刺玫果中花色苷提取工藝優(yōu)化及抗氧化性分析

周新宇，呂重寧，秦汝蘭,

（1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，吉林通化 134000；2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽 110016）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）為薔薇科薔薇屬植物刺玫的成熟果實(shí)，又名薔薇果、山刺玫果、野刺玫果等。野生資源豐富，主要分布于我國東北、內(nèi)蒙、山西及河北等省區(qū)。刺玫果中含有黃酮、維生素、皂苷、多糖、三萜類等多種活性物質(zhì)，其中研究較多的為黃酮類化合物[1]，但關(guān)于刺玫果中花色苷的研究報(bào)道較少。刺玫果果實(shí)酸甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富。據(jù)《中國中藥大辭典》中記載，刺玫果可用于治療胃腹脹痛、小兒積食、咳嗽、腹瀉及維生素C缺乏癥等疾病，并具有明顯的抗疲勞、耐缺氧、抗炎及增強(qiáng)免疫等活性[2-3]。目前，以野生刺玫果為主要原料的食品、保健品和功能性飲料不斷出現(xiàn)[4]。

花色苷（anthocyanins）是具有2-苯基苯并毗喃結(jié)構(gòu)的一類糖苷衍生物，其共軛雙鍵在465～560 nm處有最大光吸收，為植物界中廣泛分布的一種水溶性色素，普遍存在于植物的花、果實(shí)、根、莖、葉中，具有抗氧化、保護(hù)心血管、抗腫瘤等多種功能[5-6]。近年來對(duì)于花色苷抗氧化作用的研究較多，如吳映梅等[7]通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)得出黑莓中的總花色苷對(duì)DPPH自由基和羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用。閆亞美等[8]研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1黑加侖花色苷提取液較同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力和自由基清除能力。何傳波等[9]研究紫薯中花色苷抗氧化活性得出總抗氧化能力為101.38 U·mg-1，表明其花色苷抗氧化活性較強(qiáng)。綜合文獻(xiàn)分析，進(jìn)一步揭示花色苷為最直接有效、安全的自由基清除劑[10]。此外，隨著研究水平的不斷提高，人們逐漸發(fā)現(xiàn)合成色素對(duì)人體健康存在一定的危害，因而從天然植物中尋找花色苷作為食品著色劑引起了人們的廣泛關(guān)注[11]。

本研究以花色苷得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)并結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)確定刺玫果中花色苷的最佳提取工藝，通過多種體外抗氧化方法評(píng)價(jià)刺玫果中花色苷的抗氧化活性，為刺玫果資源的開發(fā)及后續(xù)產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺玫果樣品 采于通化師范學(xué)院周邊經(jīng)通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定為刺玫果（Rosa davuricaPall.）正品，烘干粉碎后備用；無水乙醇、丙酮、甲醇、鹽酸等試劑 均為國產(chǎn)分析純；DPPH（1，1－二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽 阿拉丁試劑，上海有限公司。

KQ-250E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；YP2002電子天平 上海衡際科學(xué)儀器有限公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PB-10酸度計(jì) 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺玫果中花色苷的提取工藝 刺玫果→粉碎至粗粉→按考察的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取→12000 r·min-1離心→上清液→用提取溶液補(bǔ)足或濃縮至25 mL→刺玫果花色苷提取物

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 稱取刺玫果粉末1 g，按1:15 g·mL-1的料液比加15 mL鹽酸酸化的60%乙醇溶液（pH2），溫度50 ℃，超聲提取30 min，2次，12000 r·min-1離心，上清液定容于25 mL容量瓶中，于200～700 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)定刺玫果中花色苷的最大吸收波長(zhǎng)[12]。

1.2.3 提取溶劑的選擇 稱取刺玫果粉末1 g，4份，按1:15 g·mL-1的料液比分別加入15 mL鹽酸酸化的蒸餾水、鹽酸酸化的甲醇溶液、鹽酸酸化的60%乙醇溶液、鹽酸酸化的丙酮溶液，各溶液pH均為2，溫度為50 ℃，超聲提取30 min，2次，離心，上清液定容于25 mL容量瓶中，并于532 nm處測(cè)定各樣品溶液的吸光度值，確定最佳提取溶劑，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，料液比分別按照1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g·mL-1，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4.2 溶劑pH考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，溶劑pH分別為1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4.3 超聲溫度考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、40%、60%、80%、100%，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4.5 超聲時(shí)間考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.4.6 超聲次數(shù)考察 稱取刺玫果粉末1 g，5份，超聲次數(shù)分別為1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備得到樣品溶液并于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)可能影響刺玫果花色苷的6個(gè)因素，包括溶劑pH、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、料液比、超聲次數(shù)進(jìn)行主效應(yīng)分析，選用n=12的Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)，6個(gè)因素分別對(duì)應(yīng)表中的6個(gè)列，每個(gè)因素取低水平“-1”和高水平“1”，以樣品溶液的吸光度值A(chǔ)為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得出各因素的F值和P值，選取影響結(jié)果的關(guān)鍵因素，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平表和編碼見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平和編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental

