冠突散囊菌及其發酵應用研究進展

姜良珍，王 羅，楊 濤，鄭浩楠，趙江林，向達兵，鄒 亮，萬 燕,

（1.成都大學食品與生物工程學院， 四川成都 610106；2.農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川成都 610106；3.中國科學院成都生物研究所環境治理與食品安全領域， 四川成都 610041）

茯磚茶是以黑毛茶為原料，經過汽蒸、渥堆、發花、干燥等一系列復雜工藝制作而成的后發酵茶，其中發花是茯磚茶加工的關鍵步驟，決定著茶的品質。發花階段，優勢“金花菌”大量繁殖，茶葉在微生物作用下發生深度的生理生化變化，形成茯磚茶獨特的風味[1-5]。通過形態學種群分析，DNA條形碼和多位點測序等方法分析“金花菌”的進化關系，發現“金花”實際是冠突散囊菌的金黃色閉囊殼（圖1），而冠突散囊菌是茯磚茶的唯一優勢真菌[5]。在國家標準中，茯磚茶是唯一要求冠突散囊菌這項指標的黑茶類品種[6]。六堡茶等黑茶中也分離出冠突散囊菌[7]。本文主要討論黑茶冠突散囊菌的生物學特性、酶系、代謝產物和安全性等特性，以及其發酵應用的研究進展。

圖1 冠突散囊菌的菌落形態和顯微特征[10]Fig.1 Colonial morphology and microscopic characteristics of Eurotium cristatum[10]

1 冠突散囊菌的生物學特性

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）屬子囊菌綱，曲霉目，曲霉科，作為產有性型和無性型的全型真菌，其典型特征是具冠狀突起及表面明顯粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子。根據其孢子的特征，將該菌有性型鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum），無性型鑒定為針刺曲霉菌（Aspergillus spiculosusBlaster），別名為冠突曲霉菌（Aspergillus cristatumBlaster）[8-9]。

冠突散囊菌好氧，耐干燥，最適pH為5，最適生長溫度為28～30 ℃。該菌適應性較強，在茶磚和低滲培養基（0.5 mol/L NaCl）上行有性繁殖，繁殖方式隨滲透壓升高逐漸轉變為無性繁殖，高滲透壓（≥3 mol/L NaCl）條件下僅行無性繁殖[10]，其孢子在85 ℃沖泡5 min后仍可存活[11]。Ca2+信號途徑及VeA基因在其適應高滲環境[12]和孢子形成[13]中發揮重要作用。碳源和氮源顯著影響菌絲生長和產孢過程[14-16]，其中碳源為產孢所必需[14]。不同來源菌株對不同種類碳源的利用程度不同。固態發酵以D-果糖、葡萄糖、蔗糖、D-木糖、麥芽糖等為佳，而對山梨醇、瓊脂、單寧和淀粉等利用較差；液態發酵對碳源種類依賴性較低[14-16]。碳源濃度[15]和氮源種類[16]亦影響產孢的類型和數量。無機氮源促進孢子萌發效果較好，而有機氮源對菌落生長的促進作用較大[16]，因此，在實際培養中往往采取兩者結合的方式。

2 冠突散囊菌的酶系

冠突散囊菌能分泌多種胞外酶，如纖維素酶、蛋白酶和多酚氧化酶等。在茯磚茶“發花”過程中，冠突散囊菌通過分泌胞外酶促使茶葉中的茶多酚發生氧化、縮合，形成茶黃素、茶紅素、茶褐素等物質，淀粉和纖維素等不溶性多糖分解轉化為葡萄糖和果糖，蛋白質分解為氨基酸等，且使氨基酸、糖類、咖啡堿等各成分之間發生聚合、縮合等一系列的復雜反應[2,4,17]，消除茶葉的粗青、苦澀味，使茶葉在口味上更加醇和爽口，甜滑回甘，湯顏色紅亮，形成茯磚茶特定的風味、香氣、色澤，并且增加茶葉中的活性物質。纖維素酶在茯磚茶渥堆過程中能軟化老葉，降解粗纖維為可溶性糖。高溫殺青使茶葉中內源纖維素酶活性被急劇鈍化，渥堆和“發花”過程中微生物的代謝活動使纖維素酶活性明顯增強[18]。阿魏酸酯酶和木聚糖酶協同作用于曬青毛茶可顯著提高其阿魏酸和低聚木糖的含量，增加茶湯活性物質[19]。胞外多酚氧化酶、漆酶等可將兒茶素氧化為茶黃素、茶紅素和茶褐素等水溶性的色素[17,20-22]。過氧化物酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶和總超氧化物歧化酶是冠突散囊菌發酵茶抗氧化的物質基礎[23]。其淀粉酶和蛋白酶等消化酶，可顯著提高人體腸道中蛋白酶、淀粉酶的活性[24-25]，與茯磚茶的促消化作用密不可分。糖苷酶可將西洋參、高麗參的其他皂苷成分有效轉化為人參皂苷Rd及多種未知結構的高保留性的皂苷產物[26]。酶是冠突散囊菌進行發酵應用的重要基礎，其性質尚需進行深度研究。

