單核細胞增生李斯特菌在典型食品接觸表面的存活建模研究

劉陽泰，胡麗麗，白 莉，王曄茹，董慶利，王彝白納,

（1.上海理工大學，上海 200093；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種兼性厭氧的革蘭陽性桿菌，可在低溫、高鹽與低酸等環境下生長存活[1]。該菌可通過污染肉制品、奶制品、即食食品等進行傳播，對于孕婦、嬰幼兒及免疫力低下人群具有較高的致病性，是目前危害公眾健康的主要食源性致病菌之一[2]。

我國監測結果表明，家庭、餐館和食堂是食源性疾病事件發生最常見的場所[3]。通過采樣分析發現，廚房器具設備，如案板、水槽、冰箱等各類表面的微生物污染情況較復雜，其中包含單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種病原微生物[4-5]。因此，食源性致病菌可能存活定殖于廚房的食品接觸表面，再因食物處理者操作不當，導致污染表面與食物接觸發生再污染或交叉污染，從而增加發生食源性疾病的風險[6-9]?；诖?，近年圍繞病原體在剛性表面存活情況的研究逐漸增多，主要集中在致病菌的種群數量及抗逆性變化等方面[10-12]。針對單核細胞增生李斯特菌，目前已知決定或影響其接觸表面生理生態情況的因素主要包含菌株類型、環境溫濕度、營養狀態等[13-15]。同時，部分學者觀測發現，接觸表面材質的類型，可能也是影響單核細胞增生李斯特菌及其他病原體存活能力的重要因素之一[16-18]。因此，有必要開展單核細胞增生李斯特菌在不同材質接觸表面的存活情況對比觀測和建模研究。

本研究選取7種家庭廚房典型食品接觸材質，即不銹鋼、木、鋁、玻璃、聚丙烯塑料、PMMA塑料（又稱亞克力）、ABS塑料，探究單核細胞增生李斯特菌在4 ℃（冷藏）和25 ℃（室溫）條件下的存活能力，并應用線性模型對單核細胞增生李斯特菌的存活過程進行定量描述和比較。該研究旨在為解釋單核細胞增生李斯特菌的污染持久性提供科學依據，為精準量化單核細胞增生李斯特菌的暴露可能性提供基礎參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單核細胞增生李斯特菌菌株（L. monocytogenesATCC 7644） ST122/CC9型，上海帆研生物科技有限公司；含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar with Yeast Extract，TSA-YE）、含 0.6% 酵母膏的胰酪胨大豆肉湯（Tryptic Soy Agar with Yeast Extract Broth，TSB-YE） 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；氯化鈉、乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；木片、304不銹鋼片、鋁片、玻璃片、聚丙烯片、ABS片、亞克力片 尺寸均為1.4 cm×1.2 cm×0.1 cm，定制購于淘寶。

JJ500型電子天平 江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；SW-CJ-1FD型無菌操作臺 江蘇蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ-LS-SⅡ型高壓滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HWS-150型恒溫恒濕培養箱 上海比朗儀器有限公司恒溫恒濕培養箱；THZ-103B型恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司；XW-80A旋渦混合儀 上海精科實業有限公司；WAECO-CF50型松下冰箱 美國電子（深圳）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備 本研究所用的單核細胞增生李斯特菌實驗菌株保存于-80±0.5 ℃的甘油管中，于實驗前48 h在TSB-YE培養基進行平板劃線，并置于4.0±0.5 ℃備用。實驗前，用無菌接種環從TSA-YE培養基上挑取一單菌落，接種于TSBYE培養基，放置于37 ℃、110 r/min的搖床上培養16～18 h至穩定期。使用無菌生理鹽水稀釋，獲得初始濃度為104～105CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 接觸表面無菌處理 將304不銹鋼片、鋁片和玻璃片浸泡于丙酮中3 h，并用廚房餐紙逐一擦拭干凈，去除表面的油脂以及其他雜質。隨后用無水乙醇溶液浸泡過夜，蒸餾水洗滌干凈密封備用。實驗前放入高壓滅菌鍋121 ℃，滅菌15 min。

