基于近紅外光譜技術對小麥中毒死蜱農藥殘留測定方法的研究

馮 鎮(zhèn)，劉 馨，張 震，任雙鶴，郭增旺，郭亞男，殷 東，郭麗媛，王中江,

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.深圳中檢聯(lián)檢測有限公司，廣東深圳 518110；3.黑龍江譜尼測試科技有限公司，黑龍江哈爾濱 150028）

小麥是世界三大糧食作物之一，也是我國最主要的糧食作物之一[1]。目前，我國小麥總產量已經(jīng)占到我國糧食總產量的50%以上[2]。在種植環(huán)節(jié)，常采用化學防治法即農藥防治病蟲害以提高小麥的單產[3]，但也發(fā)生了農藥的超量使用、濫用等現(xiàn)象[4]，因此，對小麥中農藥殘留的檢測就成為把控糧食質量安全的關鍵[5]。目前最常用、最普遍的農藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜法-串聯(lián)質譜法等[6]。但是這些檢測技術在使用時，均需要復雜的前處理過程，且儀器設備昂貴，檢測時間過長，導致這些檢測方法均不能應用于大量樣品的現(xiàn)場快速檢測[7]。

近紅外光譜技術具有檢測時間短和檢測費用少等多方面的優(yōu)點，在食品領域，該技術的研究仍舊是一大熱點，近紅外光譜技術不僅可以應用在谷物成分含量的測定[8]，也可以對谷物農藥殘留進行定性和定量檢測。李敏[9]采用近紅外光譜技術對白菜的農藥殘留進行鑒別分析，結果表明近紅外光譜技術對白菜中的農藥殘留定性鑒別的判別率可達90%。Lourdes等[10]利用近紅外光譜技術檢測橄欖表面的農藥殘留，采用二階導數(shù)與多元散射校正處理近紅外光譜后建立模型，其判別率可達85.9%，結果表明，近紅外光譜技術可以實現(xiàn)農作物農藥殘留的快速檢測。劉凱[11]利用近紅外光譜技術檢測蔬菜中的農藥殘留，對光譜進行一階導數(shù)預處理，通過偏最小二乘法建立模型，其相關系數(shù)為0.8738，均方根誤差值為4.0352，實際值與預測值的相關系數(shù)也比較高，這表明該方法可對蔬菜中農藥殘留作出正確的定性及定量分析。朱心勇[12]利用近紅外光譜技術對蔬菜表面甲胺磷殘留進行檢測，采用一階導數(shù)為預處理方法，利用偏最小二乘法建立模型，其實際值與預測值的相關系數(shù)可達0.8476，均方根誤差為4.3740，表明該模型有較高的預測精度。這表明基于近紅外光譜技術對農作物農藥殘留進行檢測的新興檢測方法具有多方面的顯著優(yōu)勢，目前關于該方法結合化學計量學對農作物農藥殘留進行定性和定量檢測的研究相對較少，劉丕蓮[13]和紀煒達[14]分別在2014年和2016用近紅外光譜法測定了大米中毒死蜱農藥殘留，都能夠利用該方法在大米無損的情況下實現(xiàn)對毒死蜱農藥殘留量的準確檢測。毒死蜱是水稻種植過程中常用的農藥，關于該農藥檢測方法的研究多針對于大米，在實際生產過程中，小麥的種植過程中也常用毒死蜱[15]。

因此，本文研究以近紅外光譜技術結合化學計量學方法建立檢測小麥中毒死蜱農藥殘留的定性和定量判別方法，明確該方法對于除大米之外的谷物同樣適用，同時簡化樣品的前處理步驟，使檢測過程更加簡便快速，為糧食農藥殘留的快速準確鑒定提供新思路，從而為保證糧食質量安全提供強有力的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 黑龍江省糧食產業(yè)集團有限公司；毒死蜱標準品 純度99.5%，山東東合生物科技有限公司提供；乙酸乙酯 色譜純，天津市永大化學試劑有限公司。

TENSORⅡ型傅里葉變換近紅外光譜儀 德國布魯克（北京）科技有限公司；DL-380E超聲震蕩儀上海五湘儀器儀表有限公司；BSA224S電子天平湖南湘儀儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含毒死蜱農藥殘留的小麥樣品的制備 參考紀煒達[14]、嚴寒等[16]的方法，精確稱取50 mg毒死蜱標準品置于棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容后用超聲振蕩儀溶解，配制成濃度1000 mg/L的毒死蜱標準儲備液。用乙酸乙酯將毒死蜱標準儲備液稀釋成濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/kg的系列標準液，分別將不同濃度梯度的系列標準液均勻噴灑在小麥中，混合均勻后晾干并置于自封袋中保存。每個濃度制備30個樣本，無毒死蜱小麥制備30個樣品，共制備330個樣品，每份樣品重200 g。

