃度約為1 mg/L，靜置過夜；取70條重量約為250 g的鰻魚，暫養在裝有循環充氣的水箱中，每天換1次水，用藥3 d后停藥，休藥第9天撈出宰殺，去皮、去骨、去內臟，取肉部分，混合攪碎，混勻制成鰻魚肉糜。

1.3.2 樣品制備 將鰻魚肉糜進行真空冷凍干燥制得凍干鰻魚肉粉，水分含量<5%。凍干粉粉碎、過35目篩，得鰻魚肉粉樣品，用聚乙烯內袋及鋁箔復合袋進行真空包裝，最小包裝總單元數約432袋，每袋8～10 g，貼標簽并編號；輻照滅菌(60Co-γ，12 kGy)；于-18 ℃保存。

1.3.3 樣品均勻性與穩定性試驗

(1) 均勻性檢驗：按JJF 1343—2012執行。

(2) 穩定性檢驗：按JJF 1343—2012執行。

1.3.4 定值及朔源性 采用郵政網絡協同定值[27]，選擇8家具備MBZ及其代謝產物檢測能力的資質檢驗機構作為協作定值實驗室，分別用編號L001～L008表示，每個機構測定3個樣品，每個樣品獨立重復測定2次。檢測數據的定值與離散性檢驗、不確定度評估方法參照文獻[28]。

1.3.5 MBZ及其代謝產物檢測 準確稱取1.250 0 g樣品于離心管中，加入3.75 mL超純水充分混勻使其復原為魚糜，浸泡30 min，參照SN/T 2624—2010對MBZ及其代謝產物進行提取和凈化，上機檢測。色譜條件為：waters Acquity UPLC C18(1.6 μm, 3 mm×100 mm)；流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液-0.2%甲酸溶液；流動相 B為100%乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～2 min，10%～80% B；2.0～4.5 min，80% B；4.5～6.0 min，80%～10% B；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。質譜條件為：多反應監測(MRM)掃描模式；電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；脫溶劑氣溫度650 ℃，流速800 L/h；毛細管電壓3.0 kV。其他MRM質譜參數見表1。

表1 MBZ及其代謝物的主要質譜參數?

2 結果與分析

2.1 MBZ及其代謝物在鰻魚肉中的代謝規律及標樣的選擇

由圖1可知，鰻魚肉中MBZ及其代謝物含量隨休藥時間的延長先降低后趨于穩定；鰻魚肉組織對MBZ和MBZ-OH的降解能力強，自休藥的第4天起已降至極低水平；而MBZ-NH2至休藥的第8天才降至較低水平，且難以被鰻魚肉組織完全降解，從而形成穩定的獸藥殘留，因此MBZ-NH2適合被制備為鰻魚肉中的基體標準物質。為使鰻魚肉中MBZ-NH2基體標準物質來源穩定且不受MBZ和MBZ-OH的干擾，確定休藥后第9天為最佳取樣點。

圖1 鰻魚肉組織中MBZ及其代謝物在休藥后隨時間的變化趨勢

2.2 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的制備

基于MBZ-NH2的代謝規律，在休藥后第9天進行樣品采集和標品制備。為保證樣品的均勻性，使用電動肉丸機將鰻魚肉進行粉碎，再將粉碎后的魚糜邊攪拌邊進行拍擊均質。鰻魚含油脂較多，直接以糜樣的形式保存很容易析出油脂而影響目標化合物含量，研究采用真空冷凍干燥技術能夠克服上述缺陷，凍干魚糜粉末復水性好，且復溶后的魚漿能極大程度地還原其基體特性。該凍干產品易于水分控制且方便貯藏和運輸。對凍干后的樣品進行粉碎，過35目篩，研制好的樣品經雙層真空包裝后再進行輻照滅菌，所制備的MBZ-NH2基體標準物質能在1年內保持無菌狀態，以滿足長期穩定性的考察需求及實際貯藏應用需求。

2.3 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的復水條件優化

根據樣品凍干前后的水分含量，確定復水質量比為1∶3，同時考察了不同稱樣量(0.50，1.00，1.25，1.50 g)、復水時間(10，20，30，40 min)對MBZ-NH2檢測結果的影響。結果表明，1.25 g為最佳稱樣量，30 min為最佳復水時間，其分析結果的準確度和重現性最好。因此，確定該標準樣品的最小取樣量為1.25 g，復水比例為1∶3。

