基于海藻糖保護的預烤冷凍面包貯藏品質改善的研究

曲 敏，杜婷婷，陳鳳蓮, ，張 娜, ，楊麗媛,2

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江哈爾濱 150028）

抗凍保護劑具有降低冰點、抑制冰晶生成和生長，提高抗凍能力的作用[1]。主要分為鹽類、糖類、蛋白類、增稠類四種。糖類抗凍保護劑在冷凍時可以取代或結合生物大分子水膜，緊密包裹相鄰分子，形成玻璃體，具有維持一定的空間結構的功能[2-3]，長期有效維持生物膜、蛋白質、淀粉等各種生物組織和生物大分子的穩定性[4]。海藻糖（α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷），又稱酵母糖、漏蘆糖、蕈糖等，是由兩分子葡萄糖通過糖苷鍵結合形成的非還原性雙糖，是處于高溫、冷凍、輻射、干燥、高滲透壓等條件下合成的應急代謝物[5]，除作為碳源外，還對細胞和生物體的活力具有特殊功能作用，被稱為“生命之糖”[6]。在作為甜味劑、防腐劑、抗變形劑等添加劑的基礎上，我國原衛生部和國家計生委在2014年批準海藻糖為食品原料。近年來，海藻糖作為天然抗凍保護劑逐漸應用于冷凍食品品質改善的研究。白冬等[7]將海藻糖作為抗凍保護劑對南美白對蝦蝦仁進行凍藏處理，結果顯示，蝦仁保持了蛋白質的品質，Ca2+-ATP酶的活和顏色穩定性有所提高；劉薇叢等[8]發現海藻糖能夠減緩在不同凍融周次下冷凍魚面的品質下降，有效地抑制了水分的遷移；Jesús等[9]研究了冷凍速率結合海藻糖濃度對冷凍面包面團的影響，發現其黏彈性和發酵性能有所改善。

預烤冷凍面包是將醒發后的面團烘烤至7分熟，經冷凍、解凍以及復烤等過程所制作的面包。預烤冷凍面包以其方便快捷、工藝簡單、口感新鮮等優點越來越受到消費者的接受和喜愛[10]，但由于儲運過程中時常出現溫度波動，一定程度的凍融導致其解凍、烘烤后，與現烤面包比，存在面包比容較小、面包表面與內部粗糙、口感品質較差等問題[11]。本研究以海藻糖作為抗凍保護劑，考察了經凍融處理后預烤冷凍面包的熱重特性變化以及復烤面包質構特性、感官評價、橫切面氣孔結構、電鏡觀察的變化。旨在改善預烤凍藏面包品質，以期為產業化生產提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻糖 上海藍季生物有限公司；金沙河富強高筋小麥粉 河北金沙河集團；安琪即發活性干酵母安琪酵母（崇左）有限公司；雀巢營養甜奶粉 雀巢（中國）有限公司；安佳淡味黃油 新西蘭恒天然集團；食鹽、白糖、雞蛋 市售；戊二醛（分析純） 南京森貝伽生物科技有限公司；Na2HPO4·12H2O（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司；乙醇（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；叔丁醇（分析純） 上海紫一試劑公司。

ESJ180-4型電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；ALC-210.4型分析天平 Mettler.Toledo instr.LTD；CS-B5A型攪拌機 廣東番禺區昌盛機電設備有限公司； TA-XT2i型質構儀 英國Stable Micro System公司；STA6000型綜合熱分析儀 珀金埃爾默儀器（上海）有限公司；XK01型恒溫恒濕發酵箱北京騰威機械有限公司；YXD型遠紅外食品烘箱上海花元食品機械有限公司；掃描儀、S-3400N掃描電鏡 日本Hitachi公司；ES-2030冷凍干燥儀 日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 預烤面包的基本配方 預烤面包的基本配方為小麥粉100 g、白砂糖20 g、奶粉7 g、酵母1.3 g、食鹽0.8 g、全蛋液10 g、水50 g、黃油10 g。

