微波輔助提取辣木籽總苷工藝優化及其抗氧化活性研究

湯興楠，欒凱文，王榮香，任 帥，張萬忠，朱建星

（沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽 110142）

辣木籽（Moringa oleiferaLam. seeds）是辣木樹的種子，呈球形，外殼呈淺棕色，籽呈乳白色，直徑約為1 cm，具有較高的營養價值，每100 g辣木籽中約有9.98～51.80 g粗蛋白質、17.26～20.00 g粗纖維、3.36～18.00 g碳水化合物、38.67～43.60 g脂肪和3.60～5.00 g礦物質[1-2]。辣木籽含有大量生物活性物質，辣木籽油可替代橄欖油作為高級食用油[3-4]，辣木籽粨可作為動物飼料，其有效部位提取物可應用于實際生活中，如日常洗護產品、化妝品、凈水劑[5-6]、食品營養強化劑等，因此辣木籽成為了國內外學者的研究熱點。楊迎[7]發現脫脂辣木籽粉中總苷含量為22.23 mg/g，康榮強[8]通過傳統回流提取法從辣木籽中分離出了苯乙醇苷類化合物、苯酚苷類化合物、核苷類化合物以及黃酮苷類化合物。辣木籽是一種潛在的抗病毒[9]、抗癌[10]、抗炎[11-12]、抗氧化[13-14]、抗糖尿病和抗菌藥物[15-16]，Dhakad等[17]發現這些生物活性與辣木籽中的黃酮苷和硫代葡萄糖苷等物質有關，同時辣木籽具有解酒[18]、護肝、降血糖血脂[19-22]等功效。

目前關于辣木籽總苷提取工藝優化研究較少，且提取工藝多為傳統提取法，然而傳統提取工藝耗時長，溶劑用量大，提取成本高。為提高辣木籽總苷提取得率，本試驗采取微波輔助的方式提取辣木籽中的苷類物質，以總苷含量為評價指標，通過單因素和響應面設計試驗，優化辣木籽總苷提取工藝。近幾年天然產物抗氧化活性成為學者們的研究熱點，而且許多植物的藥效作用都與其抗氧化性有關。目前關于辣木籽提取物抗氧化活性研究多局限于辣木籽中的某單一成分，對辣木籽中抗氧化物質挖掘不夠深入，因此本試驗用不同極性的溶劑對辣木籽醇提物進行萃取，將活性物質富集到各極性溶劑中，比較辣木籽醇提物各極性部位對自由基的清除能力，篩選對自由基清除效果最佳部位，以期為進一步篩選出抗氧化活性物質和深度開發辣木籽奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木籽 云南文山市；香草醛 山東西亞化學工業有限公司；齊墩果酸對照品 上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、甲醇、冰乙酸 均為分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；高氯酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、三氯化鐵 天津市永大化學試劑有限公司；30%過氧化氫 遂成藥業股份有限公司；2,2-聯氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+·）、過硫酸鉀、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ） 武漢安格思生物科技有限公司。

DZG-6050SA型真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；小型高速粉碎機 北京興時利和科技發展有限公司；GB1302型電子精密天平 梅特勒托利多儀器公司；Synergy2多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；立式高速冷凍離心機CR22GⅢ 日本日立有限公司；HH4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RE-6000型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；高通量密閉微波消解系統MARS6 Xpress NP-1187B 美國CEM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木籽總苷含量測定

1.2.1.1 標準曲線制備 取10 mg齊墩果酸標準品用甲醇溶液溶解，配制成1 mg/mL的對照樣品溶液，用移液槍分別取齊敦果酸對照品溶液40、60、80、100、120、140 μL于試管中，揮干溶劑，采用香草醛-冰乙酸和高氯酸顯色法[23]，在548 nm波長下進行吸光度測定，以吸光度（y）為縱坐標、對照品的質量（x）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.1.2 總苷提取量測定 篩選出優質去殼辣木籽，在40 ℃的真空干燥箱中干燥，粉碎過篩（40目），制成辣木籽粉。

