渦旋輔助離子液體雙水相萃取五味子中木脂素類(lèi)化合物

李瓊婕，趙 哲，王秀娟，畢金龍，王志兵

（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012）

五味子為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）的干燥成熟果實(shí)[1]，是一種聞名中外的中藥，常用于治療慢性咳喘、遺精、遺尿、久瀉、自汗口渴及肝炎、糖尿病、高血壓、失眠和腎氣不足等[2-4]。據(jù)報(bào)道，五味子中的化學(xué)成分包括多糖、木脂素、氨基酸和揮發(fā)油等，其中木脂素是其主要活性成分，如五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等，這些成分具有抗腫瘤、肝保護(hù)和抗氧化、抗HIV等作用[5-6]。

目前，用于木脂素類(lèi)化合物檢測(cè)的常用方法有紫外分光光度法[7]、高效液相色譜法[8-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、超高液相色譜法[12-13]等。其中，高效液相色譜法因其靈敏度高、分析速度快、成本低而被廣泛應(yīng)用于中藥中木脂素類(lèi)化合物的檢測(cè)分析[14]。但由于中藥中的基質(zhì)組成非常復(fù)雜，所以在檢測(cè)之前需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。常用的木脂素類(lèi)化合物的前處理方法有回流法[15]、超聲波提取法[16-18]、微波提取法[19-20]、超臨界流體提取法[16,21]等。如王茹等[22]、裴毅等[23]、Zhu等[24]建立的方法，雖然提取量高、工藝穩(wěn)定，但同時(shí)也面臨著有機(jī)溶劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備成本高等問(wèn)題。近幾年，一些新的木脂素類(lèi)化合物提取方法出現(xiàn)，如Cheng等[25]提出的粉碎組織提取法，Zhang等[26]建立的一種基質(zhì)固相分散法結(jié)合高效液相色譜法，與傳統(tǒng)方法相比，不僅提取量較高且對(duì)樣品、溶劑和時(shí)間的要求降低。為了解決萃取時(shí)間長(zhǎng)、樣品用量大、設(shè)備昂貴、操作繁瑣等問(wèn)題，雙水相體系（Aqueous two-phase system，ATPs）作為一種新型的液-液萃取技術(shù)逐漸引起人們的關(guān)注[27]。與傳統(tǒng)的液-液萃取技術(shù)相比，其萃取原理相似，都是根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)的不同來(lái)進(jìn)行分離。Shoushtari等[28]與Da等[29]提出的乙腈/碳水化合物雙水相體系和聚乙二醇-檸檬酸雙水相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿(mǎn)意，但前者使用了可揮發(fā)性有機(jī)溶劑，危害環(huán)境，后者雖然該體系所用試劑環(huán)保，但分相時(shí)間長(zhǎng)。因此為了改進(jìn)傳統(tǒng)雙水相的不足，研究人員開(kāi)始用離子液體（ionic liquid, IL）代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑。IL是由有機(jī)陽(yáng)離子和無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子結(jié)合而成的有機(jī)熔鹽[30]。基于離子液體的雙水相體系解決了分相速度慢的問(wèn)題，其乳液形成少，不含揮發(fā)性有機(jī)溶劑，具有分相時(shí)間短、不易乳化、穩(wěn)定性高、易回收等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成功用于分離藥物、蛋白質(zhì)、激素和抗生素等化合物[31]。然而，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)采用離子液體/鹽雙水相體系萃取五味子中的木脂素類(lèi)化合物的相關(guān)報(bào)道。