1.2.2 近紅外光譜采集及分組 參考張曉等[17]的方法，打開近紅外光譜儀預熱30 min后采集所有樣品的近紅外光譜，采用單通道，光譜范圍為10000～4000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，實驗共獲得30份無毒死蜱小麥樣品和300份有毒死蜱殘留的小麥樣品的近紅外光譜圖，建立近紅外光譜圖數(shù)據(jù)庫。

1.2.3 調用近紅外光譜圖及特征波段選取 調用無毒死蜱殘留小麥樣品和有毒死蜱殘留小麥樣品的近紅外光譜圖，將330份近紅外光譜圖分為校正集和驗證集[18]，其中校正集用于建立定性和定量兩種分析判別模型，驗證集則用于評判兩種模型的有效性[19]。在OPUS5.5QUANT軟件的幫助下選擇特征光譜波段。

1.2.4 建立小麥樣品毒死蜱農藥殘留的定性判別模型并進行條件優(yōu)化 在特征波段，通過不同的預處理方法消除無關信息的干擾以提高模型的準確度，利用歐式距離法和因子化法計算處理光譜并建立模型[20]，以S值作為評判指標，確定最佳的預處理方法以及光譜計算方法，建立判別率高的定性分析判定模型。

式中：D為兩種物質平均光譜之間的距離；DTI為某種物質的閾值；DT2為另一種物質的閾值。

1.2.5 利用偏最小二乘法建立小麥樣品毒死蜱農藥殘留的定量判別模型

1.2.5.1 模型的條件確定與優(yōu)化 輸入各組小麥樣品的近紅外光譜及其相對應的農藥殘留量，在OPUS5.5QUANT軟件的幫助下選擇特征光譜波段和光譜的預處理方式，利用“剔一”交叉驗證法確定主成分數(shù)，并根據(jù)RMSECV和R2擇出最優(yōu)的建模條件[11]。

1.2.5.2 模型的建立 輸入作為校正模型參數(shù)的特征波段范圍，選擇最佳方式處理譜圖，利用剔一交叉驗證法優(yōu)化模型，建立定量分析模型實際值和預測值之間的關系。

1.2.5.3 檢驗模型的可靠性及靈敏度的測定 通過對未知樣品農藥殘留量的預測來判斷所建模型的可靠性、準確性，同時擴大檢測時小麥樣品的毒死蜱殘留濃度以確定該檢測方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 近紅外光譜的采集及光譜圖數(shù)據(jù)庫的建立

采集30份無農藥殘留和300份有農藥殘留小麥樣品的近紅外漫反射光譜圖，其中有農藥殘留小麥樣品分為10個等級，利用所有樣品的近紅外光譜圖建立的數(shù)據(jù)庫，如圖1所示。

圖1 原始近紅外譜圖數(shù)據(jù)采集結果Fig.1 Raw near infrared spectroscopy data acquisition results

2.2 利用歐氏距離法或因子化法對有農藥殘留小麥樣品的檢測

2.2.1 調取近紅外光譜圖并進行光譜波段的選擇可以采用全部波長數(shù)據(jù)對近紅外光譜進行數(shù)據(jù)分析，也可以采用部分波長數(shù)據(jù)對紅外光譜進行數(shù)據(jù)分析[21]。當采用全部波長數(shù)據(jù)進行分析時，隨著數(shù)據(jù)點的增加，數(shù)學計量模型會得到改善，但一旦數(shù)據(jù)點過高，就會出現(xiàn)模型過度“擬合現(xiàn)象”[22]，并且PLS算法會解析光譜噪音或者樣品附加成份的特征值，造成模型的準確度降低[23]。因此，試驗中通常采用一階微分導數(shù)處理近紅外光譜的數(shù)據(jù)，進而篩選出特征波段范圍，本實驗的特征波數(shù)段范圍由儀器自動選定，經(jīng)過一階微分導數(shù)處理過的譜圖如圖2所示。討論不同的波段范圍對模型的相關性影響，其結果如表1所示。

圖2 有農藥殘留小麥樣品的一階導數(shù)光譜圖Fig.2 First derivative spectra of wheat samples with pesticide residues

表1 不同光譜波數(shù)段對模型預測效果的比較Table 1 Comparison of prediction effects of different spectral wavenumbers on models

