α-淀粉酶降低青稞快消化淀粉含量工藝優(yōu)化

張 花 宋曉凡 李 巖 孫康娜 院珍珍

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)俗稱裸大麥[1]，是大麥的變種，屬于禾本科植物，作為青藏高原的一種重要谷物，具有高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖的特性，并且富含β-葡聚糖等功能因子，具有很好的營養(yǎng)功能[2-3]，對預(yù)防心血管疾病、糖尿病等有顯著作用[4-6]。淀粉按其在人體內(nèi)的消化程度和速度，可分為快消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)3種類型[6-7]。研究[8-10]表明，青稞中的慢消化淀粉能夠緩慢釋放能量，可以保證飯后血糖的相對穩(wěn)定，避免造成大幅度的波動引起血糖過高和過低的現(xiàn)象，有益于高血壓、糖尿病和肥胖患者病情調(diào)控。

目前，有關(guān)青稞淀粉的研究多集中在其提取與不同來源青稞淀粉的理化性能對比上，對青稞淀粉改性和結(jié)構(gòu)分析方面的研究較少，也缺乏對其進(jìn)一步的應(yīng)用潛能進(jìn)行探索的理論依據(jù)。為探索青稞淀粉特性并改善其消化性能，研究擬以青稞為原料，采用酶解法降低青稞快消化淀粉含量，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性確定酶法降低快消化淀粉含量的最適條件[11-13]，旨在提高和增加青稞的附加值，為青稞高附加值產(chǎn)品研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萌芽黑青稞粉：青海漢和生物科技股份有限公司；

高溫α-淀粉酶：2萬U/mL，上海源葉生物科技有限公司；

糖化酶：10萬U/mL，江蘇銳陽生物科技有限公司；

豬胰α-淀粉酶：45.5萬U/g，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

苯酚：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

3，5-二硝基水楊酸：分析純，上海展云化工有限公司；

酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機：LR10M型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-82型，國華企業(yè)集團(tuán)有限公司；

臺式高速離心機：H/T16MM型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1780型，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 技術(shù)路線

青稞粉→酶解→滅酶→水洗離心→收集固體→烘干→粉碎→體外模擬消化→低快消化淀粉青稞粉

1.3.2 操作要點

(1) 酶解液配制：取一定單位的酶液用蒸餾水定容至100 mL。

(2) 酶解：加酶量以每克青稞粉中加入的酶單位計，加入酶解液震蕩搖勻，放入恒溫振蕩水浴鍋(35～75 ℃)中以140 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩酶解。

(3) 滅酶：沸水浴20 min。

(4) 離心、烘干：酶解結(jié)束后，20 ℃下，4 500 r/min離心，沉淀用蒸餾水洗滌至上清液無色(洗滌2～3次)，收集固體于45 ℃烘干。

1.3.3 單因素試驗 取適量青稞粉，以快消化淀粉含量為指標(biāo)，選用α-淀粉酶添加量為50，100，150，200，250 U/g，酶解溫度為35，45，55，65，75 ℃，酶解時間為1，2，3，4，5 h，料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)。考察一種因素時，固定其他參數(shù)條件為α-淀粉酶添加量150 U/g、酶解溫度65 ℃、酶解時間2 h、料液比1∶10 (g/mL)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取α-淀粉酶添加量、料液比、酶解時間和酶解溫度為響應(yīng)因素，以快消化淀粉含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗以優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，平行3次。

1.3.5 RDS、SDS、RS含量測定 參照Englyst等[14]的方法并稍作修改。取0.2 g樣品，加入9 mL蒸餾水，漩渦震蕩5 min，沸水浴30 min，期間晃動試管以防結(jié)塊，自然冷卻至室溫。向試管中加入3個玻璃珠、1 mL乙酸鈉緩沖液(1 mol/L，pH 5.2)及5 mL酶溶液，37 ℃水浴震蕩酶解，分別在20，120 min時吸取5 mL樣品，沸水浴滅酶20 min， 4 500 r/min離心15 min，取1 mL上清液，分別加入2 mL蒸餾水和DNS于沸水浴中顯色5 min，流水冷卻后加入7 mL蒸餾水，搖勻，測定540 nm處紫外吸收值。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.148 5X-0.023 7，R2=0.996 4，并分別按式(1)～式(3)計算RDS、SDS、RS含量。