將木片、聚丙烯片、ABS片及亞克力片用無菌水洗滌干凈后，用無水乙醇浸泡3 h，隨后放置于超凈工作臺內紫外線照射30 min，以達到無菌效果。

1.2.3 種群存活情況測定 用無菌鑷子將滅菌后的材質放置于24孔板中，吸取0.1 mL上述備用菌懸液涂抹于材質表面，置于超凈工作臺中靜置2 h后（記為零時刻），分別放置于25±0.5、4±0.5 ℃培養箱中進行培養，未接菌材質作為對照組。根據預試驗，為滿足模型參數估計的準確性，依次按0、2、4、10、22、46 h時刻點取樣，開展平板計數實驗。

當到達取樣時間點時，用無菌鑷子將材質從24孔板中取出，置于含有玻璃珠與無菌生理鹽水的離心管中，充分振蕩渦旋1 min，使菌體脫落并懸浮于生理鹽水中。隨后進行梯度稀釋，選取合適梯度進行平板計數，菌量結果以lg CFU/cm2為單位比較。每組實驗3次平行，重復3次。

1.2.4 存活動力學模型構建 預實驗結果發現，不同材質表面單核細胞增生李斯特菌的群體密度下降曲線接近線性，因此選取Bigelow模型對其存活過程進行描述[19]。

式中：y（t）是t時刻（h）菌量，lg CFU/cm2；y0是初始菌量，lg CFU/cm2；D即D值，是將微生物殺滅90%所需時間，h。

1.2.5 統計分析與模型評價 應用Prism軟件（版本8.0.2，GraphPad Software，加拿大）進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用于比較在0.05顯著性水平下不同溫度或材質條件對單核細胞增生李斯特菌的存活能力差異。同時，應用Prism軟件擬合不同處理條件下單核細胞增生李斯特菌的存活曲線，通過計算觀測值和擬合值的均方根誤差[20]（Root Mean Square Error，RMSE）和決定系數（Coefficient of Determination，R2）進行模型評價。

2 結果與分析

2.1 典型食品接觸表面單核細胞增生李斯特菌的種群存活情況

本研究對接種于不同材質表面2 d內的單核細胞增生李斯特菌種群密度進行了測定，通過計算最后可計數時間點與初始時間點菌量的差值，量化存活情況。其中，未接種對照組無單核細胞增生李斯特菌檢出。圖1展示了單核細胞增生李斯特菌在不同溫度和材質表面組合條件下持留一定時間后的活菌數減少量，活菌數減少量越少，表明該條件下單核細胞增生李斯特菌的存活能力越強。需要說明的是，由于木材質的浸潤性特征，其表面水分會迅速浸濕揮發，單核細胞增生李斯特菌在4和25 ℃條件下的木片表面均出現了快速失活現象，而在其他材質表面存活時間則較長，因此需將木片條件結果獨立展示和分析。

從圖1A可知，單增李斯特在木材質表面25 ℃條件下4 h減少量已近1 lg CFU/cm2，超過了同溫度條件下玻璃片和聚丙烯片表面46 h的減少量，表明在本研究中木材質表面最不利于單增李斯特菌的存活。比較圖1B中的材質發現，單核細胞增生李斯特菌在4 ℃條件下的塑料類材質（ABS、聚丙烯和亞克力）表面存活能力較強，且其在聚丙烯片表面的存活能力顯著強于在鋁片表面（P＜0.05）；在25 ℃條件下，玻璃表面上單核細胞增生李斯特菌的存活能力則顯著強于金屬（不銹鋼和鋁）和聚丙烯材質（P＜0.05）。然而，經過46 h后，兩種溫度條件下圖1B中不同表面的單核細胞增生李斯特菌種群對數減少量均未超過2 lg CFU/cm2。

圖1 單核細胞增生李斯特菌在木片（A）及其他材質（B）表面的存活情況Fig.1 Survival of L. monocytogenes on wood chips (A) and other surfaces (B)

總體比較發現，單核細胞增生李斯特菌在4 ℃下的整體存活表現接近或強于25 ℃條件，一定程度反映了其嗜冷特性。同時，推測冷藏條件材料表面水分損耗的減少，亦有助于降低單核細胞增生李斯特菌的損傷，從而延長了其存活期。進一步，為定量描述和比較不同溫度和材質組合條件下單核細胞增生李斯特菌的存活能力，需對其存活過程開展動力學分析。