因此，本研究首次建立[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系，并用于五味子中木脂素類(lèi)化合物的提取，對(duì)萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。為了評(píng)價(jià)本法性能，本研究將其與熱回流法和超聲提取法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子藥材 購(gòu)買(mǎi)于當(dāng)?shù)厮幏浚ㄖ袊?guó)，長(zhǎng)春），粉碎后過(guò)80目篩，并于60 ℃烘箱中干燥至恒重，儲(chǔ)存于干燥器中備用；五味子醇甲（Schizandrol A）、五味子酯甲（Schizandrol A）、五味子甲素（Schisandrin A）和五味子乙素（Schizandrin B）標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%） 上海市阿拉丁試劑有限公司；戈米辛D（Gomisin D）、五味子酚（Schisanhenol）、五味子丙素（Schisandrin）和五味子醇乙（Schizandrol B）標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%） 成都曼斯生物科技有限公司；1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C2mim]BF4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4mim]BF4）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[C6mim]BF4）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[C8mim]BF4） 上海成捷化學(xué)有限公司；MgSO4、K2CO3、Na2CO3、K2HPO4、KCl、NaCl 北京化工廠；甲醇（色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher公司；其他試劑均為分析純。

Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、安捷倫1100型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器） 美國(guó)安捷倫公司；Centrifuge 5430R型高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；XW-80型旋渦混合器上海青浦瀘西儀器廠；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱(chēng)量各標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用適量甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度1000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存，其他工作液均由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇稀釋得到。

1.3 萃取方法

1.3.1 離子液體/鹽雙水相萃取 雙水相萃取（Aqueous two-phase extraction，ATPE）實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示，精確稱(chēng)取10 mg五味子粉末樣品于10 mL離心管中，向其加入4 mL水和500 μL的[C4mim]BF4，手動(dòng)振搖30 s后加入1.6 g MgSO4，渦旋混合1.5 min后，在3000 r/min下離心10 min后，得到液-固-液三相體系。其中，上相為離子液體相，中相為五味子殘?jiān)孪酁樗唷ｋS后，將上相全部取出，用甲醇稀釋至0.5 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。

圖1 渦旋輔助離子液體雙水相萃取流程圖Fig.1 Procedure of votex-assisted ionic liquid aqueous two-phase extraction

1.3.2 熱回流提取法（Hot reflux extraction, HRE）參考王茹等[23]的研究方法。精確稱(chēng)取0.5 g五味子樣品于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入95%乙醇15 mL，稱(chēng)重，加熱回流提取2 h，冷卻至室溫后稱(chēng)重，用95%乙醇補(bǔ)齊損失的重量，搖勻后過(guò)濾，取續(xù)濾液2 mL，減壓干燥后用2 mL甲醇回溶，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。

1.3.3 超聲波提取法（Ultrasonic extraction, UE） 根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020版）[1]，精確稱(chēng)取0.25 g五味子樣品粉末于20 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入甲醇約18 mL，以功率200 W的超聲條件超聲20 min，冷卻至室溫后定容至刻度，搖勻過(guò)濾，取續(xù)濾液2 mL過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。

1.4 相圖的繪制

相圖的繪制采用濁點(diǎn)滴定法[32]，用數(shù)字恒溫加熱套保持溫度為（25±2）℃，各組分濃度以質(zhì)量體積比表示。操作過(guò)程如下：吸取2 mL（m1）的0.5 g·mL-1[C4mim]BF4水溶液置于比色管中，向其逐滴滴加0.5 g·mL-1MgSO4水溶液至體系混濁，記錄加入量（m2），再逐滴滴加水至澄清，記錄水的加入量（m3），直至不再出現(xiàn)渾濁，計(jì)算每個(gè)濁點(diǎn)時(shí)[C4mim]BF4和MgSO4的質(zhì)量體積比濃度，分別記為w1和w2，計(jì)算如下。

準(zhǔn)確移取2 mL（m1）的0.5 g·mL-1[C4mim]BF4水溶液置于另一個(gè)比色管中，向其中滴加0.2 g·mL-1Na2CO3水溶液至體系混濁，記錄加入量（m2），再逐滴滴加水至澄清，記錄水的加入量（m3），直至不再出現(xiàn)渾濁，計(jì)算每個(gè)濁點(diǎn)時(shí)[C4mim]BF4和Na2CO3的質(zhì)量體積比濃度，分別記為w1和w2，計(jì)算如下，以w1、w2為橫縱坐標(biāo)作圖，即得雙節(jié)線(xiàn)圖。