(1)

(2)

RRS=mTS-RRDS-RSDS，

(3)

式中：

RRDS——RDS 含量，%；

RSDS——SDS 含量，%；

RRS——RS 含量，%；

m0——水解0 min后樣品中葡萄糖質(zhì)量，mg；

m20——水解20 min后樣品中葡萄糖質(zhì)量，mg；

m120——水解120 min后樣品中葡萄糖質(zhì)量，mg；

mTS——樣品中總淀粉質(zhì)量，mg。

1.3.6 總淀粉含量測定 采用淀粉含量檢測試劑盒法測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.451X-0.451 3，R2=0.994 8，并按式(4)計算總淀粉含量。

(4)

式中：

Y′——總淀粉含量，mg/g；

X′——測得的吸光度對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)，1 000；

V——提取后總體積，mL；

W——青稞粉質(zhì)量，g。

1.3.7α-葡萄糖苷酶抑制率測定 取0.05 mol/L PBS緩沖液(pH 6.8) 600 μL，滴加300 μL PNPG (20 mmol/L)溶液和40 μL樣品，37 ℃水浴酶解20 min，滴加200 μL 0.2 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，室溫反應(yīng)10 min，加入2 mL 0.1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，3 000 r/min離心10 min，吸取200 μL上清液于96孔板中，用酶標(biāo)儀測定405 nm處吸光值。空白對照為pH 6.8、0.05 mol/L的PBS溶液。按式(5)計算α-葡萄糖苷酶抑制率[15]。

(5)

式中：

M——α-葡萄糖苷酶抑制率，%；

a——含有α-葡萄糖苷酶溶液不含樣品的吸光值；

b——不含α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的吸光值；

c——含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的吸光值；

d——不含α-葡萄糖苷酶溶液和含待測樣品的吸光值。

1.3.8α-淀粉酶抑制率測定 分別取150 μL樣品液和150 μL 0.5 mg/mL的α-淀粉酶液，混勻，37 ℃孵育10 min，加入250 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的可溶性淀粉溶液，37 ℃孵育10 min，加入500 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min。冷卻后取200 μL于96孔板中，使用酶標(biāo)儀測定540 nm處吸光度，按式(6)計算α-淀粉酶抑制率。

(6)

式中：

N——α-淀粉酶抑制率，%；

a——含有α-葡萄糖苷酶溶液不含樣品的吸光值；

c——含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的吸光值；

d——不含α-葡萄糖苷酶溶液和含待測樣品的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1α-淀粉酶添加量對RDS含量的影響 由圖1可知，酶解初始階段快消化淀粉含量隨α-淀粉酶添加量的增加而減小，當(dāng)α-淀粉酶添加量為150 U/g時，快消化淀粉含量最低為15.4%。繼續(xù)增加α-淀粉酶添加量，快消化淀粉含量逐漸增加，可能是由于酶解產(chǎn)物的積累對酶解反應(yīng)的反向抑制作用。因此，確定α-淀粉酶的最適添加量為150 U/g。

圖1 α-淀粉酶添加量對RDS含量的影響

圖2 料液比對RDS含量的影響

2.1.2 料液比對RDS含量的影響 由圖2可知，隨著青稞粉質(zhì)量濃度的降低，青稞中快消化淀粉含量隨之降低，當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時，其含量達(dá)到最低(13.9%)。隨著青稞粉質(zhì)量濃度的進(jìn)一步降低，快消化淀粉含量升高，可能是由于料液比過小時，溶液中的酶濃度較低，從而導(dǎo)致酶與淀粉的接觸幾率下降；當(dāng)料液比較大時，酶與淀粉之間的流動性較低，不易酶解，快消化淀粉含量降低較少。因此，確定最適料液比為1∶10 (g/mL)。