供試樣品溶液的配制，準確稱取1.0 g辣木籽粉在乙醇體積分數81%，料液比1：30 g/mL，提取時間20 min，微波功率600 W，提取溫度70 ℃的條件下，進行乙醇微波輔助提取，提取液過濾，旋轉蒸發濃縮得到辣木籽提取物，用適量甲醇溶解提取物，6000 r/min離心10 min，取上層清液定容于25 mL容量瓶。

辣木籽總苷含量測定，吸取供試樣品溶液100 μL按1.2.1.1節進行樣品吸光度測量，將吸光度帶回標準曲線回歸方程計算出供試樣品濃度，按公式（1）計算出辣木籽中總苷提取量。

式中：C為供試樣品濃度，mg/mL；V為供試樣品體積， mL；M為辣木籽粉質量，g。

1.2.2 單因素實驗 本試驗在乙醇體積分數80%、料液比為1:30 g/mL、提取時間為20 min、微波功率600 W的條件下，分別考察乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40 g/mL）、提取時間（10、20、30、40 min）、微波功率（400、500、600、700、800 W）某單一因素對總苷提取量的影響。

1.2.3 響應面試驗 為優化辣木籽總苷提取工藝，進行Box-Behnken實驗設計，在單因素實驗確定的最佳條件下，選取乙醇體積分數（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波時間（D）這四個因素進行響應面優化，分別用-1、0、1代表不同的水平，以總苷提取量（Y）為響應值，各因素水平的設計見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.2.4 辣木籽提取物不同極性部位體外抗氧化能力測定

1.2.4.1 辣木籽提取物不同極性部位制備 取適量的辣木籽提取物，等比例溶于蒸餾水中，將水溶液與石油醚等比例混合至于分與漏斗內，震蕩15 min，靜置，待溶液分層后取上層石油醚層備用。萃取3次，合并石油醚層，45 ℃旋轉蒸發減壓濃縮得到辣木籽醇提物石油醚相。將石油醚萃取后的下層水溶液用乙酸乙酯按上述操作萃取3次，合并上層乙酸乙酯層，40 ℃旋轉蒸發減壓濃縮得到乙酸乙酯相。將乙酸乙酯萃取后的下層水溶液用水飽和后的正丁醇按上述操作萃取3次，合并上層正定醇層，50 ℃旋轉蒸發減壓濃縮得到正定醇相，經正丁醇萃取后的水溶冷凍干燥，得到粉末狀態辣木籽提取物水部位。

1.2.4.2 辣木籽醇提物不同極性部位對羥自由基清除能力測定 準確稱量不同極性部位的辣木籽提取物和VC，配制成濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的樣品溶液和濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL陽性對照VC溶液。在試管中分別加入1.0 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）、辣木籽提取液和H2O2（8.8 mmol/L），室溫放10 min，最后加1.0 mL水楊酸溶液，充分搖勻，37 ℃水浴30 min，冷卻離心。在510 nm處測量吸光度值。根據公式（2），計算辣木籽提取物不同極性部位的羥自由基清除能力，以VC對羥自由基清除率和VC濃度繪制標準曲線。標準曲線方程為：Y=94.534X+42.304（R2=0.9918）樣品清除結果以每克干樣所含抗壞血酸當量（mg/g）來表示。

式中：A0為對照組吸光度（H2O代替樣品）；A1為樣品組吸光度；A2為空白對照組吸光度（H2O代替H2O2）。

1.2.4.3 辣木籽醇提物不同極性部位對ABTS+·清除能力測定 參考Moyo等[24]的方法，略有改動：將7 mmol/L ABTS溶液與2.4 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫避光的條件下反應16 h，即得ABTS+·儲備液，使用前用無水乙醇稀釋直至其在波長734 nm處吸光值為0.70±0.01。1 mL樣品溶液（2、4、6、8、10 mg/mL）加到3.0 mL ABTS+·溶液中，避光反應30 min后，于734 nm波長處測定吸光度。根據公式（3），計算辣木籽提取物不同極性部位的ABTS+·清除能力，以VC對自由基清除率和VC濃度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）繪制標準曲線。標準曲線方程為：Y=1201.2X+39.3（R2=0.9916）樣品清除結果以每克干樣所含抗壞血酸當量（mg/g）來表示。

