大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的分離純化與鑒定

董婧琪 何澤賀 田桂芳 邵娟娟 吳小禾

(1. 河北農業大學理工學院，河北 滄州 061000；2. 河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；3. 中山火炬職業技術學院，廣東 中山 528436)

高血壓是腦血管病的重要表現特征之一，也是治療腦血管病的重要指標[1]。血管緊張素轉化酶(ACE)因破壞腎素—血管緊張素系統與激肽釋放酶—激肽系統之間的平衡而直接引起機體的高損傷[2]，在血壓的調控中起到重要作用[3]。降低ACE活性可以有效降低血壓，但是現階段的降壓藥物大多是合成類的ACE抑制劑，如卡托普利、阿克拉普利和依那普利等抑制劑。而使用合成類降壓藥后可能出現咳嗽、皮疹和頭痛等不良反應，所以目前合成類降血壓藥物的使用受到限制[4]。此外，已證實從食物中獲得的抗高血壓肽對高血壓病人具有降壓效果，而且沒有毒副作用[5]。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)為重要的淡水型魚類之一[6]，屬高蛋白低脂肪食品。大鱗副泥鰍蛋白有多種生物活性，ACE抑制活性是其主要活性之一。目前ACE抑制肽的制取方法主要是酶法，而單一的酶類通常具有一定的局限性。何澤賀等[7]對于復合酶法提取泥鰍中ACE抑制肽進行了研究，但未進一步進行分離純化與鑒定的研究。研究擬采用脯氨酸蛋白酶和堿性蛋白酶的復合酶酶解法制取大鱗副泥鰍制備ACE抑制肽，并對其進行進一步的分離純化與鑒定，旨在為大鱗副泥鰍的ACE抑制肽開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鱗副泥鰍：單只重量約35～45 g，河北農業大學市場；

堿性蛋白酶：1萬U/g，美國Sigma公司；

脯氨酸蛋白酶：25 U/g，夏盛(北京)生物科技開發有限公司；

血管緊張素轉化酶：1 000 U/g，美國Sigma公司；

三羥甲基氨基甲烷(純度≥99.8%)、三(羥甲基)甲基甘氨酸(純度≥99.0%)：分析純，美國Sigma公司；

氫氧化鈉(純度≥96.0%)、鹽酸(36.0%～38.0%)、氯化鈉(純度≥99.5%)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

絞肉機：JYL-C020E型，九陽股份有限公司；

冷凍干燥機：Beta1-8 LD plus型，德國Marin Christ公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，江蘇正基儀器有限公司；

冷凍離心機：5418 R型，德國艾本德公司；

渦旋混勻儀：MIX1000型，廣東佛衡儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV752N型，上海元析儀器有限公司；

超濾：80EL005型，密理博(中國)有限公司；

恒流泵：HL-2型，上海青浦滬西儀器廠；

反向高效液相色譜儀：1260型，安捷倫科技有限公司；

質譜儀：Orbitrap Elite型，賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鱗副泥鰍蛋白酶解液的制備 大鱗副泥鰍清洗后，熱燙約30 s去除黏液，經處理后得泥鰍肉糜，-20 ℃冷凍貯藏。將常溫解凍的肉糜與磷酸緩沖溶液(pH 7.0，0.1 mol/L)制備成質量分數10%的勻漿[8]，并使用均質機均質。然后用堿性蛋白酶(1 000 U/g)與脯氨酸蛋白酶(5 U/g)在40 ℃條件下[9]，同步酶解大鱗副泥鰍蛋白3 h，沸水浴10 min，10 000 r/min離心20 min，取上清即得到大鱗副泥鰍的酶解物(PDH)。然后對PDH進行凍干(冷阱溫度-55 ℃，抽氣速率5 L/s)處理，在干燥器中貯藏備用。

1.3.2 超濾 將凍干的PDH溶解在蒸餾水中，并使用超濾進行分級分離，該系統的截留分子量膜范圍為10，5，3，1 kDa。首先使用10 kDa超濾膜對PDH進行超濾，以生成截留液(PDH-Ⅰ)和滲透液。將10 kDa的滲透液在5 kDa的超濾膜上進一步分離，獲得5 kDa截留液(PDH-Ⅱ)和滲余液。然后將5 kDa滲透液在3 kDa 超濾膜上分離得到截留液(PDH-Ⅲ)和滲透液，將3 kDa滲透液在1 kDa的超濾膜上分離，獲得1 kDa的截留液(PDH-Ⅳ)和滲透液(PDH-Ⅴ)。分別收集所得的PDH-Ⅰ(>10 kDa)、PDH-Ⅱ(10～5 kDa)、PDH-Ⅲ(5～3 kDa)、PDH-Ⅳ(3～1 kDa)和PDH-Ⅴ(<1 kDa)組分并凍干，備用。

