純麥酒發酵工藝優化及理化性質測定

王 凱，藍乙升，黃 鈺，趙文梅，陳禹锜，伍雅勵，李 楠,

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530004）

麥芽由我國重要的糧食作物大麥經發芽干燥制得，也是中醫臨床上常用的消食藥[1]。在萌發過程中，麥芽會產生大量的酶類，包括淀粉酶、蛋白分解酶等能治療食欲不振的消化酶，也包括多種維生素、卵磷脂、還原糖等成分，營養價值極高[2-4]。麥芽經過一定處理，會生成豐富的風味化合物。于淼等[5]采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-嗅聞-質譜聯用儀的方法，從六款麥芽中鑒定出41種風味化合物，包括20種醛類、7種吡嗪類、4種醇類、1種酚類、9種雜環化合物類。正基于上述優秀的品質，麥芽得到了學者的廣泛研究，也主要被應用在啤酒釀造行業。在啤酒釀造過程中，麥芽提供了主要的淀粉質原料，并且這些原料經過糖化等處理可以轉化為可發酵性糖，以供酵母生長并產生酒精[6-7]；同時，不同品種的麥芽會賦予啤酒不同的特性，使其口感及顏色也千差萬別[8]。

隨著生活水平的不斷提高，人們對醫療保健方面投入的時間與精力越來越多，對于心腦血管等疾病防范意識也越來越強，學者對于麥芽的研究也由對其應用價值的研究逐漸轉向對其保健價值的研究。SHOPSKA等[9]對不同類型麥芽的酚含量及抗氧化活性進行了比較研究，并表明麥芽提供了酒精發酵過程中酚類化合物總量的80%左右；LANDETE[10]的研究表明，麥芽中所富含的酚類化合物可以作為效果良好的抗氧化劑，能夠中和人體組織進行生命活動所產生的與疾病有關的活性氧，經常食用可以降低癌癥以及心腦血管疾病發生的概率。CéLINE等[11]研究發現，麥芽中所含有的原花青素及兒茶素是影響麥芽抗氧化活性最重要的兩種成分；GERH?U-SER等[12]表明，麥芽中所含有的羥基肉桂酸衍生物和少量黃烷醇，會對自由基的清除發揮一定的作用。綜上所述，麥芽具有良好的保健價值，而近年來，也有學者發現米酒曲具有抗肥胖或抗糖尿病的作用[13]，這表明米酒曲潛在利用價值極大。因此，利用麥芽與米酒曲發酵生產具有保健功能的新型發酵酒，將具有良好的市場前景。

鑒于國內外市場多用麥芽進行啤酒釀造及功能食品研究，而以萌發麥芽接種米酒曲生產發酵酒的研究鮮有報道，故試驗以萌發麥芽為原料生產純麥酒，在料液質量體積比（m/v）為1:3、溫度30 ℃的條件下，以酒精度為指標，探究發酵時間、酒曲接種量以及糖化酶添加量對純麥酒酒精含量的影響，并在單因素實驗基礎上，設計正交試驗進行優化，確定最佳釀造工藝，同時對產品進行了抗氧化能力測定，以便為純麥酒生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麥芽 山東淄博瑞源生物科技有限公司；純麥酒 廣西大學朗姆酒研發實驗室自釀；米酒曲 南寧一明生物科技有限公司；糖化酶（≥100 U/mg）上海瑞永生物科技有限公司；DNS試劑、Folin-Ciocalteu試劑 南寧恒因生物科技有限公司；考馬斯亮藍、沒食子酸、葡萄糖、碳酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司。

JJ-2組織搗碎機 常州迅生儀器有限公司；SHP-250生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；YP201N電子天平 上海菁華科技儀器有限公司；PL-303分析天平 METTLER TOLEDO有限公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；SN510C全自動高壓滅菌鍋 重慶雅瑪拓科技有限公司；電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司；酒精計 余姚儀表二廠有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 純麥酒的釀造工藝 精選麥芽→組織搗碎機粉碎→加水攪拌（料液質量體積比1:3）→高溫滅菌→攤涼至室溫→按質量比接種糖化酶→按質量比接種酒曲→30 ℃發酵→酒渣分離→澄清過濾→原酒→殺菌灌裝→成品