1.2.6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）、料液比（D）四個(gè)因素，以刺玫果花色苷吸光度值（Y）為響應(yīng)值，通過四因素三水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 為確定響應(yīng)面回歸模型的建立的準(zhǔn)確性，對(duì)模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整后進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)平行操作3次。通過pH示差法[13-14]，按照下列公式計(jì)算刺玫果中花色苷含量。

式中：X為刺玫果花色苷含量（mg·g-1）；ΔT為吸光度ApH1和ApH4.5的差值；V為稀釋體積（L）；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449 g·mol-1）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[26900 L·（mol·cm）-1]；m為樣品質(zhì)量（g）；b為比色皿厚度（1 cm）。

1.2.8 刺玫果中花色苷體外抗氧化活性研究

1.2.8.1 待測(cè)溶液的配制 按“1.2.7”項(xiàng)下最佳工藝條件提取刺玫果花色苷，減壓濃縮至稠膏狀，臨用前稀釋制成所需質(zhì)量濃度。

1.2.8.2 刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·清除率測(cè)定 精確稱取15.7685 mg的DPPH粉末，置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.4 mmol·L-1的DPPH溶液，避光保存。按照“1.2.8.1”項(xiàng)下方法，制成1、2、3、4、5 mg·mL-1濃度供試品溶液。試驗(yàn)分為樣品組、對(duì)照組和空白組，并于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度值，其中空白組和樣品組加入DPPH乙醇溶液后需避光靜置1 h，其它操作相同。以VC溶液作為參照，按下列公式計(jì)算刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·清除率[15-16]。

式中：A空白為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL蒸餾水的吸光度值；A對(duì)照為2 mL蒸餾水+2 mL樣品溶液的吸光度值；A樣品為2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL樣品溶液的吸光度值。

1.2.8.4 刺玫果中花色苷對(duì)ABTS+·的清除能力的測(cè)定 分別取7 mmol·L-1ABTS水溶液和2.5 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液5 mL，混勻，置于暗處反應(yīng)12～16 h，使其產(chǎn)生ABTS+·，用蒸餾水將ABTS+·溶液稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光值為0.70±0.02，得到工作液。按照“1.2.8.1”項(xiàng)下方法，制備2、4、6、8、10 mg·mL-1濃度供試品溶液。吸取1 mL系列濃度刺玫果花色苷溶液置于具塞試管中，分別加2 mL ABTS+·溶液，混合均勻，10 min后測(cè)定734 nm處的吸光值記作A1；吸取2 mL ABTS+·溶液與1 mL蒸餾水，混合10 min后測(cè)定734 nm處的吸光值記作A0；吸取2 mL磷酸鹽緩沖液與1 mL系列濃度刺玫果花色苷溶液，混合10 min后測(cè)定734 nm處的吸光值記作A2。以VC作為陽性對(duì)照，操作方法同上。按下列公式計(jì)算刺玫果中花色苷對(duì)ABTS+·清除率[19]。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)中Duncan’s多重差異顯著性分析并計(jì)算樣品對(duì)各自由基清除能力為50%時(shí)的IC50。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖采用Excel 2010進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺玫果中花色苷最大吸收波長(zhǎng)的確定

由圖1可知，刺玫果花色苷提取液在532 nm處具有吸收峰。因此確定刺玫果花色苷最大吸收波長(zhǎng)為532 nm。

圖1 刺玫果花色苷在200～700 nm波長(zhǎng)下的吸光度值Fig.1 Absorbance of anthocyanins of Rosa davurica Pall. at 200～700 nm

