超聲波輔助酶解花生蛋白制備α-淀粉酶抑制肽工藝優化

唐金鑫，由高飛，李秋陽，徐 萍，劉士偉，于 雷，畢云楓

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118）

花生粕是飼料、肥料和釀造的原料，是花生油提取后的副產品[1]。花生粕的蛋白質含量約為40%～50%，包含8種必需氨基酸，但花生蛋白質中的賴氨酸和蛋氨酸含量相對不足。與大豆蛋白相比，花生粕蛋白更易于吸收且抗營養因子較低[2]。花生粕蛋白的酶促水解不僅可以充分利用花生粕中的蛋白質，而且還可以產生具有生物活性的小肽，解決了花生蛋白必需氨基酸不足的缺陷。已有研究描述了食物來源的短鏈生物活性肽，其殘基范圍為2～20個氨基酸[3]。 除了基本營養外，還具有類似激素的生理功能[4]。這些肽可能具有多種藥理或生理作用，包括抗氧化劑、抗糖尿病藥和降低血壓[5-7]，具體取決于氨基酸的組成及其序列。Liu等[8]從花生蛋白分離物中分離出一種血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，其氨基酸序列為Cys-Val-Thr-Pro-Ala-Leu-Arg。Ye和Ng[9]從花生中分離出一種新型的抗真菌肽，其序列與花生過敏原Ara H1相似。在人腸中對氨基酸的吸收很差，但是分子量小于1000 Da的寡肽很容易被吸收[10]。

食物來源的生物活性肽在藥理活性方面被廣泛研究[11-13]。 具有特定氨基酸序列的肽在減少和維持飲食相關疾病（例如糖尿病（diabetes，DM））的發作方面具有特別重要的意義[14]。DM是一種復雜的代謝綜合癥，由生產減少、生物利用度不足和胰島素對血漿葡萄糖水平升高的敏感性差引起。在復雜的碳水化合物進一步轉化成更簡單的形式（葡萄糖）并吸收到血液系統之前，α-淀粉酶起著引發化學分解的基本作用。研究表明，在飲食混合碳水化合物后，抑制α-淀粉酶可以大大降低餐后血糖水平的升高[15]。因此為控制II型糖尿病，具有α-淀粉酶抑制潛能的功能性食品和營養保健品得到了廣泛認可。本研究將花生粕提取蛋白進行酶解，以α-淀粉酶抑制率和多肽得率為評價指標，篩選出最佳蛋白酶，通過酶解條件優化實驗獲得最佳酶解工藝條件，獲得α-淀粉酶抑制肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生粕 青島長壽食品有限公司；風味蛋白酶（1.5萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、胰蛋白酶（250萬U/g） 北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/g）、木瓜蛋白酶（≥100萬U/g）、α-淀粉酶上海源葉生物科技有限公司；牛血清蛋白 長春德爾塔生物技術有限公司。

LG0.2真空冷凍干燥機 沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司；HC-3018高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；SPD-20A UVmini-1240紫外可見分光光度計 日本島津公司；

1.2 實驗方法

1.2.1 花生蛋白制備 將花生粕以10:1 mL/g液料比與蒸餾水混合，以1 mol/L NaOH溶液將pH調至8.0，常溫磁力攪拌1 h后5000 r/min離心15 min，離心后取上層清液以1 mol/L HCL溶液調節pH至4.5，4000 r/min離心10 min后取下層沉淀，加適量蒸餾水用1 mol/L NaOH溶液調至中性使其充分溶解，將溶解后的蛋白液用透析袋透析24 h后冷凍干燥備用[16]。

1.2.2 花生多肽制備 稱取花生蛋白加入蒸餾水，按液料比為20:1 mL/g配制成溶液，進行超聲波預處理，超聲波預處理條件為超聲功率150 W，超聲溫度35 ℃，超聲時間20 min。預處理結束后調節溫度和pH至各蛋白酶最適條件（見表1），蛋白酶添加量為4000 U/g，酶解3 h。酶解后沸水浴滅酶10 min，冰水浴冷卻，以10000 r/min,離心20 min，收集上清液測其多肽得率及α-淀粉酶抑制率后冷凍干燥備用[17]。

表1 不同蛋白酶最適反應條件Table 1 Optimal reaction conditions for different enzymes

1.2.3 花生蛋白酶解工藝優化

1.2.3.1 蛋白酶的篩選 為了篩選出酶解花生蛋白的最優蛋白酶種類，對比了5種蛋白酶對花生蛋白的酶解效果，在表1中所列的各蛋白酶的最適條件下，以花生蛋白液料比20:1mL/g，超聲功率150 W，超聲時間30 min，酶添加量5000 U/g，酶解3 h。以α-淀粉酶抑制率和多肽得率為指標，篩選出最優蛋白酶，進行下一步試驗。