1.2.2 關鍵操作要點 a. 精選麥芽：挑選籽粒飽滿、色澤鮮亮、無長蟲發霉及損壞的優質萌發麥芽備用。

b. 組織搗碎機粉碎：采用JJ-2組織搗碎機進行原料粉碎，所得麥芽粉細膩均一，無明顯較大顆粒。

c. 加水攪拌：稱取75 g麥芽粉與225 mL蒸餾水攪拌均勻，此時料液質量體積比為1:3。

d. 高溫滅菌：設定滅菌溫度121 ℃、滅菌時間20 min進行滅菌。

e. 接種糖化酶：攤涼完成后，在無菌環境下按照質量比接種糖化酶，與原料攪拌均勻并糖化30 min，隨后接種酒曲。

f. 接種酒曲：在無菌環境下按照質量比接種酒曲，并攪拌均勻，隨后放入30 ℃生化培養箱進行發酵。

1.2.3 單因素發酵實驗 發酵時間：每瓶純麥酒接種2‰酒曲（質量比，m/m）、2%糖化酶（質量比，m/m），在30 ℃發酵溫度下，設置發酵時間條件分別為1、2、3、4、5 d，發酵結束后取出，進行酒精度的測定。

酒曲接種量：每瓶純麥酒接種2%糖化酶，發酵4 d，在30 ℃發酵溫度下，設置酒曲接種量條件分別為1‰、2‰、3‰、4‰、5‰，發酵結束后取出，進行酒精度的測定。

糖化酶添加量：每瓶純麥酒接種2‰酒曲，發酵4 d，在30 ℃發酵溫度下，設置糖化酶添加量條件分別為1%、2%、3%、4%、5%，發酵結束后取出，進行酒精度的測定。

1.2.4 純麥酒發酵工藝正交設計優化 在單因素實驗基礎上，以發酵時間（A）、酒曲接種量（B）、糖化酶添加量（C）為正交試驗的影響因素，每一個因素采用三個水平。鑒于酒精度是評價發酵酒質量最直觀的指標，且參考孫婷婷等[14]以麥芽為原料研究新型發酵酒的過程中主要測量了產品的酒精度，故以酒精度為評價標準，設計L9（34）正交試驗確定純麥酒的最佳發酵參數，正交試驗因素與水平見表1。

表1 純麥酒發酵條件正交優化試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of pure malt wine

1.2.5 理化性質測定

1.2.5.1 酒精度測定 采用蒸餾法測定發酵液酒精度（參考文獻[15-17]，有改動）。用量筒取100 mL純麥酒于1000 mL蒸餾燒瓶中，用100 mL去離子水沖洗量筒三次，洗液倒入蒸餾瓶中，再加入適量玻璃珠，連接冷凝裝置，以取樣用的原量筒作為接收器。開啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液接近100 mL刻度線，放入干燥的酒精計，不得接觸量筒壁，同時插入溫度計，平衡一定時間并進行水平觀測，讀取刻度值并記錄溫度。根據酒精濃度-溫度校正表將酒精計讀數和溫度，換算為20 ℃情況下酒精度。

1.2.5.2 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法測定發酵液總酚含量（參考文獻[18]，有改動）。以沒食子酸為標準品，準確吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L的沒食子酸標準液，分別加入5.0 mL去離子水，1.0 mL Folin-Ciocalteu試劑和3.0 mL碳酸鈉溶液（7.5 g/100 mL），定容到10 mL，搖勻靜置反應2 h顯色，在波長765 nm下測定吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.0106x+0.0145（R2=0.9961）。以樣品代替標準液進行測定，并計算相應含量。