2.2 提取溶劑的確定

由于花色苷是極性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做為提取溶劑[20]，Bridgers等以甲醇、乙醇、酸化甲醇和酸化乙醇從紫紅薯中提取花色苷時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸化甲醇的提取效果最好[12]。Awika等用丙酮和酸化甲醇提取黑高粱花色苷時(shí)發(fā)現(xiàn)酸化甲醇的提取效果優(yōu)于丙酮，經(jīng)過液相分析得出丙酮提取的花色苷分子結(jié)構(gòu)被修飾[21]。由圖2可知，4種提取溶劑從刺玫果中提取花色苷后測(cè)定的吸光度值基本與文獻(xiàn)得出的結(jié)論一致，分別為甲醇＞乙醇＞水＞丙酮，盡管很多報(bào)道表明甲醇的提取效果最好，但甲醇具有一定的毒性，因此選擇乙醇為提取溶劑。并且花色苷在中性或堿性條件下不穩(wěn)定，通常采用酸化的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。

圖2 提取溶劑對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.2 Effects of extraction solution on anthocyanins extraction

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 由圖3可知，隨著料液比的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，當(dāng)料液比超過1:15時(shí)，刺玫果花色苷的提取量呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。一定質(zhì)量的刺玫果中花色苷提取率是有限的，溶劑體積的增大利于有效成分的溶出，當(dāng)提取劑用量繼續(xù)增加時(shí)，反而花色苷得率略有降低，表明花色苷已基本從組織中充分溶出，且提取劑過剩，不但會(huì)影響超聲效果，而且可能會(huì)導(dǎo)致花色苷的水解，適當(dāng)?shù)牧弦罕炔粌H有利于花色苷的溶出，而且也減少了料溶劑過多造成的試劑浪費(fèi)[22]，故選擇料液比為1:15進(jìn)行提取。

圖3 料液比對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction

2.3.2 溶劑pH對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 圖4可知，隨著pH的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH為2時(shí)，刺玫果中花色苷的吸光度值最高。分析其原因可能為花色苷屬于水溶性多酚類化合物，可溶于水、乙醇等極性溶劑中，且在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23]，故本實(shí)驗(yàn)在提取刺玫果中花色苷時(shí)，加入HCl試劑，以保證花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止其降解。文獻(xiàn)研究表明[15]，花色苷在pH≤3的介質(zhì)中呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色，隨著pH增大，紅色減弱，花色苷的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)椴槎悾€(wěn)定性降低。所以試驗(yàn)選用pH為2溶液從刺玫果中提取花色苷。

圖4 pH對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.4 Effects of pH on anthocyanins extraction

2.3.3 超聲溫度對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，刺玫果中花色苷的吸光度值逐漸增大，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，刺玫果中花苷的吸光度值最大，溫度繼續(xù)上升，刺玫果中花苷的吸光度值反而降低，這可能是由于溫度對(duì)細(xì)胞內(nèi)花色苷的滲透、擴(kuò)散和溶解有一定的影響。在低溫時(shí)，花色苷溶解度較低，分子不易滲透。隨溫度升高，加速分子運(yùn)動(dòng)，使其溶解度增大，加快分子從細(xì)胞層之間的轉(zhuǎn)移，有助于花色苷的提取，但花色苷耐熱性較差，在高溫環(huán)境和超聲波的空化作用下，花色苷類物質(zhì)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變[24]，導(dǎo)致提取量降低，吸光度值減小。因此，實(shí)驗(yàn)從刺玫果中超聲提取花色苷時(shí)溫度確定為50 ℃。

圖5 超聲溫度對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on anthocyanins extraction

2.3.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 通過圖6得出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)吸光度值最高。花色苷是由苷元和糖基組成的，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致花色苷中糖苷的溶解度降低，使得花色苷提取率隨之減少[25]，故實(shí)驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)確定為60%。

圖6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on anthocyanins extraction

2.3.5 超聲時(shí)間對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 從圖7可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，刺玫果中花色苷的吸光度值呈現(xiàn)急劇上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，刺玫果中花色苷的吸光度值最高，之后基本呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，這是因?yàn)榛ㄉ赵诠桃褐g基本達(dá)到了平衡[26]。因此，實(shí)驗(yàn)確定超聲提取時(shí)間為30 min。

圖7 超聲時(shí)間對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.7 Effects of ultrasound time on anthocyanins extraction