1.3.3 葡聚糖凝膠過濾層析 利用Sephadex G-15層析柱(1.6 cm×80 cm)對所獲得的PDH-Ⅰ、PDH-Ⅱ、PDH-Ⅲ、PDH-Ⅳ和PDH-Ⅴ組分中ACE抑制活性最高的組分進行純化。上樣液質量濃度為30 mg/mL，以0.5 mL/min流量用蒸餾水洗脫，收集洗脫液(3 mL/管)，并利用在280 nm處測量的吸光度進行監測。收集各級分，使用旋轉蒸發儀對各級分進行濃縮，并冷凍干燥，備用。

1.3.4 制備型高效液相色譜分離純化 使用安捷倫XSelect?petide CSHTMC18色譜柱(19 mm×150 mm)進行純化。A相：體積分數0.1% TFA純乙腈；B相：體積分數0.1% TFA水溶液。洗脫條件：A，0～10%，持續20 min，上樣量800 μL，柱溫30 ℃，流量17 mL/min，檢測波長280 nm。多次上樣并收集不同級分，進行濃縮處理，通過冷凍干燥后保存，并測定其ACE抑制活性。使用與上述相同的條件對活性最高的組分進行第二次RP-HPLC純化。所得純化的肽用于質譜分析。

1.3.5 ACE抑制肽一級結構的質譜測定 將1.3.4制得的樣品利用Orbitrap Elite質譜儀(Thermo Scientific)進行檢測，色譜柱為Thermo Scientific的C18散裝材料填充柱(100 μm×2 cm)和C18分離毛細管柱(75 μm×15 cm)。將肽重懸于緩沖液A(體積分數0.1%甲酸的水溶液)中，裝到預柱上，用分離柱分離，線性梯度為7%～35%緩沖液B(含有體積分數0.1%甲酸的乙腈)，然后進行LC-MS/MS分析。離子化方式：ESI；電壓2 200 V；以數據依賴模式進行采集，在FT模式下以120 000的分辨率進行全面MS掃描(m/z300～1 700)，然后對15個最豐富的離子進行碰撞誘導解離(CID)MS/MS掃描。自動增益控制(AGC)目標對于Orbitrap掃描為1e6離子，對于MS/MS掃描為5e4離子。動態排除參數：隔離窗口，m/z2，重復計數1，重復持續時間25 s，排除時間25 s。

1.3.6 ACE抑制模式鑒定 分別將0.000，0.025，0.050，0.075 mg/mL 的ACE抑制肽添加到0.5，1.0，2.0 mg/mL的 FAPGG底物的反應混合物中與ACE反應，然后測定ACE的抑制活性。通過Lineweaver-Burk圖研究抑制劑存在下的ACE抑制模式，Lineweaver-Burk圖基于反應速率(1/V)和底物濃度(1/S)關系的倒數圖。

1.3.7 肽得率的測定 按體積比1∶1將5%的三氯乙酸與蛋白酶水解液混勻，6 000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍法，對上清液中可溶性蛋白含量進行測定，按式(1)計算短肽得率[10]。

(1)

式中：

NSI,TCA——三氯乙酸可溶性氮得率，%；

N1——在5% TCA中的可溶性蛋白質量，mg；

N2——PDH中的可溶性蛋白質量，mg。

1.3.8 ACE抑制率測定 向微孔板的微孔中分別加入10 μL的ACE溶液和10 μL蛋白水解液，再添加150 μL底物(1.0 mmol/L FAPGG與50 mmol/L的Tris-HCl混勻，NaCl濃度為0.3 mol/L)，然后立刻將微孔板放入預熱到37 ℃的酶標儀中，在340 nm下測定20次吸光值，每次間隔1 min。作為空白對照，以吸光值(A340 nm)為橫坐標，時間為縱坐標作曲線，計算斜率，通常取10～20 min的斜率來計算。按式(2)計算ACE抑制率。

(2)

式中：

ACE,I——ACE抑制率，%；

ΔAI——添加抑制劑時的斜率；

ΔAB——空白對照的斜率。

IC50為抑制50% ACE活性時所需酶解樣品的質量濃度。IC50定義為ACE抑制率達50%時的多肽質量濃度(mg/mL)，用SPSS 13.0統計軟件的概率單位法(probit)計算。