2.4 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的上機檢驗

取3份樣本復水后按SN/T 2624—2010進行測定，發現只有MBZ-NH2的檢出值大于其方法定量限，而MBZ和MBZ-OH均未檢出。

由圖2可知，基體標準物質的圖譜與標品溶液的圖譜高度相似，各離子對的峰形尖銳且無拖尾現象，目標峰附近無雜峰干擾，說明基體標準物質中MBZ-NH2的定性檢驗并不受鰻魚肉粉中其他物質的干擾，進一步驗證了取樣點及復水條件的合理性。

圖2 標準溶液及基質樣品的選擇離子監測色譜圖

2.5 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的基本屬性

2.5.1 均勻性 隨機抽取12份所制備的基體標準物質進行檢測分析，鰻魚肉粉中MBZ-NH2含量測定結果以及方差分析結果見表2。查表得F0.05(12,36)=2.216 3，鰻魚肉粉中MBZ-NH2標準物質的F計算值為2.119 7，FMBZ-NH2

表2 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的均勻性方差分析?

2.5.2 穩定性 由表3可知，所有樣品均未出現脹袋、霉變、形態、質構等方面的異常變化，說明2.2中樣品的制備和包裝方式符合短期貯藏需求；對MBZ-NH2進行含量檢測，樣品在暴曬環境中MBZ-NH2含量下降明顯，F-檢驗表明：在α=0.05顯著水平條件下，FMBZ-NH2=1.300 7

表3 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的短期穩定性檢測結果?

長期穩定性檢驗參照GB 15000.3—2008，即-18 ℃低溫貯藏1年，并在多個時間點跟蹤監測MBZ-NH2的含量變化情況，測定結果見表4。由表4可知，在95%置信區間內，F=0.148 8>0.05，不顯著，說明貯藏時間不影響MBZ-NH2的含量變化，因此認為該基體標準物質能夠在12個月保持穩定。

2.5.3 定值與離群值檢驗 將同批次未拆封的樣品送至8家資質檢驗機構(8組)進行MBZ-NH2含量檢測，結果見表5。由表5可知，8組數據未發現異常值，說明8家資質檢驗機構的檢測結果數據穩定；以夏皮洛—威爾克(Shapiro-wilk)檢驗法對8組數據的均值進行正態分布檢驗，計算得W=0.970>W(48，0.95)=0.947，說明檢測數據服從正態分布；繼續采用科克倫法檢驗8組數據的平均值是否等精度，計算得出C=0.330，滿足CG2(5%，8)=0.110 1，說明8家資質檢驗機構對鰻魚肉基體中MBZ-NH2檢測結果無離群值，因此所有單元的數據均可參與定值。

表4 鰻魚肉粉中MBZ-NH2基體標準物質的長期穩定性檢測結果

2.5.4 不確定度評估 不確定度表征被測量值的分散性，其值大小與測定結果可信賴程度相關聯[29-30]，根據標準物質統計方法指南規定，評估合作定制方法得到定值結果的不確定度，通過測定值標準不確定度、瓶間標準不確定度、長期穩定性不確定度的合成并擴展來評定，最終確定MBZ-NH2特性值為(35.3±6.4) μg/kg (k=2)。

表5 協同定值

3 結論

對甲苯咪唑休藥第9天時制得的含氨基甲苯咪唑鰻魚肉糜，采用聯合冷凍干燥、真空包裝和輻射滅菌技術，研制得鰻魚肉粉中氨基甲苯咪唑自然基體標準物質。結果表明，復水后該基體標準物質上機檢測效果良好，能夠滿足鰻魚中氨基甲苯咪唑質量控制和方法驗證需求，可保證測定結果的可靠性、可比性和溯源性。根據鰻魚肌肉組織對甲苯咪唑的代謝特征，未來在甲苯咪唑喂藥過程中使用其代謝抑制劑以及單獨喂藥羥基甲苯咪唑有望分別獲得甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑標準物質。