式中：A1為樣品組吸光度；A0為空白組吸光度（H2O代替樣品）。

1.2.4.4 辣木籽醇提物不同極性部位還原能力測定參考楊迎等[20]方法略有改動。300 mmol/L乙酸鈉緩沖溶液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3按照10:1:1的體積比配制TPTZ工作液。取1 mL樣品溶液（2、4、6、8、10 mg/mL）于試管中，加入3 mL TPTZ工作液，搖勻，37 ℃條件下水浴10 min，在593 nm波長處測量吸光度。以吸光度和VC濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）繪制標準曲線。標準曲線方程為：Y=6.4725X+0.1830（R2=0.9928）樣品清除結果以每克干樣所含抗壞血酸當量（mg/g）來表示。

1.3 數據處理

單因素試驗與羥自由基清除率試驗，均做三組平行試驗，用軟件Origin 8.0繪圖。響應面試驗運用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元二次回歸方程擬合、方差分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

通過香草醛-冰乙酸和高氯酸顯色法，在548 nm的波長下，齊墩果酸質量與吸光度呈正相關?；貧w方程為：Y=6.0048X+0.0902（R2=0.9992），齊墩果酸在0.02～0.14 mg線性關系良好。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對辣木籽總苷提取量的影響乙醇體積分數對辣木籽總苷提取量的影響見圖1，由圖1可知，當乙醇體積分數逐漸增大時，辣木籽總苷提取量呈現先升高后降低的趨勢。當乙醇分數為80%時，辣木籽醇提液中苷類物質含量最高，當乙醇體積分數大于80%時，提取液中總苷含量開始下降，可能是乙醇體積分數增大，溶劑極性減小，增大了油脂及色素溶出幾率[25-26]，然而大量得油脂溶出影響苷類物質的溶出，總苷含量逐漸降低，所以在其它因素不變得情況下，乙醇體積分數為80%時，總苷提取量最高。

圖1 乙醇體積分數對總苷提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction of total glycosides

2.2.2 料液比對辣木籽總苷提取量的影響 料液比對總苷提取量的影響如圖2所示，由圖2可知，總苷提取量隨料液比的增大呈現先增大后減小的趨勢。其原因是初始料液比較小，不利于苷類物質溶出，當料液比逐漸增大時，增大了流固相間的濃度差，加快了分子擴散速率，有利于苷類物質溶出[27]，但過大的料液比會造成除苷類化合物外的其他成分的溶出，降低了苷類化合物在提取物中的占比，也可能因料液比過大導致微波熱能負荷增大，溶劑競爭吸收微波能量改變提取的溫度環境，不利于苷類的溶出[28]。當料液比為1:30 g/mL時，總苷提取量最高，即為最優取條件。

圖2 料液比對總苷提取量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction of total glycosides

2.2.3 微波功率對辣木籽總苷提取量的影響 微波功率對總苷提取量的影響見圖3，由圖3可知，總苷提取量隨微波功率增大呈現先上升后下降的趨勢，因為微波功率增大，物料吸收的微波能越多，細胞內傳質阻力越小，總苷溶出的幾率越大。微波功率過大，導致溫度變化過快，溶劑容易爆沸，進而影響提取效果，同時，微波功率過大容易導致辣木籽內部結構固化，出現內部組織凝固現象，進而影響苷類物質溶出[29-31]。綜合考慮，選取微波功率為600 W。

圖3 微波功率對總苷提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction of total glycosides