1.2.2 預烤面包的制作 利用吳征等[12]的方法制備預烤冷凍面包，包括預烤面包和復烤面包工藝。首先將0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%海藻糖溶解于水中后與其他原料混勻，以未添加海藻糖作為對照組。經過一檔攪拌2.5～4 min，二檔攪拌14～20 min后得到面團，并將面團平均分割成100 g的小面團，搓圓整形，在35 ℃的發酵箱內醒發35 min，室溫靜置15 min后進行烤制，在80 ℃下預烤10 min至7分熟，再將預烤面包放置冷卻后，在-35 ℃下速凍35 min，使中心溫度達到-18 ℃，再放入-18 ℃下的冰箱凍藏備用。

1.2.3 預烤面包的復烤 將凍藏一周后的預烤面包，在溫度、相對濕度分別為30 ℃、75%的恒溫發酵箱內解凍40 min，當中心溫度為10 ℃時，設置烤箱的上下火溫度分別為170 ℃。預烤面包復烤10 min，室溫放置2 h后進行測定。

1.2.4 預烤面包的凍融實驗 將預烤面包放入-18 ℃冰箱貯存一周后取出、解凍，解凍方法同1.2.3，為一個凍融周次，即1周次。將以上預烤面包分別經0～5個周次的凍融處理。

1.2.5 復烤面包的TPA檢測 為考察在不同凍融周次下海藻糖的添加量復烤面包的質構特性，將復烤面包切成2×2×2 cm的小塊，采用P35探頭質構儀測定面包TPA，參數設定：下壓前、中、后速度分別為：3、1、2 mm/s，壓縮率：55%。平行試驗3組。

1.2.6 復烤面包感官評定 參照錢忠英等[13]和Svensson[14]的方法，并進行改進。隨機選取25名不同年齡、民族、性別及未經過專業感官評定訓練的人員通過九點嗜好法對不同凍融周次、不同海藻糖添加量的12組復烤面包進行感官評定，評判內容包括面包外觀、內部組織結構、酸度、氣味、味道、口感和整體接受度。評定標準以對嗜好程度描述：十分討厭、很討厭、中度討厭、有點討厭、不討厭也不喜歡、有點喜歡、中度喜歡、很喜歡、十分喜歡9項，分別對應評定分值1～9分。

1.2.7 復烤面包的熱重分析 取藻糖添加量為0%～1%的復烤面包芯，稱取5 mg放在綜合熱分析儀中進行檢測。參數設定：氮氣流速、掃描溫度范圍分別為20 mL/min，25～200 ℃，30 ℃保持1 min、30～200 ℃升溫速度5 ℃/min，200 ℃保持1 min，得到樣品的熱重分析曲線（Thermogravimetric Analysis，TG）。

1.2.8 復烤面包氣孔形態分析 掃描儀對1 cm厚的復烤面包進行圖像收集，參照Tournier等[15]方法利用Image J 對復烤面包進行氣孔形態分析，得到面包的氣孔平均面積（Average Stomatal area，AS）、氣孔稠密度（Cell Density，CD）、氣孔表面分率（Area Fraction，AF）。

1.2.9 復烤面包結構表征（SEM，Scanning Electron Microscopy）觀察 參照劉亞楠等[16]觀察冷凍面團SEM的方法，復烤面包中心位置取長寬高均小于1 cm的方塊，真空冷凍干燥后置于掃描電鏡內，再用導電膠帶粘在樣品臺上，經鍍金后掃描電鏡觀察，分別在500、1000的放大倍數下觀察預烤冷凍面包微觀結構。

1.3 數據處理

3次平行實驗，結果為實驗平均值±標準偏差。采用SPSS、Origin、Excel軟件進行數據分析以及應用。

2 結果與分析

2.1 海藻糖添加量對不同凍融周次復烤面包品質的影響

從表1可以看出，在0～5個凍融周次下，隨著海藻糖添加量的增加，復烤面包的硬度、咀嚼性、粘聚性呈現出先減少后增加的趨勢，彈性、回復力、粘聚性則先增加后減少。如圖1所示，當添加海藻糖后，復烤面包在各個凍融周次的質地發生了不同程度的改善，其中以海藻糖添加量為0.6%時，效果最優。由此可知，隨著凍融周次的增加，復烤面包的硬度、咀嚼性不斷增加，彈性、回復性以及粘聚性不斷減少，且海藻糖的添加有效地阻止了劣變的程度，其中，以海藻糖的添加量為0.6%的復烤面包質地改善效果最為顯著。