2.1.3 酶解時間對RDS含量的影響 由圖3可知，快消化淀粉含量隨酶解時間的延長不斷減小，當(dāng)酶解時間為2 h時，快消化淀粉含量最低為8.7%。繼續(xù)延長酶解時間，支鏈淀粉含量減少、小分子淀粉含量上升，使得快消化淀粉含量增加。因此，確定α-淀粉酶的適宜酶解時間為2 h。

圖3 酶解時間對RDS含量的影響

2.1.4 酶解溫度對RDS含量的影響 由圖4可知，當(dāng)酶解溫度<65 ℃時，隨著酶解溫度的升高，青稞快消化淀粉含量降低，當(dāng)酶解溫度為65 ℃時，快消化淀粉含量最低為8.9%，超出此溫度范圍后，隨著酶解溫度的升高，快消化淀粉含量升高，可能是因為溫度過高導(dǎo)致了淀粉的降解。因此，α-淀粉酶的適宜酶解溫度為65 ℃。

圖4 酶解溫度對RDS含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 單因素試驗選擇的水平范圍見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析 通過Box-Behnken試驗對RDS含量進(jìn)行多元線性回歸擬合，得方程：

Y=11.59+3.85A-0.71B+1.76C-1.40D+0.10AB-0.33AC+0.075AD+0.15BC-0.27BD-0.85CD+19.30A2+12.59B2+9.59B2+8.95D2。

(7)

表3 方差分析表?

2.2.3 交互作用分析 由圖5可知，酶解時間和酶解溫度之間的交互作用對RDS含量影響最為顯著。α-淀粉酶添加量和酶解時間、料液比和酶解溫度、料液比和酶解時間之間的交互作用的曲線平滑，顯著性差異較小；α-淀粉酶添加量和酶解溫度之間的交互作用顯著性最低。4個因素對青稞中RDS含量的影響均呈先降低后上升的趨勢，且在4個因素所設(shè)定的范圍內(nèi)均存在最高值，CD、AC、BD的交互作用比BC、AB、AD的更為密集，說明RDS含量的顯著性順序為CD>AC>BD>BC>AB>AD，與方差分析結(jié)果相同。

2.2.4 驗證實驗 由Design-Expert軟件分析得到黑青稞中降低RDS含量的最優(yōu)工藝條件為α-淀粉酶添加量150 U/g、料液比為1∶10 (g/mL)、酶解溫度為65 ℃、酶解時間為2 h，此時RDS含量為13.0%。為進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果的可靠及真實性，對酶解條件進(jìn)行3次平行試驗，測得RDS含量為13.7%，與預(yù)測值相差不大，說明建立的模型可靠。

圖5 各因素交互作用對RDS含量的影響

2.2.5 降糖活性 由圖6可知，與原粉相比，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別增加了52.7%和34.4%，可能是由于經(jīng)過處理后的青稞淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，減少了與消化酶的接觸[16-17]，從而使其抑制率得以增加，即青稞淀粉的體外降糖活性得到明顯提高。并且由于淀粉等碳水化合物進(jìn)入人體后，需在α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的共同作用下分解為單糖后才能被人體小腸吸收，因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以抑制餐后血糖的升高。

圖6 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化α-淀粉酶降低青稞快消化淀粉含量的工藝條件，最終篩選出了最佳酶解條件為α-淀粉酶添加量150 U/g、料液比1∶10 (g/mL)、酶解時間2 h、酶解溫度65 ℃。此條件下快消化淀粉含量為11.6%，慢消化淀粉含量為13.0%，抗性淀粉含量為75.4%，α-葡萄糖苷酶抑制率為75.86%，α-淀粉酶抑制率為75.54%。酶解前后，快消化淀粉含量下降了50.8%，慢消化淀粉含量升高了10.4%，抗性淀粉含量升高了40.4%，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分別升高了34.4%和52.7%，說明α-淀粉酶改善了淀粉的消化性能。后續(xù)可對酶解后青稞淀粉的理化性質(zhì)進(jìn)行深入研究。