由圖2可知，利用軟件分析獲得的兩者近紅外光譜特征波段分別為：5543.68～4643.72、7582.43～6510.28、9186.74～8975.63 cm-1。S值表征的是兩種樣品之間的距離，當S＜1時，表示兩種判別樣品相交，不能被甄別，當S=1時，表示兩種判別樣本相切，也無法被甄別，當S＞1時，表示兩種判別樣本相離，兩種樣本可以被甄別，且S值越大代表模型的判別效果越好[24]，由表1可知，無論是用歐氏距離法還是因子化法建立的模型，當波段范圍為5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1時，其S值均為最大，即5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1是使建立的模型呈現(xiàn)最佳預測效果的波數(shù)段范圍。全部波長和其他波段組成方式的預測結果較差，可能是因為在這些波段內更偏重于顯示兩者之間的差異，而全部波數(shù)范圍內包含著對實驗結果有一定影響的非特征信息[25]。所以，本試驗所選波數(shù)范圍為5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1，將其作為特征波進行后續(xù)處理分析。

2.2.2 選擇光譜數(shù)據(jù)預處理方式 不同點平滑直接影響用于模型有效性鑒別的S值，且不同點平滑所帶來的影響并不具有規(guī)律性，因此在進行模型效果預測時，包括5點平滑、9點平滑、13點平滑、17點平滑、21點平滑、25點平滑多個方式，更能準確判定最佳的預處理方式。不同近紅外光譜預處理方式對S值所產生的影響如表2、圖3所示。

表2 不同預處理方式對定性分析模型效果的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on qualitative analysis model

圖3 因子化法2D得分圖Fig.3 2D score Figure factorization method

在特征波段5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1的范圍之內，分別利用歐氏距離法和因子化法建立模型進行定性分析，并通過S值判定模型的有效性。由表3可知，不同的光譜預處理方式對應的S值也不同，當采用因子化法與二階導數(shù)+矢量歸一化+5點平滑結合的預處理方法時，其S值最大，即所建立的模型效果最好，樣本能被均一鑒別，由圖3可知，利用因子化法建立的定性分析模型的判別率更高。

表3 定性分析模型鑒別結果Table 3 Qualitative analysis model

2.2.3 驗證因子化法定性分析模型 在選取特征波段為5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1，因子化法建立模型，二階導數(shù)+矢量歸一化+5點平滑法對光譜進行預處理的條件下，對驗證集進行定性分析，結果如表3所示。

結果表明，無毒死蜱農藥殘留小麥樣品的正確判別率為100%，有毒死蜱殘留小麥樣品的正確判別率為96%，說明在光譜波數(shù)范圍5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1和采用二階導數(shù)+矢量歸一化+5點平滑進行數(shù)據(jù)預處理的條件下，因子化法更適用于小麥中毒死蜱農藥殘留的測定，可以滿足實際情況下的的檢測需求。

2.3 利用偏最小二乘法建立小麥毒死蜱農藥殘留的定量模型

2.3.1 調用近紅外光譜及分組 在建立小麥樣品無毒死蜱農藥殘留和有毒死蜱農藥殘留的定性判別模型之后，還需要通過偏最小二乘法建立定量判別模型對有毒死蜱農藥殘留小麥樣品的農藥殘留量進行判斷[24]。從近紅外光譜數(shù)據(jù)庫調取全部近紅外光譜圖，包括未噴灑過毒死蜱農藥的小麥樣品和噴灑過不同毒死蜱農藥的小麥樣品，每種樣品均有30份，其中20份為校正集，10份為驗證集。

2.3.2 選擇光譜波段數(shù) 光譜中不同波數(shù)段對定量分析模型相關性的影響結果如表4所示。

表4是由毒死蜱農藥殘留不同光譜波段數(shù)對定量分析模型的預測效果比較，其中在5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1波段范圍內的交叉驗證系數(shù)（R2）最高、交叉檢驗均方殘差（RMSECV）最小，顯著優(yōu)于其他的波段范圍。因此，在后續(xù)試驗中均采用5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1波段數(shù)范圍建立定量分析模型。

表4 不同波數(shù)段對定量分析模型預測效果的比較Table 4 Comparison of prediction effects of different spectral wave sections on the model

2.3.3 選擇不同的光譜預處理方式 利用偏最小二乘法對樣品進行定量分析時，為達到去除基線干擾和無關信息的目的，通常用一定的方法對光譜進行預處理，進而提高定量分析模型的判別率[26]。以交叉驗證系數(shù)（R2）和交叉檢驗均方殘差（RMSECV）為評價指標，在特征波段5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1范圍內利用PLS法進行擬合結合交叉檢驗，對近紅外光譜的預處理方式進行篩選，得到最佳組合，其結果如表5所示。