表1 海藻糖添加量對不同凍融周次復烤面包品質的影響Table 1 Effects of trehalose addition on quality of rebaked bread in different freezing-thawing cycles

圖1 海藻糖添加量對復烤面包感官品質的影響Fig.1 Effect of trehalose addition on the sensory quality of rebaked bread

造成以上變化的原因可能是，預烤面包在烘焙過程中，游離水不斷向外擴散到表面[17]，在冷凍初期，內部水分快速遷移，面包水分減少，玻璃態溫度升高，質地由松軟變得堅硬[18]。但隨著凍融周次的增加，冰晶的不斷析出，結合水不斷轉換為自由水，以致結合水含量不斷減少，未凍溶液濃度不斷提高直至達到最大凍結濃縮狀態。此時雖然剩余水分將不再結晶，但蛋白質和淀粉等卻因失去水分保護而遭遇挫傷。同時，預烤面包在凍融的過程中，冷凍使面包內部不斷產生冰晶以及重結晶，導致面筋蛋白質網絡結構遭到破壞，發生解聚現象，網絡結構弱化[19]，淀粉顆粒暴露出來。因此，水分的流失和遷移是導致復烤面包的硬度和咀嚼度增加，彈性、回復性和黏聚性降低的因素之一。

續表 1

另外，淀粉老化也是造成復烤面包硬度增加的一個重要因素。硬度的高低是衡量面包抗老化程度的重要標志[20]。在預烤面包中，早已糊化的α-淀粉自動排序，相鄰分子間氫鍵又重新形成，重現淀粉β-化，促進了淀粉顆粒的重結晶能力[21]，導致面包發生老化，硬度增加。而海藻糖的添加較好地控制了水分的遷移，減少冰晶和重結晶的產生，且有助于提高其乳化能力[22]，進而降低了對預烤面包蛋白質以及淀粉的破壞，進而減緩了面包老化的程度，進而面包硬度、咀嚼性有所下降，面包的彈性、回復性、黏聚性也有所改善。使其感官品質有所提升，因此，添加0.6%海藻糖能夠有效的減少凍融對預烤冷凍面包的影響。此外，在凍融周次為0～3次時，海藻糖能夠有效的減緩凍融對與預烤冷凍面包品質與感官品質的影響。

由圖2可知，隨著海藻糖添加量的增加復烤面包的外觀、內部組織結構、口感以及整體接受等都具有明顯變化，過量的有抑制酵母發酵的可能[23]。由圖3可知，當海藻糖添加量為0.6%時，隨著凍融周次的增加，面包外觀、內部組織結構、酸度、氣味、味道、口感、整體接受度呈現不同程度的下降。其中在0～3凍融周次，復烤面包的品質是下降是較緩慢，在4～5個凍融周次內，復烤面包的品質呈急劇下滑。可能由于在冷凍過程中，蛋白質遭到破壞，可能導致其與糖類物質在加熱的過程中無法生成適量的擬黑素，美拉德反應不夠充分，進而使原酮、醛和雜環化合物等風味物質的生成減少，這也是導致預烤面包因凍融處理口感、味道和氣味等感官品質下降的原因。而海藻糖通過“水替代”“玻璃態”或“優先排阻”多種機制保護細胞免受惡劣環境對細胞膜和蛋白質結構的破壞，減緩了水分的遷移和存在方式[8]，緩解了凍融過程中冰晶預烤面包品質的破壞，使其在預烤面包復烤時美拉德得以反應程度加深[24]，風味物質增加，進而改善了復烤面包的感官品質。因此，多次凍融處理使復烤面包的質構特性劣變，感官品質下降。添加海藻糖后，復烤面包的品質得以不同程度的改善，且添加0.6%的海藻糖效果最佳。