1.2.3.2 單因素實驗 準確稱取一定量的花生蛋白，以1.2.2的酶解工藝，設計花生蛋白液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1）、超聲功率（50、100、150、200、250 W）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、酶添加量（2000、3000、4000、5000、6000 U/g）、酶解時間（1、2、3、4、5 h）的五個因素實驗，研究五個因素對制備α-淀粉酶抑制肽的影響，進而確定因素以及水平范圍內響應面試驗的設計。

1.2.3.3 響應面試驗 在單因素實驗結果的基礎上，以α-淀粉酶抑制率為主要指標，采用單因素實驗結果中對花生粕蛋白酶解效果影響較大的三個因素進行響應面試驗。采用Design-Expert.V8.0.6統計軟件，設計三因素三水平二次回歸方程，擬合各因素和α-淀粉酶抑制率的函數關系。試驗因素水平見表2。

表2 酶解工藝響應面水平與因素設計Table 2 Response surface level and factor design table of enzymatic hydrolysis process

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 花生蛋白含量測定 利用凱氏定氮法測定花生粕蛋白含量，方法參考國標GB 5009.5-2016《食品安全國家標準—食品中蛋白質的測定》。

1.2.4.2α-淀粉酶活性抑制率的測定 在0.5 mL PBS溶液中加入0.25 mL酶解溶液和等體積的1.5 U/mLα-淀粉酶溶液，于37 ℃加熱10 min后，再加入0.5 mL 1%可溶性淀粉溶液，取0.25 mL酶解溶液和等體積的1.5 U/mLα-淀粉酶溶液，加入到0.5 mL PBS溶液中于37 ℃加熱10 min后，再加入0.5 mL 1%可溶性淀粉溶液，充分混勻，反應5 min后加入1 mL DNS終止反應，沸水浴10 min冷卻至室溫后加入5 mL水，于540 nm測定吸光度OD值[18-22]。

式中：ODA為空白管；ODB為空白對照管；ODB為抑制管；ODD為抑制對照管。

1.2.4.3 多肽得率測定 采用雙縮脲法繪制牛血清蛋白標準曲線[23-24]。將牛血清蛋白配制成10 mg/mL的標準蛋白溶液，分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加蒸餾水補至1 mL，再加入4 mL雙縮脲試劑，混勻均勻后靜置30 min，于540 nm處分別測其OD值。以標準蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線為y=0.04136x+0.05146，R2=0.9997。

多肽液樣品含量測定：取1 mL樣品溶液加入等體積的10%（W/V）的三氯乙酸混合均勻后，靜止10 min，于4000 r/min離心20 min，取上清液1 mL，并加入4 mL雙縮脲試劑，混合后室溫靜置30 min，測定540 nm處吸光度。

式中：W表示多肽得率，%；c表示根據吸光度值計算出的溶液質量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數；V表示溶液體積，mL；m表示花生蛋白取樣量，mg。

1.2.5 超濾分離 花生蛋白酶解液經水相0.45 μm微孔濾膜過濾，選擇截取分子量分別為10、5、3 kDa的超濾膜對酶解液進行分級分離,將所得多肽組分分別收集后迅速冷凍干燥，-20 ℃保存備用。

1.2.6 Sephadex G-15凝膠分離純化 方法根據江明珠、陳佳欣等人的修改稍作調改[25-26]。將處理好的Sephadex G-15裝入1.6 cm×100 cm的玻璃層析柱中。選取無菌水進行洗脫試驗，上樣濃度為10 mg/mL，上樣量為2 mL，洗脫流速為0.8 mL/min，用紫外檢測儀在220 nm處進行檢測，收集器每4 min一管，將收集的各個洗脫峰冷凍干燥得到花生多肽，測定各組分ɑ-淀粉酶抑制率。

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次平行實驗，數據采用平均值±標準差的形式，采用Orign 8.5、Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶篩選結果

由圖1可知，五種蛋白酶的多肽得率都超過了30%，對α-淀粉酶也有一定的抑制效果，說明五種酶對花生多肽都有一定得酶解效果，其中風味蛋白酶無論是在α-淀粉酶抑制率還是多肽得率，都表現出不錯的結果。堿性蛋白酶和中性蛋白酶的多肽得率也表現出不錯的效果，但其α-淀粉酶抑制率低于風味蛋白酶，考慮可能是由于蛋白酶解程度越大，多肽得率越高，生成的小分子肽段越多導致具有抑制活性的肽段越少，因此，選擇風味蛋白酶進行后續實驗。

圖1 不同蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率和多肽得率Fig.1 α-Amylase inhibition rate and polypeptide yield of hydrolysates of different proteases

