柑橘采后病原菌意大利青霉PacC基因的克隆及表達分析

馮 越，張美紅，李笑影，李倩如，彭麗桃

（華中農業大學食品科技學院，湖北武漢 430070）

由意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的青綠霉病害，通常造成柑橘采后總損失的90%[1]。意大利青霉較耐低溫[2]，因此在低溫貯藏期間更易發病，由意大利青霉引發的青霉病害在全世界可造成柑橘采后損失的10%～30%[3-4]。化學殺菌劑是預防和控制采后柑橘病害的常用方法[5]，近年來，隨著人們對化學農藥的日益關注，以及大量使用化學農藥會導致病原菌的抗藥性顯著增強[6]，引發食品安全和環境污染的風險，生產上需要安全有效的替代病害控制方法[7]。深入研究意大利青霉與柑橘果實在采后貯藏期間的相互作用對于防治青霉病具有重要意義[8]。

研究表明，環境pH會影響真菌的生長發育和代謝功能[9]。為了適應各種復雜嚴酷的生長環境，真菌存在一套響應和適應環境pH變化的機制[10-11]。目前已經對構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、白色念珠菌（Candida albicans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的pH響應機制進行了充分研究，此機制命名為PAL/RIM[12]。PAL/RIM已被確定由6個Pal蛋白PalA、PalB、PalC、PalF、PalH、PalI及關鍵轉錄因子PacC構成[13]。真菌在感受環境pH后，PAL/RIM通過信號傳導，激活關鍵轉錄因子PacC，從而對環境pH做出響應[14]。

PacC被廣泛報道在許多病原菌中起著正向調節作用。在核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和指狀青霉中[15]，PacC缺失可以延緩病原菌的生長、降低病原菌的致病力以及減少次生代謝產物合成。在赭曲霉（Aspergillus ochraceus）中，PacC缺失對其生長、分生孢子形成和萌發、菌絲形態會產生影響[9]。PacC也被報道在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[16]和禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）[17]致病力中起著負調節作用。表明PacC有一個復雜的調控網絡來控制不同真菌病原體的致病力。關于PacC在意大利青霉中的具體功能未見報道。本試驗克隆意大利青霉PacC基因，觀察了PacC在酸堿處理、葡萄糖饑餓及回補、極限碳濃度誘導等條件下和致病過程中的表達規律，并研究了意大利青霉致病力與環境pH的關系，為進一步研究該基因在意大利青霉與柑橘果實互作中的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

意大利青霉（Penicillium italicum）菌株P-5 從自然發病柑橘果實上分離，接種表現出典型的青霉病癥狀，經進一步鑒定后，PDA培養基中保存；PDA、PDB、LB培養基 實驗室自制；臍橙、冰糖橙、皇帝柑等橙子 均購于湖北省武漢市洪山區華中農業大學農貿市場；膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、真菌RNA抽提試劑盒 上海生工有限公司；熒光定量PCR試劑盒、DNA Marker、Ex Taq聚合酶、T4連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；HiScript? II Q RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）反轉錄試劑盒南京諾唯贊生物科技有限公司。

qTOWER2.2實時定量PCR儀 德國耶拿分析儀器股份有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國伯樂Bio-Rad公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩箱 金壇市宏華儀器廠；YXQ-LS-18SI手提式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1PacC基因的克隆 從GenBank上分別下載Penicillium digitatum（GenBank登錄號：XP0145 37353.1）、Penicillium chrysogenum（GenBank登錄號：NW003020078.1）、Aspergillus niger（GenBank登錄號：AAA32690.1）和Penicillium decumbens（GenBank登錄號：AGY46356.1）的PacC同源序列，并用DNAMAN軟件進行多序列比對，獲得PacC基因及其上、下游序列，將其分為A、B、C、D四段，每段之間設有重疊區域以確保結果可信度，使用Primer Preimer5軟件設計引物，見表1。