圖2 凍融周次復烤面包感官品質的影響Fig.2 Influence of freeze-thaw cycle on sensory quality of rebaked bread

2.2 海藻糖對復烤面包熱重特性的影響

從圖3與圖4可以看出，在0～220 ℃溫度內復烤面包的TG曲線均呈下降趨勢，顯示其重量百分比發生了連續的變化。其中，在40～60 ℃區間內，復烤面包的重量百分比減少明顯加快，而60～220 ℃區間則趨勢減緩，說明復烤面包中水分散失的呈現規律性的變化，即，隨著溫度的升高，水分蒸發量逐漸增長，而在40～60 ℃區間內蒸發量變化明顯，60～220 ℃區間減緩。通過Huang等[25]的研究可知，50～150 ℃下的初始失重與加熱過程中是游離水的損失有關。可以推斷，在40～60 ℃的區域內多數蒸發掉的水分是與大分子結合的最松散的一類游離水，由于其自由性較高，在較低溫度下易揮發到體系以外。因此，不同冷凍樣品中，由于樣品的質地與冷凍條件的差異將導致其水分的存在分布狀態和存在形式不同，進而導致在加熱條件下游離水的蒸發情況也不同。

圖3 海藻糖添加量對復烤面包的熱穩定性的影響Fig.3 Effect of trehalose addition on thermal stability of rebaked bread

圖4 凍融周次對復烤面包的熱穩定性的影響Fig.4 Effect of freeze-thaw cycles on thermal stability of rebaked bread

因此，截取不同海藻糖添加量及不同凍融周次的復烤面包在40～60 ℃區間重量百分比的變化，繪制區段TG曲線見圖5～圖6。從圖5可以看出，各組復烤面包的重量百分比隨著溫度的增長而下降，不同海藻糖添加量及不同凍融周次下的的復烤面包的下降趨勢存在比較顯著的差異。與海藻糖添加量為0%相比，隨著海藻糖添加量的增加，預烤冷凍面包的重量百分比的下降趨勢減緩，其中添加量0.6%、0.8%和1.0%組樣品的下降速率減緩較顯著；從圖6可以看出，當海藻糖添加量為0.6%時，在0～3凍融周次內，重量下降速度緩慢。這是由于海藻糖為糖類抗凍保護劑，具有兩個高靈活性的葡萄糖單體，其溶液中的游離羥基可與水結合，與相鄰的分子緊密連接，形成一種在結構上類似玻璃狀的碳水化合物玻璃體，該結構在高水分含量時起到了塑化作用，束縛了游離水分子的自由度，降低了游離水的數量。同時，該碳水化合物玻璃體結構在低溫冷凍時，會形成一個不完全凍結區域，減少了區域內的“共晶體”溫度，抑制了水分子遷移、結晶以及重結晶[26]，使生物分子維持一定的空間結構，減少了冷凍對組織結構的破壞，并保持水分分布的穩定[27]。Tadanori等[28]驗證了海藻糖能夠有效的減緩冰晶與重結晶的形成和數量。

圖5 不同海藻糖添加量的復烤面包的區段TG曲線Fig.5 Section TG curve of the rebaked bread with different trehalose addition

圖6 不同凍融周次的復烤面包的區段TG曲線Fig.6 Sectional TG curves of rebaked bread in different freeze-thaw cycles

本研究中，在40～60 ℃熱重曲線變化較大，即在該溫度范圍各組樣品質量變化及變化的速率有明顯的差別，顯示不同海藻糖添加量有效的減少復烤面包中水分的減少、流失與遷移，具有很好的抗凍保護作用。其中，在0～3凍融周次內0.6%～1.0%的海藻糖的預烤冷凍面包在加熱過程中重量百分比和重量變化速率變化較小。