3 冠突散囊菌的代謝產物

3.1 色素

冠突散囊菌在馬鈴薯等培養基上生長代謝通常會產生大量的色素物質，主要為黃色素和黑色素[27]。黃色素的含量與有性孢子數量正相關，與“金花”的顏色有關[27]。以石油醚提取陜西茯磚茶冠突散囊菌液態發酵的黃色素，發現其為脂溶性色素，最大吸收波長為398 nm，不耐高溫，耐酸不耐堿，金屬離子（Fe3+、Fe2+、Cu2+）、太陽光等條件會使其降解[28]。光譜學分析推測黃色素含有-C-H、C-O、C=C等官能團[28-29]。黑色素是一類結構復雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱，具有避免光傷害、強抗氧化性、抗輻射、免疫調節等作用。冠突散囊菌所產胞外黑色素的最大吸收波長298 nm，在70 ℃以下耐熱性強，Mg2+、Zn2+、Fe3+對其的穩定性有增強作用，遇光、氧化還原劑易分解[30-31]。冠突散囊菌色素的理化性質研究尚有待深入。

3.2 生物活性代謝物

冠突散囊菌含有多種生物活性代謝物，如黃酮、生物堿、哌嗪二酮衍生物和多糖[32-33]等。在脂多糖誘導的RAW264.7炎癥細胞模型中，苯甲醛衍生物通過抑制iNOS和COX-2的表達發揮抗炎作用[34]。水溶性二酮哌嗪二聚體生物堿eurocristatine在糖尿病老鼠模型中可通過調節PI3K/AKT信號通路達到與二甲雙胍相當的降糖效果[32-33]。脂溶性組分包含異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿cristatumin F以及echinulin、dehydroechinulin、 neoechinulin A和variecolorin O，其中cristatumin F有DPPH自由基清除活性和對3T3L1細胞的邊緣衰減作用[35]。真菌多糖是冠突散囊菌的重要的活性代謝物。菌株MK346334的粗糖提取液，尤其是EPS2組分，顯示出與腸道微生物群調節相關的免疫調節活性[36]。從菌絲體分離的多糖ECIP-1A，分子量為24.3 kD，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成，體外對巨噬細胞RAW264.7有顯著的免疫調節活性[37]。發酵初期的冠突散囊菌菌絲能產生較高含量的洛伐他汀（降膽固醇藥物）[14,38]?；炀才囵B可拓寬真菌次級代謝產物譜，冠突散囊菌與金黃色葡萄球菌固體混合發酵產生兩種新化合物（tetrahydroauroglaucine和epiheveadride），其混合代謝物對A549細胞等有較好的細胞毒活性[39]。