1.4 數據處理與分析

采用Means±SD表示試驗數據，通過SPSS 13.0統計分析軟件做方差分析(ANOVA)，并進行Duncan的新的多范圍測試，以確定其顯著差異。

2 結果與分析

2.1 PDH的超濾分離

在40 ℃下，用堿性蛋白酶和脯氨酸蛋白酶同步酶解大鱗副泥鰍蛋白3 h后，所得酶解產物具有最高ACE抑制活性。大鱗副泥鰍蛋白酶解產物(PDH)IC50為(491.45±15.11) μg/mL。而IC50值越低，ACE抑制活性越高。

采用10，5，3，1 kDa的超濾膜對PDH進行分離，如圖1所示，5種組分中，分子量<1 kDa的PDH-Ⅴ表現出最高的ACE抑制活性，IC50值為(154.70±7.35) μg/mL；而分子量>10 kDa的PDH-Ⅰ的活性最低，IC50值為(533.45±12.89) μg/mL，與Li等[11]研究結果相符合。分析目前國內外對于食源性ACE的研究，大部分ACE抑制肽的氨基酸個數低于10，分子量小，這是分子量<1 kDa的超濾膜分離所得的ACE抑制肽活性最高的原因之一。此外，還有可能由于酶解過程中引入大分子雜質，從而影響ACE抑制肽與ACE的結合，在使用較大分子量超濾膜時不能充分將其濾去，造成所得組分表現的ACE抑制活性有所降低。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由此可得，PDH的ACE抑制活性主要取決于其分子量，其ACE抑制活性隨PDH分子量的降低而增加。而超濾是去除大分子、實現含有<1 kDa分子量肽分級及提高ACE抑制活性的有效手段。此外，肽得率隨分子量的減小而減小，PDH-Ⅴ的肽得率為3.4%，所以大鱗副泥鰍蛋白并未酶解完全，仍然存在大部分大分子蛋白。因此，后續將繼續對PDH-Ⅴ進行純化。

2.2 凝膠過濾層析進行純化

將凍干的 PDH-Ⅴ組分用蒸餾水溶解，使用 Sephadex G-15(1.6 cm×80 cm)上通過凝膠過濾層析進行純化。凝膠過濾是一種可以分離具有不同分子尺寸的物質的方法，并且已被用于從低分子量物質中脫鹽蛋白質溶液，分離蛋白質和其他膠體。由圖2所知，純化得到3個組分F1、F2和F3，這3個組分的IC50值分別為(148.45±7.83)，(98.52±5.67)，(172.87±9.78) μg/mL。

圖2 樣品Ⅴ的Sephadex G-15凝膠滲透色譜

通過研究測定表明F2具有最強的ACE抑制活性，與PDH相比，活性提高了4.99倍(表1)。收集F2合并凍干以待進一步純化。

2.3 RP-HPLC分離純化

將來自凝膠色譜的組分通過半制備型RP-HPLC進一步分離純化。如圖3(a)所示，收集到的5個組分中，保留時間為2.07 min的F2-2表現出最強的ACE抑制活性，其IC50值為(17.89±3.28) μg/mL。此外經色譜柱分離后所得的色譜圖中出現一些小分子肽的混合物，根據石杰等[12]的研究進行分析可得，可能是由于在進行洗脫的過程中，F2中所含的親水性鹽類對分離造成影響，從而導致部分小分子肽的出現。

圖3 F2組分的反相高效液相色譜圖及各組分的血管緊張素轉化酶抑制活性值

使用反相高效液相色譜儀進行二次分離以獲得純度更高的F2-2組分。由圖4可知，組分F2-2呈現明顯的單一峰，可得肽段較純從而可以用于肽表征。但在特征峰后仍存在含量較低的肽段，為提高F2-2組分純度通過重復注射在相同的保留時間收集F2-2級分并凍干。將級分重新溶解，用于HPLC-MS/MS分析與肽的一級結構的氨基酸序列測定。

圖4 F2-2組分的反相高效液相色譜圖

2.4 ACE抑制肽的分離純化

純化獲得組分的IC50值和純化倍數見表1。使用超濾、Sephadex G-15過濾層析、RP-HPLC純化程序從PDH純化ACE抑制肽，純化倍數達到27.47倍，得到的目的肽段IC50為(17.89±3.28) μg/mL。

表1 大鱗副泥鰍蛋白血管緊張素轉化酶抑制肽的純化?