IL質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

成相鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

1.5 萃取條件優(yōu)化

1.5.1 離子液體（IL）的種類(lèi)與體積 按照1.4離子液體/鹽雙水相萃取法，在MgSO4的用量為1.2 g，渦旋時(shí)間為2 min，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間為3000 r/min，10 min的前提下，考察不同體積（250～550 μL）的四種離子液體（[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4和[C8mim]BF4）對(duì)五味子提取量的影響。

1.5.2 鹽的種類(lèi)與用量 按照1.4離子液體/鹽雙水相萃取法，IL的種類(lèi)與體積為1.5.1的最佳條件，渦旋時(shí)間為2 min，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間為3000 r/min，10 min的前提下考察不同用量（1.1～1.7 g）的兩種鹽（MgSO4和Na2CO3）對(duì)五味子提取量的影響。

1.5.3 渦旋時(shí)間 按照1.4離子液體/鹽雙水相萃取法，鹽的種類(lèi)與用量為1.5.2的最佳條件，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間為3000 r/min，10 min的前提下考察渦旋時(shí)間（0.5～5 min）對(duì)五味子提取量的影響。

1.5.4 離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間 按1.3.1離子液體/鹽雙水相萃取法，渦旋時(shí)間為1.5.3的最佳條件下考察不同離心轉(zhuǎn)速（1000～6000 r/min）和離心時(shí)間（2～30 min）對(duì)五味子提取量的影響。

1.6 色譜分析

色譜條件如下：流動(dòng)相由甲醇（A）和水（B）組成，洗脫梯度條件如下所示：0～10 min，68% A；10～15 min，68%～80% A；15～40 min，80% A；40～42 min，80%～68% A；42～45 min，68% A；流動(dòng)相流速為0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。色譜柱為Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

本研究以保留時(shí)間進(jìn)行定性，五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的保留時(shí)間分別為15.556、17.658、20.658、26.41、29.856、36.319、42.087 min。取1000 μg·mL-1的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成各濃度為200、70、70、60、20、50、10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125、250、500、1000 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL容量瓶?jī)?nèi)用甲醇定容至刻度，制得一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件如下進(jìn)行分析，以濃度（c）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

提取量及回收率的計(jì)算分別見(jiàn)公式（3）、（4）。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Origin 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

式中：E為提取量，mg·g-1；C為提取物的濃度，mg·mL-1；V為提取物的體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

式中：R為回收率，%；C0為初始量，mg·g-1；C1為加標(biāo)量，mg·mL-1；C2為檢出量，mg·g-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系相圖

[C4mim]BF4與MgSO4和Na2CO3形成的相圖如圖2所示，雙節(jié)線(xiàn)下方的區(qū)域?yàn)榫鶆虻膯蜗啵纬呻p水相的兩組分混合后溶液澄清，為均相區(qū)；雙節(jié)線(xiàn)上方的區(qū)域，不同的兩組分混合后體系能自動(dòng)分為兩相，為雙水相區(qū)；雙節(jié)線(xiàn)上的部分，溶液剛好由澄清變?yōu)榛鞚幔瑸閯傄窒嗟膮^(qū)域。[C4mim]BF4/MgSO4雙水相的成相范圍為：[C4mim]BF421.28%～78.43%，MgSO45.88%～37.70%，水15.69%～45.38%。[C4mim]BF4/Na2CO3雙水相的成相范圍為：[C4mim]BF422.10%～83.33%，Na2CO34.17%～30.39%，水12.50%～50.71%。

圖2 [C4mim]BF4/MgSO4和[C4mim]BF4/NaCO3相圖Fig.2 Phase diagrams of the [C4mim]BF4/MgSO4 and[C4mim]BF4/Na2CO3