4 冠突散囊菌的安全性

冠突散囊菌曾被認為是有毒真菌。但急性毒理學試驗顯示，大鼠經口灌胃對冠突散囊菌的最大耐受劑量大于7.31×1010個/mL，對其發酵成的茯磚茶的LD50大于5001 mg/kg。喂養30 d后，各劑量組菌液和茶葉浸出液對大鼠在體重、血液學指標、臟器系數及一般行為方面均無顯著性影響[11,40]。Ge等[10]通過系統分析比較轉錄組學和基因組學的數據發現冠突散囊菌不含毒素生物合成相關的基因簇。進一步檢測常見的6種毒素發現，其僅產生低劑量的伏馬菌素B1（0.17 ppm），遠低于美國食品與藥品監督總局食品安全國家標準的限量（2 ppm），而我國對此毒素尚無限量標準。以冠突散囊菌（CB10001）或其孢子飼喂高脂飲食的C57BL/6J小鼠，發現該菌可在小鼠腸道存活（超過2周時間），并可有效阻止小鼠增重，緩解炎癥，調節腸道菌群，恢復腸道穩態[11]。冠突散囊菌可通過抑制NF-κB和MAPK信號通路的激活來抑制結腸炎癥反應，保護腸道屏障，從而改善潰瘍性結腸炎小鼠的結腸縮短、體質量下降和評定疾病活動指數評分等指標，修復葡萄糖硫酸鈉造成的病理組織學損害[41]。另外，茯磚茶在我國西北地區有悠久的飲用歷史，研究顯示其具有降脂減肥、增強免疫、調節糖代謝和調節腸道菌群等多種生物學功效[11,42-45]。因此，判定冠突散囊菌為實際無毒物，且為潛在的益生菌，為其推廣應用提供了依據。

5 冠突散囊菌的發酵應用

5.1 茶葉加工

茶葉加工過程中人工接種冠突散囊菌可促進茶品質轉化，加速發酵進程，縮短生產周期，利于全程清潔化生產，保證品質均一性。發酵過程以固態發酵為主，又可分為普通茶發酵和植物代茶發酵兩種。多數茶葉經冠突散囊菌發酵后，苦澀味降低，散發獨特菌花香，茶褐素增多，口感和品質得到提升。茶葉所含的化合物——香味物質、呈味物質、色澤和生物活性物質等均發生顯著變化，進一步影響了茶葉的感官性狀和功能活性（表1）。

表1 不同品種茶在冠突散囊菌發酵前后性狀對比Table 1 Comparison of characteristics of different tea varieties before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.1.1 氣味物質變化 經冠突散囊菌適度發酵的茶葉，風味差異明顯，香氣物質含量與種類均有所增加，香氣協調，兼具茶香和菌花香[17,46-48]。發酵可促進萜醇類物質的代謝，尤其是芳樟醇氧化物的含量顯著增加。發酵茶湯所含的醛類氣體減低，而酯類氣體含量顯著提高[17,46-48]。研究顯示，在以茶葉的碳水化合物為碳源時，冠突散囊菌一方面通過MEP途徑分解糖苷前體提供能量，產生大量的游離芳香化合物[47]；另一方面積累了大量的苯丙酸/苯環類化合物途徑的中間代謝物，包括苯甲醇和苯乙醇，以及大量的甲酯化合物，如水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯和苯乙酸甲酯[48]。這些化合物共同作用產生了特有的茶香和花香味。

5.1.2 呈味物質變化 冠突散囊菌發酵的茶湯，滋味甘甜醇厚。茶葉中負責不同口感的各種氨基酸含量顯著減低，可能與美拉德反應和菌的生長代謝相關[17]。研究表明，冠突散囊菌發酵后的茶葉中總酚，尤其是茶葉苦澀味形成的關鍵化合物兒茶素類含量顯著下降[17,46,48-49]。其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表兒茶素（EC）等茶多酚含量下降最為顯著[17,46]。酯型兒茶素水解能產生非酯型兒茶素和沒食子酸（GA）[17,48]。EC、GA和EGC的含量隨著菌代謝進一步降低[17]。另外，在影響茶葉苦味的生物堿（茶堿、咖啡堿、可可堿等）中，主要是咖啡堿的含量顯著下降[17]。

5.1.3 色澤變化 冠突散囊菌“發花”過程對茶湯顏色影響顯著，多數隨著發酵程度的加深，茶葉顏色變深。茶黃素、茶紅素等的含量先增加后減少，而茶褐素大幅增多[17,46-48]。過氧化物酶和漆酶能持續轉化茶多酚成茶紅素、茶黃素，而茶黃素、茶紅素能與兒茶素以及其他化合物進一步通過聚合、縮合、偶聯和氧化等作用形成茶褐素[17,46]。通過分泌多種胞外酶可促進了茶褐素的形成。茶褐素生物學活性較高，其含量的增加使茶湯顏色呈現棕紅色，且可能是發酵茶主要的呈味物質[17,46]。另外，冠突散囊菌自身產生的黃色素、黑色素等色素，是否也對茶葉、茶湯的顏色產生了影響，目前尚無定論。