2.2 典型食品接觸表面單核細胞增生李斯特菌的種群存活動力學分析

實驗發現，部分材質表面的單核細胞增生李斯特菌的種群密度出現了上下波動現象，但整體仍呈現出線性下降的趨勢（見圖2～圖3）。通過擬合4和25 ℃下單核細胞增生李斯特菌在不同材質表面的存活曲線，獲得的參數估計和模型評價結果羅列于表1。D值越大，說明單核細胞增生李斯特菌失活1 lg CFU/cm2所需要的時間更長，即存活能力越強。

表1 單核細胞增生李斯特菌在典型食品接觸表面的存活模型擬合結果Table 1 Fitting results of L. monocytogenes survival model on typical food contact surfaces

圖2 4 ℃條件下單核細胞增生李斯特菌在木片（A）、不銹鋼片（B）、鋁片（C）、ABS片（D）、玻璃片（E）、聚丙烯片（F）和亞克力片（G）表面的存活曲線擬合Fig.2 Survival curve fitting of L. monocytogenes on wood chips （A）, stainless steel chips （B）, aluminum chips（C）, ABS chips （D）,glass chips （E）, polypropylene chips （F） and acrylic chips （G） at 4 ℃

圖3 25 ℃條件下單核細胞增生李斯特菌在木片（A）、不銹鋼片（B）、鋁片（C）、ABS片（D）、玻璃片（E）、聚丙烯片（F）和亞克力片（G）表面的存活曲線擬合Fig.3 Survival curve fitting of L. monocytogenes on wood chips (A), stainless steel chips (B), aluminum chips (C), ABS chips (D),glass chips (E), polypropylene chips (F) and acrylic chips (G) at 25 ℃

結果表明，木材質表面單核細胞增生李斯特菌在4 ℃的單位減少量用時是25 ℃的8.75倍；4 ℃條件下，單核細胞增生李斯特菌在聚丙烯片表面的D值超過300 h，說明其可在冷藏環境相關食品接觸表面存活數天甚至數周；25 ℃條件的玻璃表面，單核細胞增生李斯特菌的D值也達到了接近100 h，進一步提示該菌在污染玻璃材質的食品接觸表面后，如玻璃容器等，其可能具有更高的機率長期持留或發生交叉污染。

結合圖2、圖3和表1可發現，雖然線性模型可一定程度上描述單核細胞增生李斯特菌種群密度在不同溫度與材質組合條件下的整體下降趨勢，但大部分擬合模型的R2均偏低，值得進一步探討其可能原因。根據表1結果，Y0的標準誤約為0.1 lg CFU/cm2，擬合結果的RMSE也在0.08～0.33 lg CFU/cm2區間，說明本研究平板計數實驗誤差和擬合誤差在可接受的范圍內[21-22]。一方面，從圖2～圖3可直觀看出，部分觀測點單核細胞增生李斯特菌種群數量結果的標準差較大，這可能與其在不同接觸面存在生物膜的形成與釋放過程相關[23]。另一方面，通過計算不同組合條件下D值參數估計的相對誤差，即標準誤與估計值的比值[24]?？砂l現D值參數估計的相對誤差與R2呈現反比現象，即相對誤差越高，擬合優度越差。換言之，單核細胞增生李斯特菌種群D值的變異性可能影響了模型的擬合優度。4 ℃條件下ABS片、聚丙烯片和亞克力片表面單核細胞增生李斯特菌的存活D值估計結果相對誤差（約30%）較木片、玻璃和金屬類材質更高，可推斷單核細胞增生李斯特菌在冷藏條件塑料類材質表面群體存活的變異性相對更大。因此，在未來定量風險評估工作中，需要采用概率評估方法描述相關場景下單核細胞增生李斯特菌的行為特征與潛在危害。

3 討論與結論

目前，針對不同材質與環境組合條件下食源性致病菌的生存過程，仍缺少全面的橫向比較研究與因果解釋說明。關于食源性致病菌在食品接觸表面的生存預測建模研究，則主要集中于不銹鋼材質表面的情況[25-27]。如前述，在外部因素中，環境溫濕度、接觸表面材質、營養狀態等可能是影響食源性致病菌生存狀態的關鍵因素。