1.2.5.3 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法測定發酵液蛋白質含量（參考文獻[19]，有改動）。以牛血清蛋白為標準品，制備100 μg/mL標準溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液于試管中，分別加去離子水補到1.0 mL，之后加入5.0 mL考馬斯亮藍試劑，搖勻靜置15 min，于波長595 nm下測定吸光值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.0064x+0.0151（R2=0.9969）。以樣品代替標準液進行測定，并計算相應含量。

1.2.5.4 總酸含量測定 采用酸堿滴定法進行發酵液總酸（以乙酸計）滴定（參考文獻[20]，有改動）。取1.0 mL樣品液加入去離子水定容至50 mL，以0.1 mol/L NaOH溶液進行滴定，滴定至溶液微紅色且30 s內不褪色，記錄消耗NaOH溶液體積，并按照下式進行計算：

式中：V為發酵液樣品滴定消耗的NaOH溶液體積，mL；CNaOH為NaOH標準溶液濃度，mol/L；60為乙酸的相對分子質量。

1.2.5.5 還原糖含量測定 采用DNS法測定發酵液還原糖含量（參考文獻[21]，有改動）。配制1.0 mg/mL葡萄糖標準溶液，依次吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準溶液于試管中，分別加去離子水補到2.0 mL，之后加入1.5 mL DNS試劑，置于沸水水浴5 min，取出后立即用冷水冷卻到室溫，并補足去離子水至25.0 mL，搖勻后在波長540 nm下測定吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.4873x-0.0137（R2=0.9959）。以樣品代替標準液進行測定，并計算相應含量。

1.2.5.6 羥基自由基清除能力的測定 對樣品進行了羥基自由基清除能力的測定，方法如下（參考文獻[22-27]，有改動）：配制9.0 mmol/L H2O2溶液、9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液及9.0 mmol/L水楊酸鈉溶液備用，取純麥酒酒樣及1.0 g/L VC各2.0 mL于試管中，加入9.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液及9.0 mmol/L水楊酸鈉溶液各2.0 mL，最后加入9.0 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，37 ℃水浴30 min，反應結束后于波長510 nm下測定吸光度（Ai）。以2.0 mL去離子水代替樣品與上述溶液混合，測定吸光度（Ax），以2.0 mL樣品與6.0 mL去離子水混合測定吸光度（Aj）。羥基自由基清除率計算公式如下：

1.2.5.7 總還原能力的測定 對樣品進行了總還原能力的測定，方法如下（參考文獻[28-31]，有改動）：配制0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.6）、0.2 mol/L鐵氰化鉀溶液、0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液及10 g/100 mL三氯乙酸溶液備用，取純麥酒酒樣及1.0 g/L VC各1.0 mL于試管中，依次加入2.5 mL磷酸緩沖液及2.5 mL鐵氰化鉀溶液，搖勻混合后于50 ℃恒溫水浴30 min后取出，流水冷卻后加入1.0 mL三氯乙酸溶液終止反應。3500 r/min離心5 min后取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL三氯化鐵溶液，搖勻，靜置5 min于700 nm波長下測定吸光度。以吸光度數值大小代表總還原能力強弱。

1.3 數據處理

標準曲線使用Excel進行繪制，所得試驗數據通過Origin 2017版繪圖軟件進行展示，正交試驗設計及方差分析通過Latin正交設計助手軟件進行設計及分析，單因素實驗結果使用SPSS Statistics 21.0軟件進行顯著性分析（基于LSD法與Waller-Duncan法），認為P＜0.05時差異顯著，試驗結果用均值±標準差（±sD，n=3）表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵時間對純麥酒酒精含量的影響 發酵時間是影響酒精發酵過程的重要因素。由圖1可知，純麥酒的酒精度隨著發酵時間的增長先增加后下降。發酵時間為1 d時，所測酒精度較低，僅為2.7%vol左右，這是由于發酵剛剛開始，微生物進行生長并未大量產生酒精引起的。發酵時間為1～2 d時，酒精含量大幅上升；在2～4 d時，純麥酒的酒精度變化接近于平緩，且最高的酒精度出現在4 d，可達到9.4%vol。在發酵時間4～5 d時，酒精度略微降低，這可能是由于發酵后期營養物質及微生物數量均減少，導致酒精含量略微下降。因此，選擇發酵時間為4 d。