2.3.6 超聲次數(shù)對(duì)刺玫果花色苷提取效果分析 圖8所示，當(dāng)超聲提取為2次時(shí)，刺玫果中花色苷的吸光度值最大，隨著超聲次數(shù)增加，吸光度值基本保持不變，說明提取2次可以把花色苷全部提取出來，為提高實(shí)驗(yàn)效率，故本實(shí)驗(yàn)從刺玫果中提取花色苷超聲次數(shù)確定為2次。

圖8 超聲次數(shù)對(duì)花色苷提取效果的影響Fig.8 Effects of ultrasound times on anthocyanins extraction

2.4 Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

通過Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，經(jīng)影響因素篩選，得到以吸光度值為響應(yīng)值的線性回歸方程Y=0.36+0.014X1+0.041X2+0.084X3+0.050X4+0.041X5+0.019X6，模 型P=0.0010（P＜0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該模型在研究區(qū)域擬合性良好，所得回歸方程顯著[27]。一般情況下決定系數(shù)R2越高，說明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，實(shí)驗(yàn)得到的R2=97.21%，表明回歸模型與數(shù)據(jù)吻合較好。各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果見表4，從表4中的主效應(yīng)分析可知，Placket-Burman試驗(yàn)在二水平范圍內(nèi)，超聲時(shí)間（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）、超聲溫度（X4）、料液比（X5）影響顯著（P＜0.05），影響響應(yīng)值的因素順序依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（P=0.0002）＞超聲溫度（P=0.0023）＞超聲時(shí)間（P=0.0053）=料液比（P=0.0053）＞超聲次數(shù)（X6）（P=0.0826）＞溶劑pH（X1）（P=0.1709），由此推斷，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為影響刺玫果花色苷提取條件的關(guān)鍵因素。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 3 Experimental design and response values of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 4 Effect evaluations of each factor under Plackett-Burman test design

2.5 Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果分析

2.5.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性實(shí)驗(yàn) 在Placket-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表5中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到刺玫果中花色苷吸光度值對(duì)超聲時(shí)間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）及料液比（D）4個(gè)影響因素的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=+0.48-0.014A+0.018B+0.028C+0.029D+0.038AB-2.500E-003AC+0.056AD-0.081BC+1.250E-003BD+0.028CD-0.18A2-0.070B2-0.098C2-0.091D2。

表5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

回歸方程方差顯著性分析結(jié)果見表6，由表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，模型的F=45.40，P＜0.0001，表明實(shí)驗(yàn)所用的二次模型是極顯著的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P=0.1610（＞0.05），表明此響應(yīng)面模型對(duì)試驗(yàn)擬合的情況較好，誤差較小[28]；模型擬合的多元決定系數(shù)R2=0.9784，表明模型擬合度良好，調(diào)整性決定系數(shù)R2Adj=0.9569，表明該模型能解釋95.69%響應(yīng)值的變化，則用該模型能代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)超聲法提取刺玫果中花色苷提取量的分析和預(yù)測(cè)。從表6各因素的P值可知，回歸模型中的B、C、D、AB、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2具有顯著性（P＜0.05），而A、AC、BD均不顯著（P＞0.05），表明各因素對(duì)刺玫果中花色苷提取量的影響不同，調(diào)整不同因素將達(dá)到不同提取效果。

表6 Box-Benhnken回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.2 各因素間相互作用響應(yīng)面分析結(jié)果 三維曲面反映每?jī)蓚€(gè)影響因素之間的交互作用，曲面越較陡，說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響較為顯著，擬合的響應(yīng)曲面能直觀反映各因素之間的交互作用[29]。圖9所示為當(dāng)料液比、超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間中任意兩因素固定為0水平時(shí)，直觀地反映其余兩個(gè)因素交互作用對(duì)花色苷吸光度值的影響。圖9中各圖可以看出三維曲面較陡，響應(yīng)值波動(dòng)較大，表明料液比與超聲溫度，料液比與超聲時(shí)間，超聲溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的之間的交互作用對(duì)刺玫果中花色苷吸光度值影響較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析一致。

圖9 各因素間相互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface diagram of interaction of various factors

2.6 最優(yōu)工藝條件確定與驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

通過Design-Expert.8.06軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到刺玫果花色苷最佳提取工藝條件為：料液比為1:15.9 g·mL-1，超聲溫度為51.49 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.88%，超聲時(shí)間為29.94 min，刺玫果花色苷最大吸光度預(yù)測(cè)值為0.487，結(jié)合實(shí)際操作，將提取工藝合理化后，改為：料液比1:15 g·mL-1，超聲溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲時(shí)間30 min，提取次數(shù)2次，溶液pH為2。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)定平均吸光度值為0.481±0.019，與預(yù)測(cè)值接近，說明該工藝準(zhǔn)確可行。通過pH示差法計(jì)算得出，在最佳工藝條件下，刺玫果中花色苷的提取量為185.033 mg·100g-1。