圖2顯示了[C4mim]BF4與MgSO4和Na2CO3體系在298 K下測(cè)定的二項(xiàng)式曲線(xiàn)，該曲線(xiàn)提供了有關(guān)形成雙相體系的各相組分濃度的信息。從圖中可以看出，向離子液體的水溶液中加入正確濃度的MgSO4或Na2CO3，形成了ATPs。眾所周知，二項(xiàng)式曲線(xiàn)越接近原點(diǎn)，成相能力越強(qiáng)[33]。通過(guò)繪制[C4mim]BF4/MgSO4和[C4mim]BF4/Na2CO3的相圖發(fā)現(xiàn)[C4mim]BF4/Na2CO3的成相能力優(yōu)于前者，但試驗(yàn)結(jié)果表明[C4mim]BF4/MgSO4體系對(duì)木脂素類(lèi)化合物的提取量更高。這表明對(duì)于雙水相體系組成的選擇，成相能力不是第一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 萃取條件優(yōu)化

2.2.1 離子液體（IL）的種類(lèi)和體積 離子液體/鹽雙水相由離子液體、鹽和水三部分組成，在本研究中，離子液體作為萃取溶劑，其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)對(duì)雙水相成相和萃取效果有重要影響。因此，本研究考察了4種離子液體[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4和[C8mim]BF4對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[C2mim]BF4和[C8mim]BF4不能形成雙水相體系，其主要原因是[C2mim]BF4有較強(qiáng)水溶性，加鹽后始終為均相溶液，而[C8mim]BF4由于其較強(qiáng)的疏水性，加入到水溶液時(shí)不溶，直接沉于試管底部。[C4mim]BF4和[C6mim]BF4可與鹽形成雙水相體系，且[C4mim]BF4形成的雙水相效果最好。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，離子液體咪唑環(huán)上的烷基鏈越長(zhǎng)，其疏水性越強(qiáng)，對(duì)水的斥力越大，形成雙水相的能力就越強(qiáng)[34-37]。雖然[C6mim]BF4疏水性強(qiáng)于[C4mim]BF4，疏水性增強(qiáng)，但黏性也更強(qiáng)，不利用雙水相萃取。因此，本研究選用[C4mim]BF4進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

本研究考察了當(dāng)水為4 mL，MgSO4用量為1.6 g時(shí)，離子液體用量（250～550 μL）對(duì)木脂素類(lèi)化合物提取量的影響。如圖3所示，隨著離子液體用量從250 μL增加至500 μL，木脂素類(lèi)化合物的提取量明顯提高，五味子醇甲提取量由3.42 mg·g-1提高至5.26 mg·g-1，各化合物提取量提高近50%。然而，繼續(xù)增加離子液體用量，目標(biāo)物提取量幾乎不變或略有下降。這可能是由于離子液體具有一定粘度，其用量增加，盡管能有效提取目標(biāo)物，但同時(shí)也增加了體系的粘度，不利于傳質(zhì)。因此，本研究選擇離子液體用量為500 μL。

圖3 IL體積對(duì)提取量的影響Fig.3 Effect of the volume of IL on the extraction yield

2.2.2 鹽的種類(lèi)及用量 無(wú)機(jī)鹽的加入會(huì)影響離子液體在雙水相體系中的分布，同時(shí)也會(huì)改變目標(biāo)組分的分配系數(shù)和提取效率[38]。因此，本研究考察了[C4mim]BF4分別與硫酸鎂、碳酸鉀、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀和氯化鈉的成相效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)水為4 mL，離子液體體積為500 μL時(shí)，MgSO4和Na2CO3可以與[C4mim]BF4形成雙水相，這可能是因?yàn)槠珴B透性離子CO32-、SO42-與水分子的相互作用更強(qiáng)，有利于雙水相的形成[39]。如圖4所示，MgSO4所形成的雙水相體系的提取量明顯高于Na2CO3，這可能是因?yàn)镸g2+的原子半徑更大，電荷也更高，導(dǎo)致了這種現(xiàn)象的發(fā)生[40]。因此，本研究選用MgSO4作為成相鹽。

圖4 鹽的種類(lèi)對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of type of salt on the extraction yield