5.1.4 其他物質變化 由于纖維素酶、淀粉酶等酶的活性以及發酵環境的差異，冠突散囊菌發酵對茶葉可溶性糖含量的影響不盡一致。桑葉茯茶、杜仲茯茶和MF800948發酵的秋季綠茶的水溶性碳水化合物皆降低[17,50-52]，而“金花藤茶”的可溶性糖含量增加[53]?！敖鸹ā逼斩齕48]和“金花”甜茶[54]的總黃酮含量提高，而藤茶拼配紅茶發酵制作的“金花藤茶”多酚、二氫楊梅素的含量顯著減少[53]。

5.1.5 生物活性變化 茶葉內含物的變化影響發酵茶的生物學活性[55]?！敖鸹ā逼斩偪寡趸钚院妥杂苫宄芰蕴嵘齕48]，冠突散囊菌發酵的甜茶[54]和刺五加茶[56]的總抗氧化活性提升，而羥自由基與DPPH自由基清除活性卻顯著下降。以廣西六堡茶冠突曲霉（E6）發酵當地的“白毫毛尖”[7]和桑葉茶[50-52]，其DPPH降解能力、總抗氧化能力均有變化。上述研究為冠突散囊菌發酵茶產品的開發奠定了基礎。

5.2 谷類和豆類食品加工

冠突散囊菌可利用多種碳源生長，亦被用于谷類和豆類的加工過程，見表2。其發酵的燕麥面醬，色澤鮮艷，醬香濃郁，咸甜適宜，多酚含量為原料燕麥的6倍[61]。添加茯磚茶發酵糯米產生了35種特異性的香味物質，α-淀粉酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性增強，總酚含量提高[62-63]。冠突散囊菌固態發酵甜蕎，相比毛霉或根霉，對黃酮和總酚含量的促進作用更強[64-65]；發酵苦蕎，清蛋白、球蛋白、醇蛋白和總蛋白的含量增加[66]。以冠突散囊菌（YL-1）固態發酵黃豆[67]和黑豆[68]，總酚、黃豆苷元、金雀異黃酮、大豆異黃酮和總苷元等的含量均顯著提高；揮發性物質差異明顯，其中酯含量增加，若干醇和醛含量減少。冠突散囊菌發酵的豆渣產品Okara，以兩種蒽醌（大黃素和大黃素甲醚）為標志性代謝物，其α-糖苷酶抑制活性更強，能有效降低小鼠餐后血糖水平[69]。研究顯示，固態發酵能破壞植物細胞壁或水解細胞壁組分的共價鍵和不可溶的結合性多酚，導致酚類化合物的釋放[65]。上述加工食品中多酚和黃酮含量的升高，與發酵過程中酶的作用，尤其是冠突散囊菌水解酶活性密切相關[65,67]。多酚和黃酮含量的升高，使得冠突散囊菌的谷類和豆類食品體外抗氧化性、自由基清除能力以及糖脂代謝相關酶抑制率等生物學活性增強顯著[65-68]。因此，這類發酵制品可作為功能性食品或者天然食品添加劑而成為有效的抗氧化劑。

表2 谷類和豆類經冠突散囊菌發酵前后性狀對比Table 2 Comparison of characteristics of different food varieties before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.3 中藥材深加工