2.2.4 微波時間對辣木籽總苷提取量的影響 微波時間對總苷提取量的影響見圖4，由圖4可知，隨著時間的增加，總苷的提取量先增加后減少，這是由于微波時間越長，對細胞膜的破壞程度越大，同時隨著微波時間的增加，溶液溫度不斷升高，樣品內分子的運動速度加快，有利于苷類物質的溶出，但苷類物質受熱不穩定，加熱時間越長，總苷含量越低，另一方面，輻射時間過長可能會破壞苷類物質的結構[32-34]。當提取時間為20 min時，總苷提取量最高，即為最優取條件。

圖4 微波時間對總苷提取量的影響Fig.4 Effect of microwave time on extraction of total glycosidess

2.3 響應面試驗結果

采用Box-Behnken設計試驗，以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波時間（D）為自變量，辣木籽總苷提取量為因變量，建立4因素3水平響應面優化提取工藝，響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計和試驗結果Table 2 Response surface test design and test results

2.3.1 回歸模型建立方差分析 通過Design-Expert軟件對29組數據進行分析得到方差分析表3，對表2試驗數據擬合得到多元二次回歸方程。多元二次回歸方程為：Y=32.14+1.45A-0.87B+0.31C-0.47D-0.1AB-0.21AC-0.099AD-2.16BC+0.25BD+0.17CD-4.49A2-6.81B2-4.20C2-6.36D2。

由表3可知，模型F值為30.47，模型P＜0.0001（差異極顯著），失擬項P=0.8287＞0.05（差異不顯著），說明其他因素對試驗結果影響比較小，模型決定系數R2=0.9682，表明模型吻合度好。綜上所述，模型建立成功。根據F值可知各因素對辣木籽總苷提取量影響順序為乙醇體積分數（A）＞料液比（B）＞微波時間（D）＞微波功率（C）；根據P值可知A、BC、A2、B2、C2、D2對辣木籽總苷提取量影響極顯著，因素B對辣木籽總苷提取量影響顯著。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Regression model analysis of variance

2.3.2 各因素之間交互作用 通過Design-Expert軟件繪制響應面，通過三維曲面圖陡峭程度以及等高線圖的橢圓程度來判斷各因素間的交互作用。各因素交互作用的響應面見圖5，其中料液比和微波功率之間的交互作用對辣木籽總苷提取量的影響大；而圖5E的圓形等高線圖呈現圓形，說明微波時間與料液比之間的交互作用對辣木籽總苷提取量影響不顯著。

圖5 各因素交互作用的響應面Fig.5 Response surface of the interaction of various factors

2.3.3 最佳提取條件及驗證實驗 回歸方程由Design-Expert 8.0.6軟件得出，通過計算得到辣木籽總苷最佳提取條件：乙醇體積分數81%，料液比1:29.63 g/mL，微波功率602.56 W，微波時間19.81 min，總苷提取量為32.31 mg/g。實際操作條件設定為乙醇體積分數81%，料液比1:30 g/mL，微波功率600 W，微波時間20 min，進行三次驗證實驗，總苷提取量分別為31.15、32.48、31.56 mg/g，平均總苷含量為31.73 mg/g，與理論值接近，說明該制備方法具有一定的實際可操作性。

2.4 辣木籽醇提物各極性部位自由基清除率試驗結果

本試驗通過水楊酸法、ABTS法測定辣木籽醇提物不同極性部位自由基清除能力，FARP法測定其還原力，多角度評價其體外抗氧化活性，試驗結果見表4。由表4可知，三種體外抗氧化活性測定均表明乙酸乙酯層相抗氧化活性最佳。辣木籽各極性部位抗氧化活性順序：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位，這一結果可能與各部位所含黃酮類、酚類、苷類物質有關，楊迎[7]測得辣木籽醇提物乙酸乙酯層總黃酮含量為1.75±0.18 mg/g、總酚含量為13.86±0.29 mg/g、總苷含量27.04±3.49 mg/g，均高于其他萃取部位，所以辣木籽提取物乙酸乙酯部位具有較高的抗氧化活性。