用真菌RNA抽提試劑盒提取意大利青霉的RNA，以提取的RNA為模板用HiScript? II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA，操作均參照試劑盒說明書，以合成的cDNA為模板，PacC-U-F/PacC-U-R、PacC-1-F/PacC-1-R、PacC-2-F/PacC-2-R、PacC-D-F/PacC-D-R（表1）為引物對A、B、C、D四個片段進行PCR擴增，并進行電泳檢測。PCR擴增反應體系為：Ex Taq聚合酶0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μL，10×PCR Buffer 2 μL，10 μmoL/L上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水補足體積至10 μL。反應程序為：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 60 s/kb, 30個循環；保溫72 ℃10 min。將擴增得到的四個片段進行純化回收，送至上海生工生物技術公司進行測序。將測序結果使用軟件Seqman進行拼接，得到意大利青霉的PacC基因及其上下游序列。

表1 PCR擴增所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification

1.2.2PacC基因的生物信息學分析 對PacC基因上游序列進行啟動子區域和順式調控元件預測（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html;http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。利用MEGA7.0軟件進行PacC蛋白的系統進化樹構建，并對其相關結構域進行預測（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）。

1.2.3PacC基因的定量表達分析

1.2.3.1 菌齡對意大利青霉生長過程中PacC基因表達的影響 參考范明等[18]的方法，取在PDA培養基上的意大利青霉孢子，制備1×106CFU/mL孢子菌懸液，并涂布于含玻璃紙的PDA培養基上，于26 ℃培養，分別取培養2、4、6、8、10和12 d的菌絲，液氮速凍后-80 ℃備用。

1.2.3.2 酸堿處理對意大利青霉生長和PacC基因表達的影響 參考Yang等[19]的方法，略有修改。取200 μL孢子懸液均勻涂布于25 mL PDA培養基中，待長出白色的幼嫩的菌絲后，用1 cm的打孔器打取菌餅，反貼于含20 mL不同pH的PDA培養基的培養皿中，5 d后觀察并通過十字交叉法測量菌落直徑。

參考范明等[18]的方法，將孢子懸液于PDB培養基中，于26 ℃恒溫搖床中120 r/min培養2 d，過濾收集菌絲。稱取1.60 g濕菌絲，移至不同pH的PDB培養基中繼續培養24 h。以pH6的PDB培養的菌絲作空白對照，收集菌絲，液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.2.3.3 葡萄糖饑餓和回補對意大利青霉PacC基因表達的影響 按照1.2.3.2的方法培養并收集菌絲，參考范明等[18]的方法，取8.00 g濕菌絲于500 mL錐形瓶中，加入300 mL 50 mmol/L KCl溶液，4 ℃饑餓24 h，收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存備用。取饑餓24 h的菌絲過濾并沖洗，取1.00 g濕菌絲重懸于20 mL 10%（w/v）葡萄糖溶液中進行回補，收集菌絲液氮速凍后-80 ℃保存備用。

1.2.3.4 蔗糖濃度對意大利青霉生長過程中的pH和PacC基因表達的影響 按照1.2.3.2的方法培養并收集菌絲，取2.00 g濕菌絲，分別置于蔗糖濃度為5、15、25、50、100、175 mmol/L的培養基中，繼續在搖床振蕩培養，每隔24 h吸取培養基上清液測量其pH。用于RNA提取的樣品，液氮速凍后-80 ℃備用。

以意大利青霉肌動蛋白基因（β-Actin）作為內參基因，檢測在不同條件下PacC基因在轉錄水平上的相對表達量。收集各時間段的菌絲，提取總RNA，反轉錄后通過qRT-PCR檢測PacC的表達水平。qRTPCR反應體系為：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，不同樣本的cDNA 1 μL，上下游引物（β-Actin引物：Actin-F/R；PacC引物：Q-PacC-F/R，見表1）10 μmoL/L 1 μL，雙蒸水補足體積至10 μL。反應程序為：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，延伸60 ℃30 s，40個循環收集熒光信號。每個樣品三次重復，采用2-ΔΔCt公式進行計算相關基因表達量。

1.2.4 環境pH與意大利青霉致病力的關系及侵染過程中PacC的表達分析

1.2.4.1 意大利青霉對不同柑橘品種果皮pH的影響新鮮橙子在體積分數0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，蒸餾水沖洗2次晾干。用針刺在果實表面扎出深度為0.2 cm左右的孔。接種10 μL 106CFU/mL孢懸于傷口處，26 ℃放置。每隔24 h拿出3個品種的果實，無菌刀片取樣，無菌研磨機研磨，12000×g離心5 min，吸取上清液，測果皮的pH。