2.3 海藻糖添加量及凍融周次對復烤面包芯氣孔形態影響

2.3.1 海藻糖添加量對復烤面包芯氣孔形態影響在2.1部分的基礎上，考察不同海藻糖添加量在1凍融周次的復烤面包橫截面氣孔形態。如圖7所示，隨著海藻糖添加量的增長，復烤面包呈現的氣孔形態不同，與對照組（A）相比，當海藻糖添加量為0.6%時，復烤面包橫切面氣孔密度、面包的比容較小（B、C）；當海藻糖添加量為0.6%時（D），氣孔數量較多，氣孔結構均勻細膩，且光滑；當海藻糖添加量達到0.8%～1.0%時（E、F），復烤面包的整體品質下降。因此當海藻糖添加量為0.6%時，復烤面呈現較佳形態。從表2可以看出，對照組復烤面包芯的AS、CD、AF處于較低數值，隨著海藻糖添加量的增加，AS、CD、AF發生了明顯的的變化，均呈現出先增加后減少的趨勢，添加0.6%海藻糖的復烤面包時，三者達到最高值，較未添加海藻糖的復烤面包分別提高了54.00%、53.90%和48.68%。說明復烤面包的面包芯更加細膩、孔隙結構均勻，進而反映了面包芯氣孔持氣率和穩定性的提高[29-30]。且海藻糖的添加量與AS、AF均呈現正相關關系，與CD呈現顯著正相關（P＜0.05），與Puerta等[31]的研究結果一致。說明，在復烤面包中添加0.6%的海藻糖能夠有效的改善其面包組織狀態。

圖7 不同海藻糖添加量的復烤面包橫切面氣孔結構及呈現圖Fig.7 Stomatal structure and appearance of cross-section of rebaked bread with different trehalose addition

表2 海藻糖添加量對復烤面包芯氣孔氣孔形態影響Table 2 Effect of stomatal morphology of rebaked bread core with trehalose addition

2.3.2 凍融周次對復烤面包芯氣孔形態影響 從2.1部分得到抗凍保護劑海藻糖的最適添加量為0.6%，在此最佳條件下，考察不同凍融周次的復烤面包橫截面氣孔形態。如圖8所示，隨著凍融周次的增加，復烤面包橫切面孔隙表面干燥且不均勻，從綿密均勻細小的孔隙逐漸變為大小不一（A～F）。面包的孔徑逐漸增大，內部結構不均一、孔徑大小疏松。從表3可以看出，對照組復烤面包芯的AS、CD、AF處于較高的值，隨著凍融周次的增加，AS、CD、AF發生了顯著的變化，AS、CD、AF在第5凍融周次時快速度下降，其中AS、CD、AF分別降低了34.71%、45.15%、42.92%。且凍融周次與AS、CD、AF均呈現極顯著負相關（P＜0.01）。說明在4～5個凍融周次內復烤面包的品質呈現急劇下降。

圖8 不同凍融周次的復烤面包橫切面氣孔結構及呈現圖Fig.8 Stomatal structure and appearance of cross-section of rebaked bread at different freeze-thaw cycles

表3 凍融周次對復烤面包芯氣孔形態影響Table 3 Effect of stomatal morphology of rebaked bread core by freeze-thaw

2.4 海藻糖添加量及凍融周次對復烤面包微觀結構影響

2.4.1 海藻糖添加量對復烤面包微觀結構影響 在2.1部分的基礎上，考察不同海藻糖添加量在1凍融周次的復烤面包橫截面的電鏡表征。如圖9所示A～F、a～f微觀結構可以看出，在未添加海藻糖（A、a）的復烤面包可以觀察到大量淀粉顆粒暴露在外，淀粉顆粒表面粗糙，覆蓋在淀粉顆粒上的面筋膜斷裂，且面筋蛋白網狀結構粗糙孔洞大較深，導致面筋蛋白結構及其不穩定，隨著海藻糖添加量的增加，復烤面包由淀粉顆粒裸露、面筋蛋白網絡有斷裂（B、C、b、c），向蛋白網絡連續并均勻包裹淀粉顆粒轉變，當海藻糖添加量為0.6%（D、d）時大部分淀粉顆粒得以包裹，隨后又發生劣變（E、F、e、f）。可見，隨著海藻糖添加量的增加，冷凍對復烤面包微觀結構破壞得到了一定改善。這是由于在冷凍條件下，海藻糖能夠填充進在組織表面，起到一種保護膜的作用，減緩了冰晶對網絡結構的破壞，間接保護了其淀粉、蛋白質等大分子的形態結構[32]。因此，適量的海藻糖添加量對保護預烤冷凍面包中的淀粉和蛋白網絡結構具有很好的抗凍保護作用。其中，以海藻糖添加量為0.6 %時復烤面包的內部組織結構最佳。