此外，本研究還考察了MgSO4用量為1.1～1.7 g時(shí)對(duì)目標(biāo)物提取量的影響。如圖5所示，隨鹽用量的增加，離子液體相體積不斷增加，目標(biāo)物提取量隨之增加，這可能是因?yàn)殡S著鹽用量的增加，MgSO4的鹽析作用占主導(dǎo)地位，IL逐漸與水分離且目標(biāo)物隨著IL相富集到上相[41]。當(dāng)MgSO4用量為1.6 g時(shí)，提取量最高，此時(shí)上相（IL相）體積為450 μL，繼續(xù)增加鹽的用量，目標(biāo)物提取量略有下降，這可能是因?yàn)槌上帑}的過(guò)量使用使粘度增加，不利于目標(biāo)分析物的轉(zhuǎn)移[42]，從而導(dǎo)致提取量降低。因此，本研究選擇MgSO4的用量為1.6 g。

圖5 鹽的用量對(duì)提取量的影響Fig.5 Effect of amount of salt on the extraction yield

2.2.3 渦旋時(shí)間 在萃取時(shí)，渦旋可以加速乳狀液的形成，增加萃取劑與目標(biāo)物質(zhì)的接觸面積，加速傳質(zhì)并縮短萃取平衡時(shí)間[43]。本研究考察了渦旋時(shí)間（0.5～5 min）對(duì)五味子中木脂素類(lèi)化合物提取量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在渦旋1.5 min時(shí)提取量最高，總木脂素類(lèi)化合物提取量為9.82 mg·g-1，盡管渦旋時(shí)間對(duì)目標(biāo)物提取量影響較小，但如不對(duì)樣品溶液進(jìn)行渦旋時(shí)，[C4mim]BF4/MgSO4體系分相耗時(shí)長(zhǎng)。然而，在對(duì)該體系進(jìn)行渦旋后無(wú)需靜置，即可分相。為了加速傳質(zhì)過(guò)程，縮短提取時(shí)間，本研究選擇渦旋1.5 min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖6 渦旋時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.6 Effect of vortex time on the extraction yield

2.2.4 離心轉(zhuǎn)速及時(shí)間 離心能促進(jìn)雙水相體系的形成，使相與相之間的分層更加清晰，便于離子液體相的轉(zhuǎn)移。因此，本研究考察了1000～5000 r·min-1范圍內(nèi)離心轉(zhuǎn)速對(duì)目標(biāo)物提取量的影響。如圖7所示，隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，木脂素類(lèi)化合物的提取量逐漸提高，當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為3000 r·min-1時(shí)，提取量達(dá)到最大值。

圖7 離心轉(zhuǎn)速對(duì)提取量的影響Fig.7 Effect of centrifugation speed on the extraction yield

此外，本研究還考察了不同離心時(shí)間（2～30 min）對(duì)提取量的影響。如圖8所示，在離心10 min后，雙水相分層清晰且木脂素類(lèi)化合物的提取量達(dá)到最大值，體系達(dá)到萃取平衡，提取量不再上升。在離心之后，目標(biāo)物被富集于上相，下相為水相，中間相為五味子殘?jiān)４藭r(shí)相界面清晰，便于上相全部取出。因此，本研究選擇在3000 r/min，離心10 min為最佳離心條件。

圖8 離心時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.8 Effect of centrifugation time on the extraction yield

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、定量限和精密度 配制含有7種木脂素類(lèi)化合物的一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以目標(biāo)物質(zhì)的濃度（c）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）為信噪比（S/N）分別為3和10時(shí)儀器能檢出和定量目標(biāo)物質(zhì)的最低濃度。日內(nèi)、日間精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，一天內(nèi)連續(xù)分析6次樣品所得的目標(biāo)物提取量的RSD為日內(nèi)精密度；每天分析2次、連續(xù)分析3 d樣品所得目標(biāo)物提取量的RSD為日間精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，各目標(biāo)分析物在線(xiàn)性范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（r＞0.9995），LOD和LOQ分別為0.20～6.98和0.65～23.26 ng·mL-1，日內(nèi)精密度RSD低于3.97%，日間精密度RSD低于4.19%，方法性能滿(mǎn)足要求。