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比對蛋白酶解液的影響 由圖2可知，酶添加量一定時，多肽得率隨液料比的增大而降低，這是因為底物濃度越低，其與酶結合的幾率就越低，多肽得率也越低[25]。α-淀粉酶活性抑制率呈現先上升后下降的趨勢，在液料比為20:1 mL/g時α-淀粉酶活性抑制率最高為42.19%。因此風味蛋白酶制備花生粕多肽的最佳料液比為20:1 mL/g。

圖2 液料比對α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield

2.2.2 超聲功率對蛋白酶解液的影響 超聲波預處理能破壞花生蛋白的結構，使酶的結合位點增多，更容易使花生蛋白酶解為小分子肽段。由圖3可知，多肽得率和α-淀粉酶抑制率都隨超聲功率的增大呈現先上升后下降的趨勢，當超聲功率為150 W時，α-淀粉酶活性抑制率為最大值36.7%，但當超聲功率繼續升高時，花生蛋白結構被破壞，酶結合位點持續增多，大分子蛋白被酶解為更小的分子量的短肽，導致α-淀粉酶抑制率降低。因此風味蛋白酶制備花生粕多肽的最佳超聲功率為150 W。

圖3 超聲功率對α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic power on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield

2.2.3 超聲時間對蛋白酶解液的影響 由圖4可知，超聲功率一定時，隨著超聲時間的延長，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率都呈現出先上升再下降的趨勢，當超聲時間為30 min時，多肽得率和α-淀粉酶活性抑制率達到最大值分別為42.3%和40.07%。這可能是因為超聲波空化作用對蛋白分子產生的剪切作用力和瞬間高壓，能夠使花生蛋白結構被破壞，酶結合位點增多，具有抑制活性的產物抑制率隨之增加，因此風味蛋白酶制備花生粕多肽的最佳超聲時間為30 min。

圖4 超聲時間對α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield

2.2.4 酶添加量對蛋白酶解液的影響 由圖5可知，隨著酶添加量的增大，蛋白液不斷被酶解解，多肽得率隨之上升，α-淀粉酶抑制率先上升后下降，增大酶添加量使其與底物充分接觸，大分子蛋白質被水解成不同分子量的肽段，α-淀粉酶抑制率出現降低[27]。當酶添加量為5000 U/g時，α-淀粉酶活性抑制率達到最大值為51.62%。因此風味蛋白酶制備花生粕多肽的最佳酶添加量為5000 U/g。

圖5 酶添加量對α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影響Fig.5 Effects of enzyme dosage on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield

2.2.5 酶解時間對蛋白酶解液的影響 由圖6可知，隨著酶解時間的延長，多肽得率逐漸升高，ɑ-淀粉酶活性抑制率出現先升高后降低的趨勢，這是因為具有ɑ-淀粉酶抑制作用的有效肽段隨著水解的繼續進行，被酶解成無抑制活性的小肽，從而活性抑制率降低[28]，當酶解時間為2 h時，ɑ-淀粉酶活性抑制率達到最大值40.78%。考慮到以上原因，風味蛋白酶制備花生粕多肽最佳酶解時間為2 h。

圖6 酶解時間對α-淀粉酶抑制率和多肽得率的影響Fig.6 Effects of enzymatic hydrolysis time on α-amylase inhibition rate and polypeptide yield

2.3 響應面優化試驗設計及結果

采用Design-Expert．V8.0.6統計軟件設計，響應面優化試驗結果見表3，回歸方差分析見表4。

表4 響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation

采用Design-Expert.V8.0.6統計軟件，對表3中的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，最終獲得二次項回歸方程為：

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

α-淀粉酶抑制率Y=+55.88+1.26A-0.0.56B+3.48C+0.13AB-1.18AC+0.67BC-1.87A2-2.582-7.96C2。

從表4可以看出，該模型P＜0.0001，差異極顯著，因變量與所考察的自變量之間線性關系顯著R2=0.9306，模型調整確定系數R2Adj=0.9846，說明該模型可信度較高，擬合度較好[29]。失擬項不顯著P=0.2489＞0.05，說明本實驗所得二次回歸方程能夠很好對響應值進行預測[30-31]。從方差分析結果可以看出各因素對ɑ-淀粉酶抑制率的影響力大小的順序為：C＞A＞B，即酶添加量＞液料比＞超聲時間。