冠突散囊菌被用于中藥材的深加工過程，可以有效促進中藥的解毒和新型天然產物的產生，提高藥效，見表3。人工接種冠突散囊菌發酵銀杏葉或種子，可有效脫除銀杏毒素和銀杏酸，增加總黃酮、聚戊烯乙酸酯和芳香物質的含量[70-72]；發酵茶“金花”茂盛，湯色橙黃明亮，滋味醇和，有金花香氣[70]；發酵物抗氧化能力提高，淀粉酶和蛋白酶活性增強[71-72]。葛根經冠突散囊菌固態發酵后，中藥味得到顯著改善，總黃酮和葛根素含量及抗氧化活性顯著增加[73-74]。Xiang等[75]通過靶向代謝組學技術比較了冠突散囊菌和紅曲霉發酵前后的姜黃素類化合物，共發現115種姜黃素類化合物，其中有48種結構比較新穎，14種為姜黃中首次發現，31種為發酵姜黃過程中新產生，其中的27種姜黃素類化合物為冠突散囊菌新發酵產生，23種為冠突散囊菌發酵特異性。為刺激其沉默的次級代謝產物合成基因簇的表達，陸承云[76]將冠突散囊菌與桑黃共培養并分別固體發酵金銀花（葉）、葛根和黃芪。結果顯示，發酵金銀花（葉）的木犀草素含量增加，綠原酸、蘆丁的含量顯著降低，發酵黃芪的總黃酮含量顯著提高，藥效增加[76]。以保加利亞乳桿菌、凝結芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和冠突散囊菌等食品工業中常用的微生物菌種液態發酵含有皂苷的三七、人參和西洋參幾味中藥，結果發現，僅冠突散囊菌能有效地將西洋參和高麗參中的其他皂苷成分轉化為稀有人參皂苷Rd以及多種未知結構的高保留性皂苷產物[26]。冠突散囊菌發酵有效提高了枸杞[77]和白芷[78]的抗氧化活性以及自由基清除能力。以不同植物內生菌固態發酵“化癥回生”口服液的殘留藥渣，發現來源于茯磚茶的冠突曲霉（CB10002）能有效回收利用藥渣中的營養成分，并轉化產生2.0 mg/g的羥基大黃素（citreorosein）和7.5 mg/g總蒽醌（anthraquinone）[79]。以冠突散囊菌轉化中草藥活性成分顯示出良好的應用前景。

表3 冠突散囊菌發酵不同中藥材前后性狀對比Table 3 Comparison of characteristics of different Chinese herbs before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.4 其他應用

部分研究關注了對冠突散囊菌的活性代謝產物的開發。通過對液態發酵和提取的條件進行優化，胞外黑色素的產量可達4.27 g/L[29-30]。尹慧慧等考察以甜菜粉等為原料用冠突散囊菌發酵產洛伐他汀的最佳條件，得出最優組合的產量為146.4 mg/kg[80]。此外，將冠突散囊菌制成銀納米微粒（AgNP），對銅綠假單胞菌等多種菌有抑制效果，且表現出與新霉素等的協同抗菌效應[81]，有潛力成為新型抗菌材料。茯磚茶來源的菌株ET1具有較強的降解β-氯氰菊酯和3-PBA的性能[82]，可用于污染環境的生物修復。

6 存在的問題及發展趨勢

基于其強適應性、豐富的酶系、多樣的活性代謝物和安全性等特性，冠突散囊菌在茶葉、豆谷類及中藥材深加工等領域已得到較廣泛應用。然而冠突散囊菌雖是潛在的益生菌，尚未被列入國家食品安全微生物名錄；發酵過程多以固態為主，液態形式較少[83]。因此，該菌仍有較大的開發空間。代謝物方面，研究多集中于真菌轉化基質總化合物庫的變化分析，對僅來源于真菌菌絲或孢子的天然產物研究較少，對化合物轉化的原因挖掘亦不透徹，可能是未來重要的研究方向。另外，多數基質經冠突散囊菌發酵后，其抗氧化性等生理學活性提高，但具體產生了哪些活性物質及如何發揮作用并不清楚。Zhou等通過在線HPLCPDA-三項-TOF-MS/MS-ABTS系統，篩選并鑒定了冠突散囊菌發酵的白芷中發揮抗氧化作用的5種呋喃并香豆素、5種生物堿和2種聚酮[78]，為此類研究提供了新的思路。綜上，未來為使冠突散囊菌在食品加工、中藥材加工等領域得到更好的應用，需綜合運用多種技術手段在檢測發酵過程，分析代謝物動態變化[46,74]，鎖定關鍵酶或相關生物代謝途徑[16]，探究菌體本身及其發酵制品的生理學活性及作用機制等方面展開深入細致地研究。