表4 辣木籽醇提物各極性部位抗氧化活性結果Table 4 Results of antioxidant activities of ethanol extracts from Moringa oleifera seeds with different polarity

2.4.1 辣木籽醇提物各極性部位對羥自由基清除能力 由圖6可知辣木籽乙酸乙酯部位、石油醚部位、正丁醇部位、水部位均有清除自由基的能力，隨著樣品濃度的增加，各部位清除羥自由基的能力也隨之增加。與維生素C對比，當樣品濃度為25 mg/mL時，乙酸乙酯部位清除效果最佳，清除率為73.87%±1.12%，石油醚部位清除效果次之，清除率為67.16%±0.638%，正丁醇部位清除為61.37%±0.91%，相當于濃度為0.34、0.26、0.21 mg/mL維生素C對羥自由基的清除效果，水部位清除率較低為31.11%±1.00%。

2.4.2 辣木籽醇提物各極性部位對ABTS+·清除能力由圖7可知，辣木籽提取物各極性部位對ABTS+·均有清除效果，清除效果與樣品濃度呈現正相關性，當樣品濃度為10 mg/mL時，乙酸乙酯部位清除率76.29%±0.84%、石油醚部位清除率71.36%±0.90%、正丁醇部位清除率63.85%±1.20%，與濃度為0.05、0.03、0.02 mg/mL的維生素C溶液清除效果相當，各極性部位清除效果均低于維生素C。水部位清除效果較低為46.85%±0.79%。ABTS+·是一種以氮原子為中心的自由基，當ABTS與K2S2O8反應產生藍綠色的ABTS+·，抗氧化劑的加入抑制ABTS+·生成，從而達到清除自由基的效果。從圖7可以看出乙酸乙酯部位對ABTS+·抑制效果好，為最佳自由基清除部位，為進一步分析其抗氧化成分奠定基礎。

圖7 辣木籽提取物各極性部ABTS+·清除能力Fig.7 ABTS+· scavenging ability of the polar parts of Moringa oleifera seeds extract

2.4.3 辣木籽醇提物各極性部位還原能力 研究表明天然產物的抗氧化能力與還原力呈正相關，吸光度越大則說明其抗氧化能力越強。由圖8可知，辣木籽提取物各極性部位均有一定的還原力，當樣品濃度為10 mg/mL時，乙酸乙酯部位還原力為0.749±0.053、石油醚部位還原力0.667±0.038、正丁醇部位還原力0.509±0.014、水部位還原力0.413±0.001，與濃度為0.087、0.075、0.050、0.038 mg/mL的維生素C溶液還原力相當。從圖8可以看出各部位抗氧化能力順序為：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位。

圖8 辣木籽提取物各極性部位還原能力Fig.8 Reductive ability of the polar parts of Moringa oleifera seeds extract

3 結論

本試驗采用微波輔助法提取辣木籽中的苷類物質，利用紫外分光光度計測定辣木籽總苷提取量，通過Box-Behnken設計試驗建立響應值與多個因素間的函數關系，評價各因素間的交互作用，更好地確定試驗的最優條件。得到最優提取條件：乙醇體積分數81%，料液比1:30 g/mL，微波溫度時間20 min，微波功率600 W，在此條件下辣木籽總苷提取量為31.73 mg/g，與模型預測的總苷提取量相吻合，認為此次試驗模型的設計是可行的。通過體外抗氧化試驗得出辣木籽提物各極性部位具有抗氧化活性，但清除效果均低于維生素C，3種測定方法均表明乙酸乙酯部位相對于其他部位具有較好的抗氧化性。因此本試驗為高效提取辣木籽中的苷類物質和進一步研究辣木籽中抗氧化活性物質提供理論依據。