2.4 響應面分析及最優條件確定

通過回歸方程繪制花生粕多肽酶解工藝條件的響應面分析圖，響應面圖呈開口向下的凹形曲面，表明ɑ-淀粉酶抑制率存在極大值，由等高線的中心位置可以表明ɑ-淀粉酶抑制率的最優條件存在于設計因素水平的范圍之內。響應面交互作用受曲面坡度的影響，曲面陡表明該因素對ɑ-淀粉酶抑制率的影響顯著，曲面平緩表明該因素ɑ-淀粉酶抑制率的影響不顯著[32]；等高線形狀反映兩因素交互作用的強弱，橢圓形表明兩因素交互作用強，圓形則表明兩因素交互作用弱；等高線密集表明對ɑ-淀粉酶抑制率的影響較大，稀疏表明對ɑ-淀粉酶抑制率的影響較小，結果如圖7所示。

圖7 α-淀粉酶抑制率響應面優化試驗兩因素交互作用影響Fig.7 Interaction of two factors in response surface optimization experiment of α-amylase inhibition rate

通過Design-Expert 8.0.6軟件優化得到花生蛋白制備α-淀粉酶抑制肽的最佳工藝條件：液料比為21.35 mL/g，超聲時間為29.25 min，酶添加量為5195.75 U/g，在此試驗下，α-淀粉酶抑制率為51.4112%。采用這一結果并根據實際情況，將工藝條件改為：液料比為20:1 mL/g，超聲時間為30 min，酶添加量為5000 U/g，得到實驗結果為50.62%。與理論值較為接近，說明經過響應面優化得到的超聲波輔助酶解花生蛋白制備α-淀粉酶抑制肽工藝參數具有較高可靠性。

2.5 超濾分離純化花生粕多肽的結果

花生蛋白酶解液經超濾分級分離后得到分子量不同的四個組分，取樣品濃度為5 mg/mL分別測定各個多肽組分對ɑ-淀粉酶的抑制率，結果如表5所示。

由表5可知，不同分子量組分的ɑ-淀粉酶抑制活性不同。ɑ-淀粉酶抑制活性隨著分子量的降低而顯著增加。當花生粕多肽分子量＜3 kDa時，其對ɑ-淀粉酶抑制率最高。Gu X從榨油后的杏仁殘渣中提取的兩種降血糖肽，肽A肽B的分子量分別為341.37和291.31[33]。Yuwen Fang從絲膠中提取純化鑒定出的降血糖肽的分子量為632、689、774 kDa[34]。由此可以看出，超濾后具有較高活性的肽段分子量都比較小，因此選擇分子量＜3 kDa的組分進一步純化。

表5 超濾后各組分間對α-淀粉酶的抑制率Table 5 Inhibition rates of α -amylase among components after ultrafiltration

2.6 Sephadex G-15凝膠分離純化結果

將分子量＜3 kDa的多肽組分進行Sephadex G-15凝膠純化，得到三個組分峰（P1、P2、P3），結果見圖8，由圖可知，P3為主要組分峰。分別收集各個組分峰，-20 ℃冷凍干燥，測定各組分峰對α-淀粉酶抑制率。結果見圖9。

圖8 Sephadex G-15層析色譜圖Fig.8 Sephadex G-15 chromatography

將收集后的3個組分峰多肽，配制成1 mg/mL濃度相同的溶液，分別測其對ɑ-淀粉酶的抑制率。由圖9可知，P1、P2、P3三個組分的抑制率分別為63.08%、57.56%、73.30%。P3組分多肽明顯高于其他組分。凝膠過濾層析中，大分子物質由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，小分子物質除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，較大分子化合物后洗脫出來，由此可以推測，三個組分的分子質量大小為P1＞P2＞P3。

圖9 Sephadex G-15 分離純化后花生蛋白酶解液各組分抑制率Fig.9 Inhibition rate of each component of peanut proteolytic solution after separation and purification by Sephadex G-15

3 結論

本實驗以花生粕為原料提取花生蛋白，經過超聲波預處理后酶解花生蛋白獲得粗肽，以多肽得率和α-淀粉酶抑制率為指標篩選最適蛋白酶，在單因素實驗上，選取液料比、超聲時間、酶添加量進行Box-Behnken試驗設計，得到最優工藝條件為：液料比為20:1 mL/g，超聲時間為30 min，酶添加量為5000 U/g，在此條件下，α-淀粉酶抑制率為50.62%。與未經過超聲處理組的α-淀粉酶抑制率35.45%相比，有顯著提升，為繼續提高多肽的抑制活性，對粗肽進行分離純化。經超濾分級分離，得到四個不同組分，分別為＞10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa、＜3 kDa，其中＜3 kDa分子量抑制率達到最高60.21%。利用Sephadex G-15凝膠分離純化＜3 kDa組分，得到P1、P2、P3三個組份，其中P3最高抑制率可達到73.30%。由此可見，花生多肽對ɑ-淀粉酶抑制率效果顯著，當然如果想要繼續提高抑制率，還需對酶解液進一步純化處理。