表5 采用不同光譜預處理方式對判別偏最小二乘模型結果Table 5 Spectral establishment under different pretreatments Discriminant partial least squares model results

結果表明：小麥樣品中毒死蜱農藥殘留量的近紅外光譜的最優(yōu)預處理方法是消除常數(shù)偏移量，消除常數(shù)偏移量的交叉驗證系數(shù)（R2）為99.46，交叉驗證均方殘差（RMSECV）為1.15。

2.3.4 優(yōu)化校正模型 主成分數(shù)對判別模型的交叉驗證均方殘差（RMSECV）的影響結果如圖4所示。

篩選主成分數(shù)提高判定模型準確率是利用偏最小二乘法建立定量分析模型時最為重要的一個優(yōu)化方式之一[27]。在主成分數(shù)過多時建立模型，會出現(xiàn)判定模型的過度“擬合現(xiàn)象”，并且PLS算法會解析光譜噪音或者樣品附加成份的特征值，降低模型的準確度[28]，在主成分數(shù)過少時建立模型，有些有效信息不能夠得到充分利用，造成模型的擬合度降低[29]。由圖4可知，在選取5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1為波數(shù)段范圍和以消除常數(shù)偏移量為預處理方式的條件下，以交叉驗證均方殘差（RMSECV）作為判斷指標時發(fā)現(xiàn)，當主成分數(shù)為7時，定量判定模型的擬合程度最高，即7為最佳主成分數(shù)。

圖4 農藥殘留量交叉驗證均方殘差（RMSECV）隨主成分數(shù)的變化Fig.4 Change of mean square residuals of pesticide residues cross validation with principal component fraction

2.3.5 建立模型 定量分析模型檢測小麥樣品中毒死蜱農藥殘留量的實際值和預測值之間的關系如圖5所示。

圖5 校正集農藥殘留量實際值與測定值之間的關系圖Fig.5 Correlation between the real value and the measured value of pesticide residues in calibration set

選取5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1為光譜特征值波數(shù)段，采用消除常數(shù)偏移量的譜圖預處理方式，并選擇7為主成分數(shù)，利用偏最小二乘法建立定量分析判定模型，通過“剔一”交互驗證法檢測模型的可靠程度，其交叉驗證系數(shù)（R2）為99.46，交叉驗證均方殘差（RMSECV）為1.15，判定模型的相關性良好，且預測能力較佳。

2.3.6 驗證模型的可靠性 定量分析判定模型檢測小麥毒死蜱農藥殘留量的NIRS實際值和預測值比較結果如表6所示。

根據(jù)上述試驗所獲得的定量分析模型對15種不同毒死蜱農藥殘留量的小麥樣品進行預測，由于考慮到用液譜法對樣品毒死蜱農藥真實殘留量進行檢測時的損耗，樣品毒死蜱殘留量真實值取其噴灑的農藥的量。由表6可知，當毒死蜱農藥殘留量在1 mg/kg以下時，相對誤差較大，即模型的預測效果較差；當毒死蜱農藥殘留量在1～10 mg/kg之間時，相對誤差較小，即模型的預測效果較好[30]，可以實現(xiàn)小麥樣品中的毒死蜱農藥殘留量的準確測定。

表6 農藥殘留量的NIRS真實值和預測值比較Table 6 Comparison of predicted and real values of NIRS for pesticide residues

3 結論

采用近紅外光譜技術結合化學計量學方法，建立了小麥中毒死蜱殘留的定性和定量判別模型，在光譜波數(shù)范圍選擇為5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1和二階導數(shù)+矢量歸一化+5點平滑的預處理方式的條件下，因子化法的判別率更高，達到96%，較歐氏距離法更適用于小麥中有無毒死蜱殘留的定性檢測；在選擇特征波段為5543.68～4643.72、7582.43～6510.28 cm-1和預處理方式為消除常數(shù)偏移量，主成分數(shù)為7的條件下，定量判別模型的交叉驗證系數(shù)（R2）可達到99.46、交叉驗證均方殘差（RMSECV）可達到1.15，實際值與預測值之間的相關性比較好，并且在毒死蜱含量1～10 mg/kg范圍內，檢測結果較為準確，重現(xiàn)性較好，可適用于小麥毒死蜱殘留量的快速定量檢測。該實驗結果，說明近紅外光譜技術結合化學計量學方法，可作為小麥中微量農藥殘留快速檢測的一種有效分析方法。