表1 線(xiàn)性回歸方程、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）及精密度Table 1 Linear regression equation, LOD, LOQ and precision

2.3.2 加標(biāo)回收率及實(shí)際樣品分析 為了確定本研究的準(zhǔn)確性和適用性，本研究分別進(jìn)行了加標(biāo)回收率與實(shí)際樣品分析試驗(yàn)。加標(biāo)回收率如表2所示，各目標(biāo)物質(zhì)的回收率為72.22%～97.19%，RSD低于3.97%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿(mǎn)意，因此本研究建立的方法可用于其他中藥中木脂素類(lèi)化合物的提取。

表2 化合物的回收率Table 2 Recovery of chemical compounds

本研究對(duì)7種不同產(chǎn)地的五味子樣品進(jìn)行分析，分別來(lái)自遼寧（樣品1）、浙江（樣品2）、黑龍江（樣品3）、陜西（樣品4）、甘肅（樣品5）、內(nèi)蒙古（樣品6）和吉林（樣品7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，所有產(chǎn)地北五味子樣品中，各目標(biāo)分析物中均以五味子醇甲的含量最高，是中藥五味子的標(biāo)志性成分，這與中國(guó)藥典的報(bào)道相一致。從表3可以看出，五味子醇甲的含量為0.08～5.33 mg·g-1，戈米辛D的含量為0.04～0.34 mg·g-1，五味子醇乙的含量為0.07～1.98 mg·g-1，五味子酚的含量為0.12～0.91 mg·g-1，五味子甲素的含量為0.30～1.07 mg·g-1，五味子乙素的含量為0.05～1.47 mg·g-1，五味子丙素的含量為0.03～0.18 mg·g-1。各產(chǎn)地的五味子中木脂素類(lèi)化合物的含量不同，原因可能是各地藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、光照條件、雨水條件及采收時(shí)間均不同。東北五味子的五味子醇甲的含量明顯高于其他產(chǎn)地，與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的一致，亦與中藥道地藥材的標(biāo)準(zhǔn)一致[44]。五味子標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品提取物色譜圖如圖9所示。

圖9 五味子標(biāo)準(zhǔn)品與樣品提取物色譜圖（a）和（b）及光譜圖（c）和（d）Fig.9 Chromatograms （a）, （b） and spectrogram （c）, （d） of the Schisandra chinensis standard solution and sample extracts

表3 實(shí)際樣品分析（n=3）Table 3 Actual sample analysis(n=3)

2.3.3 方法比較 為了評(píng)價(jià)本研究所建立的方法的實(shí)用性，將其與超聲提取法、熱回流法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。與其他方法相比，本法無(wú)需過(guò)濾、濃縮等步驟，簡(jiǎn)化了操作流程。與熱回流相比，本法將提取時(shí)間從120 min縮短至12 min，大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，且不用加熱，操作簡(jiǎn)單。綜上所述，本法具有操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、提取量高等優(yōu)點(diǎn)。

表4 方法比較Table 4 Methed comparison

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)單、高效、綠色的渦旋輔助離子液體雙水相法萃取五味子中7種木脂素類(lèi)化合物，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離和定量。與其他方法相比，本法用離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑作為萃取溶劑，由親水性離子液體[C4mim]BF4和MgSO4組成雙水相體系，具有綠色、分相速度快、操作簡(jiǎn)單、提取量高等優(yōu)點(diǎn)，可嘗試用于其他中藥中木脂素類(lèi)化合物的提取。本實(shí)驗(yàn)以親水性離子液體[C4mim]BF4為萃取溶劑建立的提取方法[C4mim]BF4會(huì)殘留于木脂素類(lèi)中且ATPs一次萃取量過(guò)少，因此該法僅適用于木脂素類(lèi)化合物的的分析與檢測(cè)，不適合用于五味子提取物的制備與工業(yè)化生產(chǎn)。為此，在未來(lái)將致力于建立一種更加綠色、萃取量大、適合工業(yè)化生產(chǎn)的提取方法。