圖9 海藻糖添加量對復烤面包超微結構影響（左500×、右1000×）Fig.9 Effect of trehalose addition on ultrastructure of rebaked bread （left 500×, right 1000×）

2.4.2 凍融周期對復烤面包芯微觀結構影響 從2.1部分得到抗凍保護劑海藻糖的最適添加量為0.6%，在此最佳條件下，考察不同凍融周次的復烤面包橫截面電鏡表征，如圖10所示A～F、a～f微觀結構可以看出，未經過凍融的復烤面包（A），淀粉顆粒表面光滑，無缺失，且蛋白面筋網絡連續，前3凍融周次內（B～D、b～d），面筋蛋白網絡逐漸減少且不連續，但淀粉顆粒得以被面筋網絡較均勻包裹；經過4～5次反復凍融，筋蛋白網絡雖逐漸減少且不連續，但淀粉顆粒卻得以被面筋網絡較均勻包裹，并少有不完整。這是由于在凍藏初期，面筋蛋白主要以二硫鍵連接成網絡結構，面筋網絡結構完整，淀粉顆粒大小均勻，完整飽滿[33]，面筋網絡結構穩定。隨著凍融次數的增加，二硫鍵逐漸斷裂，面筋蛋白解聚，海藻糖的添加不能遏制面筋網格結構的破壞，網格結構不再完整[34]，大分子物質與水結合能力逐漸減弱，面包中的游離水大量的流失。說明在3個凍融周次內，添加適量的海藻糖能夠有效的延緩凍融對預烤冷凍面包的影響。

圖10 凍融周次對復烤面包超微結構影響（左500×、右1000×）Fig.10 Effect of freezing and thawing cycle on ultrastructure of rebaked bread （ left 500×, right 1000×）

3 結論

質構特性與感官品質分析顯示，在0～5個凍融周次下，隨著凍融周次的增加，復烤面包的質地發生了很大的劣變。其中，硬度、咀嚼性不斷增加，彈性、回復性、黏聚性、整體接受度不斷降低；隨著海藻糖添加量的增加，復烤面包的質構特性均發生了不同程度的改善，且在海藻糖的添加有效地阻止了劣變的程度，海藻糖添加量為0.6%的改善效果最為顯著。

熱重檢測結果表明，隨著海藻糖含量的增加和凍融周次的增加，復烤面包重量百分比呈下降趨勢，且在40～60 ℃區間內，復烤面包的重量百分比減少明顯加快。海藻糖的添加致使重量下降速度相對緩慢，其中，以0.6%、0.8%和1.0%添加量的下降速率減緩較為顯著。

橫截面、氣孔結構結果顯示，隨著海藻糖添加量的增加，AS、CD、AF值均先增加后減少，以添加0.6%添加組達到最高值，較未添加海藻糖的復烤面包分別提高了54.00%、53.90 %和48.68%；隨著凍融周次的變化，AS、CD、AF在3個凍融周次內相對穩定在前，之后大幅度下降。海藻糖的添加使面包芯橫切面細膩、空隙均勻、組織狀態向好，氣孔持氣率和穩定性得以提高。

SEM結果顯示：隨著海藻糖添加量的增加，復烤面包由蛋白質結構不穩定、淀粉顆粒暴露向蛋白網絡連續并均勻包裹淀粉顆粒轉變。隨著凍融周次的增加，海藻糖添加組樣品的面筋蛋白網絡雖逐漸減少且不連續，但淀粉顆粒卻得以被面筋網絡較均勻包裹，并少有不完整。

預烤冷凍面包將滿足消費者對現烤出爐面包口感新鮮的追求，適應市場對高效生產需求的同時，彌補面包門店產品不穩定等缺點。