1.2.4.2 環境pH對意大利青霉致病力的影響 配制不同pH的溶液，然后接種青霉至不同pH的溶液之中，配成1×106CFU/mL的孢懸。按上述條件處理臍橙并接種，以無菌水做對照，每天觀察，并隔24 h補加一次之前加的菌液。

1.2.4.3 侵染過程中PacC的定量表達分析 按照王萌等[8]的方法，新鮮橙子在0.1%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，并用蒸餾水沖洗。在果實腰部造傷，深度約3 mm。將意大利青霉菌絲餅反貼至果實傷口處，然后放置于26 ℃下，分別于5、8、11、14、17、20 d收集病部組織，并抽提RNA，反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，利用意大利青霉β-Actin和PacC引物進行半定量PCR，循環數設置為26，確保擴增處于對數期（β-Actin引物：Actin-F/R；PacC引物：QPacC-F/R，見表1）。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 10 s；72 ℃ 5 min。對不同樣品cDNA分別擴增β-Actin和PacC，PCR擴增產物在含有溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，并進行拍照。

1.3 數據處理

用Excel軟件進行數據處理和作圖，所有數據均為3次重復所得，分析采用SPSS 23軟件對試驗數據進行單因素方差分析，應用最小顯著差數（LSD）法檢驗差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 PacC基因的克隆及生物信息學分析

利用引物對以意大利青霉cDNA為模板，將PacC及側翼序列分成A、B、C、D四個片段進行擴增，片段之間有重疊區域，擴增后經電泳進行驗證，將目的條帶割膠回收并克隆測序（圖1）。將測序結果用軟件Seqman進行拼接，得到PacC基因完整序列及其上下游部分序列信息。

圖1 意大利青霉PacC序列的擴增Fig.1 Amplification of P. italicum PacC

意大利青霉基因組中只有單一的PacC基因，PacC基因序列和cDNA開放閱讀框（open reading frame，ORF）的大小為1921 bp，且編碼蛋白質的氨基酸數量為636個。如圖2所示，預測PacC含有3個保守的Cys2His2鋅指蛋白結構域，在87～305氨基酸之間有1個富含脯氨酸（PPPPPPP）的區域，2個PacC典型的YPXL基序，3個高度保守的區域，在192～400氨基酸之間有一個TFIIA轉錄因子的區域，它可以結合到啟動子區域，是基因表達所必需的通用轉錄起始因子。

圖2 PacC蛋白結構域Fig.2 Protein domain of PacC

根據測序獲得的PacC基因序列，發現PacC上游序列片段大小為1201 bp，然后使用BDGP網址在線預測PacC基因的核心啟動子，預測結果顯示該啟動子可能位于PacC基因上游101～801 bp，并在基因上游序列可能含有3個PacC的DNA結合位點5′-GCCARG-3′，表明PacC在不同條件通過積極調控自身的表達來適應各種環境條件。同時，對部分順式調控元件進行分析，發現在該基因上游序列中，存在核心啟動子元件TATA-box、增強子元件CAATbox，從而增強基因轉錄的效率（圖3）。

圖3 PacC基因生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis of PacC

將PacC序列進行蛋白比對，對比結果發現，意大利青霉PacC與指狀青霉（Penicillium digitatum）和產黃青霉（Penicillium chrysogenum）的PacC的同源性較高，其相似度達到87.1%以上。采用鄰接法構建系統進化樹，發現意大利青霉PacC與指狀青霉和產黃青霉親緣關系近，與白色念珠菌、尖孢鐮刀菌親緣關系遠（圖4）。

圖4 意大利青霉與其他物種PacC的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PacC from P.italicum and other species

2.2 PacC定量表達分析

2.2.1 生長過程中PacC基因的表達分析 對培養不同時間的意大利青霉PacC表達量進行了分析表明，PacC在意大利青霉生長前期（2和4 d）、中期（6和8 d）、后期（10和12 d）表達量變化較為平緩且維持在較高表達水平（1.0左右）。推測在意大利青霉生長過程中，PacC維持意大利青霉生長所需的pH，從而維持意大利青霉生長所需的酸堿平衡（圖5）。

圖5 PacC在意大利青霉生長中的表達分析Fig.5 Quantitative expression analysis of PacC during growth of P. italicum