2.7 刺玫果中花色苷體外抗氧化活性分析

2.7.1 刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·清除能力 DPPH·有單電子，在517 nm波長(zhǎng)處，其醇溶液呈紫色。自由基清除劑能使單電子配對(duì)，從而使吸光度值降低，顏色褪去，且成定量關(guān)系[30]。花色苷分子結(jié)構(gòu)上有多個(gè)酚羥基，可以通過自身氧化釋放電子，進(jìn)而清除DPPH等自由基[31]。實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸（VC）為陽性對(duì)照，研究刺玫果中花色苷物質(zhì)對(duì)DPPH·清除能力，由圖10可知，刺玫果中花色苷物質(zhì)和抗壞血酸均具有一定的DPPH·清除能力，但弱于同濃度的VC。刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·的清除能力在考察濃度1～5 mg·mL-1范圍內(nèi)，抗氧化能力隨樣品溶液濃度的升高逐漸增強(qiáng)，當(dāng)樣品溶液濃度為5 mg·mL-1，清除率為81.11%。通過SPSS軟件計(jì)算得出VC和刺玫果花色苷對(duì)DPPH·清除能力的IC50值分別為0.270和2.299 mg·mL-1，結(jié)果進(jìn)一步表明刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·具有一定的清除能力。

圖10 DPPH自由基清除率的測(cè)定Fig.10 Determination of DPPH free radical scavenging rates

2.7.2 刺玫果中花色苷對(duì)超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子自由基是機(jī)體內(nèi)壽命最長(zhǎng)的自由基，在一定條件下可生成羥自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物及單線態(tài)氧等其他活性氧，從而造成機(jī)體的氧化損傷[32]。如圖11所示，刺玫果中花色苷物質(zhì)和抗壞血酸均具有一定的超氧陰離子自由基清除能力，且強(qiáng)于同濃度的VC。刺玫果花色苷提取物在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，經(jīng)SPSS軟件計(jì)算得刺玫果花色苷提取物和VC溶液的IC50值分別為1.902和2.607 mg·mL-1。由此可見，刺玫果花色苷提取物對(duì)超氧陰離子具有較強(qiáng)抗氧化能力。

圖11 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定Fig.11 Determination of O2－free radical scavenging rates

2.7.3 刺玫果中花色苷對(duì)ABTS+·的清除能力ABTS在K2S2O8作用下可被氧化成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時(shí)，ABTS+·與之反應(yīng)變成沒有顏色的的ABTS，因此ABTS法可用于檢測(cè)樣品的抗氧化能力[33]。圖12表明，刺玫果花色苷提取物和VC均具有一定的清除ABTS+·能力，刺玫果花色苷清除ABTS+·能力弱于同濃度時(shí)的VC溶液。刺玫果花色苷提取物和VC的IC50值分別為8.993和1.314 mg·mL-1。因此表明，刺玫果花色苷提取物對(duì)ABTS+·具有極好的清除能力。

圖12 ABTS+自由基清除率的測(cè)定Fig.12 Determination of ABTS+ free radical scavenging rates

3 結(jié)論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)及Placket-Burman設(shè)計(jì)對(duì)影響刺玫果花色苷提取的因素進(jìn)行篩選，并結(jié)合Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定刺玫果中花色苷最佳提取條件為：采用HCl調(diào)節(jié)溶液pH為2的60%乙醇作為提取溶劑，料液比1:15 g·mL-1，超聲溫度為50 ℃，超聲時(shí)間30 min，提取2次，在此工藝條件下得出刺玫果中花色苷得率為185.033 mg·100g-1。實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，可作為從刺玫果中提取花色苷的工藝方法。此外，體外抗氧化能力研究結(jié)果表明，刺玫果中花色苷對(duì)DPPH·、超氧陰離子自由基、ABTS+·均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，IC50值均小于10 mg·mL-1，提示刺玫果中花色苷物質(zhì)具有一定的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為刺玫果資源的開發(fā)利用及后續(xù)抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供了一定的參考依據(jù)。