圖1 發酵時間對純麥酒酒精含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol content of pure malt wine

2.1.2 酒曲接種量對純麥酒酒精含量的影響 純麥酒在發酵過程中，酒曲的添加量會影響菌種的倍增時間，進而影響發酵進程。由圖2可知，純麥酒的酒精度隨著酒曲接種量的增加先上升后降低。酒曲接種量為1 ‰～2 ‰時，酒精度略微上升，由9.2%vol上升到9.5%vol。在接種量為2 ‰～4 ‰時酒精度略微降低，由9.5%vol降低到9.1%vol，這可能是由于微生物數量上升，而發酵液營養有限，故導致酒精度下降。因此，選擇酒曲接種量為2‰。

圖2 酒曲接種量對純麥酒酒精含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of koji on alcohol content of pure malt wine

2.1.3 糖化酶添加量對純麥酒酒精含量的影響 糖化酶的添加，可以促進發酵液大分子糖類物質轉化為小分子可利用糖，減少了糖化時間，加快了發酵過程。由圖3可知，純麥酒的酒精度隨著糖化酶添加量的增加先增大后減小。糖化酶添加量為1%～2%時，酒精度上升，并在添加量為2%時達到最大值9.5%vol。在超過2%添加量后，酒精度出現下降，這可能是由于過量的糖化酶導致可利用糖短時間內大量產生，微生物大量繁殖而使得營養物質含量降低過快，從而一定程度影響了酒精發酵。因此，選擇糖化酶添加量為2%。

圖3 糖化酶添加量對純麥酒酒精含量的影響Fig.3 Effect of glucoamylase addition on alcohol content of pure malt wine

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗基礎上進行L9（34）正交試驗優化純麥酒的發酵條件，考察發酵時間（A）、酒曲接種量（B）、糖化酶添加量（C）對純麥酒酒精度的影響，正交試驗結果如表2所示，方差分析表如表3所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

由表2的極差分析可知，各因素對純麥酒酒精度的影響次序為發酵時間（A）＞糖化酶添加量（C）＞酒曲接種量（B）。根據平均值K得出最佳發酵條件組合為A2B2C2，即：發酵時間4 d，酒曲接種量2‰，糖化酶添加量2%。對組合進行實際驗證，并進行三次重復試驗，所得優化組合酒精度可達10.6%vol±0.3%vol，因此在料液質量體積比為1:3、溫度30 ℃的情況下，純麥酒最佳發酵組合為發酵時間4 d，酒曲接種量2‰，糖化酶添加量2%。

由表3的方差分析表可知，在以酒曲接種量（B）為誤差所在列的情況下，所得因素A的F值為27.897，因素C的F值為20.759，兩者的F值均大于F臨界值（19.000），且在顯著水平a=0.05的情況下，因素A與因素C達到了顯著水平，故可得出結論：在已選定的條件下，發酵時間與糖化酶用量兩個因素對于純麥酒的酒精度影響顯著（P＜0.05），而酒曲接種量對純麥酒酒精度的影響并不顯著（P＞0.05）。

2.3 純麥酒理化性質測定

對實驗所得最佳發酵組合A2B2C2進行部分理化性質測定，并與優化前進行對比，所得數據如表4所示，同時對最佳發酵組合A2B2C2進行了羥基自由基與總還原能力的測定，所得數據如圖4與圖5所示。

表4 純麥酒理化性質測定對比Table 4 Comparison of physical and chemical properties of pure malt wine