2.2.2 不同條件下PacC基因的表達分析

2.2.2.1 酸堿處理對PacC基因表達的影響 在菌絲生長過程中，對照組（pH6）的菌餅直徑均高于其他pH條件下的菌餅直徑，且弱堿條件（pH8）對意大利青霉菌絲生長的抑制高于弱酸條件（pH4），表明環境pH對意大利青霉菌絲生長有顯著影響（P＜0.05），堿性條件更能顯著抑制意大利青霉的生長（圖6A～圖6B，P＜0.05）。進一步對環境pH調控因子PacC基因的表達進行分析，發現PacC基因表達量在酸性條件下顯著下調（P＜0.05），在堿性條件下顯著增加（P＜0.05），表明PacC的表達依賴于環境pH，且PacC是一個堿性誘導基因（圖6C）。

圖6 不同pH對意大利青霉生長及PacC基因表達的影響Fig.6 Effect of different pH value on growth of P. italicum and expression of PacC gene

2.2.2.2 葡萄糖饑餓和回補對PacC基因表達的影響研究表明，糖代謝信號傳導途徑可能影響PacC表達。Louw等[20]研究發現由于成熟度不同的果實中糖的種類和含量不同，病原菌對成熟度不同的果實侵染時感染部位pH有所差異，從而通過分泌小分子調節環境pH，這導致致病因子PacC上調。將意大利青霉菌絲進行葡萄糖饑餓及回補處理發現，葡萄糖回補會使PacC基因的表達量顯著上調（P＜0.05），且在回補30 min時PacC基因量上調為2.46，達到峰值，這表明碳源（葡萄糖）通過分泌小分子會誘導意大利青霉PacC的表達（圖7）。

圖7 PacC在葡萄糖饑餓和回補中的定量表達分析Fig.7 Quantitative expression analysis of PacC in glucoses starvation and supplementation

2.2.2.3 蔗糖濃度對意大利青霉生長過程中的pH及PacC表達的影響 為了進一步明確碳源對PacC表達的影響，以蔗糖（水果中的主要糖）為主要碳源，分析蔗糖濃度對意大利青霉生長過程中的pH調節模式的影響，結果發現（圖8A）：在不同蔗糖濃度下，意大利青霉調節pH的模式不同。低蔗糖濃度下，意大利青霉引起pH上升；高蔗糖濃度下，意大利青霉導致培養環境酸化，如在5 mmol/L蔗糖條件下培養96 h后，培養基pH上升到7.89；而在175 mmol/L蔗糖條件下，培養基pH下降為3.88。進而分析兩種極端碳濃度下意大利青霉培養不同時間PacC基因的表達，結果顯示（圖8B）：在5 mmol/L蔗糖下，隨培養時間延長和培養基逐步堿化，PacC的相對表達顯著提高了87.2倍（P＜0.05）；在175 mmol/L蔗糖下，意大利青霉PacC的表達誘導作用較小。

圖8 蔗糖濃度對意大利青霉生長過程中的pH及PacC表達的影響Fig.8 Effects of sucrose levels on pH and expression of PacC during the growth of P.italicum

2.3 環境pH與意大利青霉致病力的關系及侵染過程中PacC的表達分析

不同品種的柑橘果實，接種處果皮pH均呈下降趨勢，但果實發病部位pH的變化因品種不同有所差異，皇帝柑的pH下降最快，冰糖橙的pH下降偏慢（圖9A）。這表明，意大利青霉侵染促使柑橘果皮pH下降。將不同pH下的意大利青霉孢子懸液接種臍橙，10 d后發現強酸強堿環境下（pH2和pH10）意大利青霉的致病力明顯弱于其他pH環境。pH6時意大利青霉的致病力最強且明顯高于在弱酸弱堿環境中（pH4和pH8）的致病力（圖9B）。Pe?alva等[21]研究發現病原菌在侵染宿主時會改變環境pH，從而激活pH轉錄因子PacC，以增強其致病力。從以上結果發現，環境pH與意大利青霉致病力會相互影響，故猜測可能與PacC有關。所以實驗進一步觀察侵染初期到侵染后期PacC的表達量，發現PacC基因的表達較為穩定（圖9C～圖9D）。

圖9 pH與意大利青霉致病力的關系及在侵染過程中PacC表達Fig.9 Relationship between pH and pathogenicity of P.italicum and expression of PacC during infection