2.5 采用質譜法測定ACE抑制肽的一級結構

利用質譜儀對組分F2-2進行一級質譜(MS)與二級質譜(MS/MS)交替處理，而各組分的結構利用分析軟件預測。其過程為選擇一級質譜所產生的肽段中的母離子(質子化分子)，使其進入二級質譜，并使其發生碰撞誘導解離(CID)反應分解形成一定量的碎裂離子。由于各個肽段的質量數不同，而肽序列可利用其間存在的差值進行推定，并利用儀器中所含軟件對肽序列進行解析。

如圖5所示，豐度值最高的母離子為m/z345.208，即可得出該目標肽段的分子量為321.208 Da。再用m/z345.208 的母離子在二級質譜(MS/MS)中進行分析處理。由于氨基酸殘基通過肽鍵連結形成肽與蛋白質，而沿肽骨架斷裂所獲得的是主要的碎裂峰組。在發生電離反應與飛行進程中，待測分子產生亞穩離子，由于相鄰同組類型峰的質量存在差值，而肽的序列測定正是通過分析質量差，進而識別相應氨基酸殘基。

圖5 組分F2-2的質譜圖

肽段在質譜分析中的碎裂具有一定規律，碎片離子主要分為兩類：從N端開始以a、b、c表示，從C端開始以x、y、z表示，在肽鏈中與其他鍵相比，酞胺鍵較易斷裂，因此 b和y系列離子具有相對較大的出現概率。母離子(345.208)進入二級質譜，在譜圖中其相應碎片具有標注，利用肽的b離子和y離子互補的方法推斷組分的序列為Glu-Gly-His，分子量為345.2 Da。從大鱗副泥鰍蛋白中分離所得ACE抑制肽的氨基酸序列中甘氨酸屬于疏水性氨基酸，石杰等[12]研究表明疏水性氨基酸的存在促進ACE抑制肽的抑制活性。組氨酸屬于正電荷氨基酸，Wu等[14]研究發現正電荷氨基酸可使ACE抑制肽表現出更強的抑制活性，由此可得此肽段具有較高的ACE抑制活性。

2.6 ACE抑制肽的抑制動力學研究

ACE抑制肽以競爭性、非競爭性和混合型方式抑制ACE的活性[15]，其中多為競爭性抑制，而競爭性抑制劑一般與底物結構較為相似，競爭性抑制劑可與活性位點結合，阻斷底物和酶之間的相互作用或改變酶的構象，從而使底物無法接近活性位點[16-18]。其中底物濃度、抑制劑濃度、底物以及抑制劑與酶的親和能力是影響競爭性抑制的主要因素[19]。

圖6 主成分質子數與電荷數比為345.208的串聯質譜圖

使用Lineweaver-Burk作圖研究來自PDH肽的ACE抑制模式，測定了存在和不存在抑制劑的酶的動力學常數[20]。圖7結果表明，Vmax不會隨大鱗副泥鰍ACE抑制肽濃度的變化而發生明顯差異，但Km(反應速度為1/2Vmax時底物濃度的數值)隨肽濃度的增加而有所提高，表明這種肽是ACE的競爭性抑制劑，可以結合到肽的活性位點，導致底物無法與活性位點結合，從而起到抑制性作用。綜上，PDH水解肽為競爭性抑制肽，具有顯著的ACE抑制活性，作為功能性食品成分或天然降高血壓劑具有良好的市場前景。

圖7 大鱗副泥鰍血管緊張素轉化酶抑制肽對血管緊張素轉化酶的抑制Lineweaver-Burk模型

3 結論

研究采用超濾、凝膠過濾層析和半制備RP-HPLC多級分離技術構建了一種活性高、純度高的大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的提取純化方法。所得目標肽段的IC50值為(17.89±3.28) μg/mL，與大鱗副泥鰍的初始酶解物相比，ACE抑制活性顯著提高，純化倍數27.47，其氨基酸序列為Glu-Gly-His，分子量345.2 Da。ACE抑制動力學研究分析表明大鱗副泥鰍抑制肽對于底物ACE是一種競爭性抑制。由此可得，研究所得的大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽具有明顯的降壓效果，且原料價格低廉，來源廣泛，可作為良好的食源性ACE抑制肽來源。但大鱗副泥鰍蛋白ACE抑制肽的體外試驗無法確定其在體內的降壓效果，仍需進行進一步的動物性試驗來驗證。