例如，Matthew等[28]發現產氣腸桿菌在7 ℃條件下的不銹鋼、聚氯乙烯、陶瓷表面比在15 ℃條件下相同表面的存活時間更長，與本研究關于冷藏條件整體更利于單核細胞增生李斯特菌存活的結果相符。這也從側面說明了冰箱、冰柜等冷藏設備，可能為食源性致病菌的長期存活提供了重要場所，并具備成為食源性致病菌交叉污染源頭的條件。同時，在所有材質中，單核細胞增生李斯特菌在玻璃和塑料類材質表面表現出了較強的生存能力，這與Silva等[16]對單核細胞增生李斯特菌在不同材質表面黏附能力的比較研究結果相符。因此，玻璃和塑料作為食物承裝容器、食品包裝和家用冰箱的典型材料，其表面的微生物安全性值得未來深入關注。

對于不同材質影響單核細胞增生李斯特菌生存能力的根本原因和機制，目前尚未有完備的理論體系可清晰闡釋，但可能與材質的親疏水性、浸潤性、粗糙度等材料理化特征相關[29-31]。Allan等[17]研究了沙門菌屬、小腸結腸炎耶爾森菌在不銹鋼、樹脂、塑料表面的存活過程，發現細菌更易在疏水性材料表面黏附和長期存活。如本研究中使用的木材質是一種多孔且親水性較強的材料，觀測到其明顯不利于單核細胞增生李斯特菌的存活。相對于木材質，單核細胞增生李斯特菌菌懸液則可在疏水性相對較高的玻璃、塑料和金屬類材質表面形成較小直徑的液滴，且水分蒸發速率較慢，在一定時期內為菌體創造了相對濕潤的環境，促進了種群的長期存活[25]。因此，可認為本研究中單核細胞增生李斯特菌在7種材質表面的存活表現差異也與材質表面的理化特性相關。

雖然本研究未對不同營養條件下單核細胞增生李斯特菌的生存能力進行比較，但Takahashi等[32]指出單核細胞增生李斯特菌更易存活于有魚肉和豬肉基質的不銹鋼表面，且整體生存能力顯著強于鼠傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌。在食品的加工、供應及消費等環節，可能存在食物殘留情況，在此條件下單核細胞增生李斯特菌可獲得更多營養物質，其種群存活能力較本研究的寡營養條件下可能更強。因此，真實食品基質對致病菌的存活影響仍待探究，在未來研究中應繼續建立不同營養條件下單核細胞增生李斯特菌在食品接觸表面的生存動力學模型。

此外，黏附在食品接觸表面的單核細胞增生李斯特菌還能進一步形成生物膜（Biofilm），成為可抵御苛刻環境條件的持續污染源[33-34]。同時，單核細胞增生李斯特菌通過交叉污染，在不同生態位間的動態傳遞，可能在更適宜生存的食品接觸表面黏附定殖[35]。因此，應在考量溫度、營養和表面材質等組合環境條件的基礎上，進一步對食品接觸表面和食品接觸表面間轉移的單核細胞增生李斯特菌開展定量觀測，綜合探究其在食品鏈中的生存行為規律。

綜上，本文觀測和定量分析了單核細胞增生李斯特菌在4和25 ℃條件下7種典型食品接觸材質表面的存活過程。比較發現，單核細胞增生李斯特菌在冷藏環境下的不銹鋼、木、鋁、聚丙烯、亞克力材質表面的存活能力較室溫環境下顯著增強，可能在聚丙烯塑料表面持留數周。綜合兩種溫度條件實驗和建模結果，單核細胞增生李斯特菌在玻璃和聚丙烯表面的存活能力較強，應重點關注相關材質食品接觸表面的微生物安全問題。同時，本研究所建立的線性模型可用于描述單核細胞增生李斯特菌種群在不同材質表面的存活趨勢，但仍需在未來研究和實際應用中考慮微生物的生物膜形成過程和種群變異性對預測結果造成的影響。