3 討論與結論

在田間收獲、包裝或運輸過程中，意大利青霉會通過果皮傷口侵染果實，從而產生病害[22]。在侵染過程中，面對復雜多變的環境pH變化，微生物必須迅速應對并及時調節以進行最適生長。目前在許多病原菌中存在一套響應和適應環境pH變化的機制，這個機制通常由PAL/RIM全局調控。PAL/RIM機制中的關鍵轉錄因子PacC在病原菌生長發育和致病力中有重要作用。

本試驗成功克隆到意大利青霉PacC基因，并對其生物信息學特性進行了初步分析。PacC基因含有3個保守的Cys2His2鋅指蛋白結構域，與指狀青霉、構巢曲霉、釀酒酵母有相同的結構域[12]。表明意大利青霉的PacC具有高度保守性和特異性，且與其他真菌中的PacC發揮著同樣功能。研究表明PacC通過直接結合特定的DNA序列（5'-GCCARG-3'）來調控基因表達[23]。在釀酒酵母中，PacC通過與自身啟動子區域結合進行自我抑制調控[24]。在意大利青霉PacC基因上游序列發現3個PacC的結合位點，進一步表明這種自我抑制調控的可能性。

研究表明，PacC作為環境pH的調節因子，對微生物的生命活動起到關鍵作用，在細胞壁生物合成、穩態、氧化還原過程、水解酶活性、跨膜轉運和與真菌毒力相關的基因調控中具有直接調控功能[25]。PacC缺失會導致靈芝[26]、粉色面包菌（Neurospora crassa）[27]、赭曲霉和球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的生長速率變慢。本試驗研究也發現PacC在意大利青霉菌絲生長的整個過程中維持較高表達水平，表明PacC在意大利青霉生長過程中發揮著重要作用。在外界環境pH下，不同基因在維持細胞外環境pH穩定的過程中發揮著不同作用[18]。Luo等[28]研究表明PacC缺失會導致球孢白僵菌在堿性條件下生長速率變慢。Chen等[15]對擴展青霉（Penicillium expansum）的研究中也有同樣發現。本試驗也發現堿性條件對意大利青霉生長的抑制高于酸性條件，表明PacC在堿性條件下發揮著重要調控作用。研究表明，在趾間毛癬菌（Trichophyton interdigitale）中，PacC表達與環境pH相關，即酸性pH抑制PacC表達，堿性pH誘導PacC表達[14]。本研究也發現意大利青霉PacC在堿性條件下表達量顯著上調，表明PacC是一個堿性誘導基因。

研究發現，病原菌可以通過碳濃度來調節致病菌分泌的小分子改變環境pH，從而導致PacC表達量發生變化[29]。本試驗研究發現意大利青霉經過葡萄糖回補處理，導致PacC基因表達量上調，推測碳源可能誘導了PacC表達。進一步以蔗糖為主要碳源，發現意大利青霉對碳濃度的響應有所差異，即在低碳濃度（5 mmol/L）下使培養基堿化，高碳濃度（175 mmol/L）下使培養基酸化。分析極限碳濃度下PacC表達，發現低碳濃度會誘導PacC的表達提高，這個結果與Bi等[29]觀察到低碳濃度誘導擴展青霉PacC表達提高62.1倍的結果一致，表明PacC的表達與碳濃度有關。

病原菌與寄主互作過程中環境pH是影響病原菌致病力的重要因素，這主要是環境pH調控因子PacC發揮作用。目前已發現PacC影響一些病原菌的致病力。汪漢成等[30]研究發現環境pH會嚴重影響煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的致病力。本試驗對意大利青霉和環境pH的關系進行研究，發現環境pH對意大利青霉的致病力有著重要影響，且不同品種柑橘接種意大利青霉后會導致果皮pH下降。進一步觀察了環境pH調控基因PacC在意大利青霉侵染柑橘過程中的表達，發現PacC基因表達較為穩定，表明PacC可能與意大利青霉致病性相關。

綜上所述，PacC對不同pH和碳源條件下意大利青霉的生長和致病力發揮重要調控作用，進一步分析侵染過程中相關碳代謝重點基因與酸堿代謝的重點基因，有助于深入認識PacC在意大利青霉致病過程中所起的作用。