圖4 兩種樣品羥基自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate of two samples

圖5 兩種樣品總還原能力Fig.5 Total reduction capacity of two samples

由表4可知，經過優化，純麥酒的總酚含量、蛋白質含量及酒精度出現了上升，而總酸含量及還原糖含量出現了下降?？偡雍坑蓛灮暗?.004±0.034 g/L增長為1.159±0.066 g/L，是優化前的1.154倍；蛋白質含量由優化前的191.182±12.623 mg/L增長為209.568±19.178 mg/L，是優化前的1.096倍；酒精度由優化前的6.7%vol±0.2%vol增長為10.6%vol±0.3%vol，是優化前的1.582倍，增長較為顯著。相比之下，總酸含量由優化前的8.6±0.3 g/L降為優化后的6.4±0.2 g/L，降幅較??；還原糖含量由優化前的16.215±0.083 g/L降為8.409±0.021 g/L，下降明顯，這與酒精度上升的結果是相一致的。

羥基自由基對人體具有極大的危害性，若大量聚集在心血管周圍，會導致動脈硬化、高血壓等心腦血管疾病的發生[32]。由圖4可知，優化后的純麥酒對羥基自由基的清除率可達86.75%±1.42%，相比于VC的37.74%±0.42%，高出了49.01%左右，這表明純麥酒對于羥基自由基具有良好的清除能力。王曉靜[33]在研究紅果參黃酮與VC的協同抗氧化活性的過程中，證明VC與黃酮類化合物均為抗氧化物質，但兩者結構并不相同，導致對包括羥基自由基在內的多種自由基清除能力不同。在本試驗中，由于純麥酒總酚含量較高，推測是由酚類物質與羥基自由基發生了反應，降低了羥基自由基的活性。

當一種物質具有較強的還原能力時，可以使反應體系中普魯士藍含量增加，并在700 nm波長處產生最大吸光值[34]。由圖5可知，VC的總還原能力可達2.097±0.006，而優化后的純麥酒的總還原能力可達1.842±0.004，略低于VC，但也表現出良好的總還原能力，具有良好的抗氧化效果。謝國芳等[35]對金刺梨果實和葉中酚類、VC含量及其抗氧化能力進行了分析，并表明總還原能力與果實中酚類及酸類物質含量呈正相關。在本試驗中，純麥酒總酚含量達到1.159±0.066 g/L，總酸含量達到6.4±0.2 g/L，推測是酚類物質及酸類物質賦予了純麥酒較強的還原能力。綜合以上數據，可以證明純麥酒具有良好的抗氧化活性。

3 結論

本試驗采用單因素實驗及正交設計方法對純麥酒發酵工藝進行了優化，并對優化前后的純麥酒進行了理化性質測定及對比。試驗結果表明，在30 ℃發酵溫度、料液質量體積比為1:3的情況下，最佳發酵條件組合為：發酵時間為4 d、酒曲接種量為2‰、糖化酶添加量為2%。通過正交試驗方差分析，得出發酵時間與糖化酶添加量兩個因素對于純麥酒的酒精度影響顯著（P＜0.05），而接種量對純麥酒酒精度的影響并不顯著（P＞0.05）。對優化后的純麥酒進行部分理化性質的測定，測得總酚含量為1.159±0.066 g/L，蛋白質含量為209.568±19.178 mg/L，總酸含量為6.4±0.2 g/L，還原糖含量為8.409±0.021 g/L，所得純麥酒酒精度為10.6%vol±0.3%vol，是優化前的1.582倍。同時對純麥酒進行羥基自由基與總還原能力的測定，發現純麥酒對羥基自由基的清除率可達86.75%±1.42%，總還原能力可達1.842±0.004，這表明純麥酒展現出良好的抗氧化活性。試驗結果為麥芽進一步開發利用提供理論依據，為純麥酒作為新品種開拓市場提供參考。