余甘子圣女果復合飲料發酵工藝及對運動耐力的影響

鄭 聰，李勝楠

（新鄉醫學院，河南新鄉 453000）

余甘子（Phyllanthus emblicaL.）屬于大戟科葉下珠屬余甘子的果實，富含多糖、黃酮、皂苷及多酚等物質，營養價值豐富，具有良好的抗炎、抗菌、增強機體免疫等效果[1-2]。國、內外學者等先后研究發現高濃度的余甘子多糖對DPPH自由基的清除能力與Vc相當[3]，而對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別達到80.3%和85.9%[4]；余甘子多酚提取物對ABTS+自由基的半抑制濃度較Vc顯著偏低[5]，而對DPPH自由基、羥自由基的清除率和自發性肝脂質氧化的抑制率均明顯高于相同濃度的茶多酚[6]；杜麗娟等分別測定余甘子的黃酮提取物對羥自由基、亞硝酸鈉及DPPH自由基的清除率為82.72%、66.14%和97.40%，表明其體外抗氧化活性較好[7]。圣女果又稱“小番茄”，富含礦物質、維生素及有機酸等營養成分，其果漿香氣芬芳濃郁，且其主要成分番茄紅素的抗氧化能力優于β-胡蘿卜素，具有促進體內物質代謝、增強細胞的抗氧化作用[8-9]。

“運動耐力”是機體可承受的最大運動負荷，高強度運動可使機體肌肉劇烈收縮，誘導體內活性氧與NO濃度水平的升高，促使相關肌蛋白發生超S-亞硝基化，自由基濃度水平上升，造成體內生理環境發生改變，致使各組織、器官供氧不足，出現持續性或重度疲勞，導致運動耐力的下降[10-11]。目前主流的運動飲料多以糖類、鹽類物質為主要成分，口感單一，僅可預防劇烈運動后的身體水鹽紊亂，不能起到根本的抗疲勞效果。

目前體外補充抗氧化劑已被證實具有較好的抗運動性疲勞效果，且部分已被開發制成食品，而余甘子口感微澀，加工食品多以其粉末、果干或果脯為主，經濟附加值較低。本研究以余甘子與圣女果為原料，利用乳酸桿菌發酵，制得余甘子圣女果復合發酵飲料，通過考察不同發酵工藝條件對該復合飲料品質的影響，確定最佳發酵工藝，同時利用動物模型探討其對運動耐力的影響，以期為相關資源的利用和運動食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子果實、圣女果 購于新鄉牧野農貿市場；發酵乳桿菌 瑞楚生物科技（江蘇）有限公司；蔗糖珠海市泛海生物技術有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、苯酚、硫酸、甲醇、乙醇 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、蘆根、沒食子酸、番茄紅素對照品 中國食品藥品檢定研究院；肝糖原（Liver glycogen, LG）、肌糖原（Muscle glycogen, MG）、乳酸（ Blood lactic acid, BLA）、尿素氮（ Blood urea nitrogen, BUN）檢測試劑盒 上海瑞番生物科技有限公司；試驗用水為純化水；SPF級健康雄性昆明小鼠100只，體質量17～25 g，由河南省實驗動物中心提供（動物許可證號：SCXK （豫）2017-0001）。

B5002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；752N型紫外可見分光光度計 上海儀電科技有限公司；U3000型高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；PS220型果蔬打漿機 諸城市瑞民機械有限公司；DZJR-5型高壓均質機 無錫帝碩自動化設備有限公司；VYJG-9420型恒溫干燥箱 杭州億捷科技有限公司；TG16G型離心機 常州億能實驗儀器有限公司；HH-8型數顯恒溫水浴鍋 濟南歐萊博技術有限公司；BJPX-200型恒溫培養箱 山東博科科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 制備要點

1.2.2.1 余甘子提取液制備 余甘子果實清洗后，去核烘干，粉碎完全后過80目篩，稱取一定質量干粉，照料液比1:8 （m/v）加入純化水，回流提取1 h，離心（5000 r/min）過濾后取上清液，即得[12]。

1.2.2.2 圣女果汁制備 挑選新鮮的圣女果，清水洗凈后，去皮榨汁，采用100目濾布過濾，取濾液，即得。

1.2.2.3 調配、均質與滅菌 余甘子提取液與圣女果汁按照一定體積比混合后，添加3%（m/V）蔗糖，經高壓均質 （20 MPa、60 ℃）后，于80 ℃滅菌15 min，冷卻、備用。

1.2.2.4 接種發酵 采取無菌操作，將活化后的乳酸桿菌 （1×107CFU/mL）接種至滅菌完成的復合飲料中，置于一定的溫度下，發酵一段時間后，即得余甘子圣女果復合發酵飲料[13]。

1.2.3 單因素實驗考察 根據預實驗結果，選擇乳酸菌接入量、余甘子提取液與圣女果汁的體積比、發酵溫度及時間為考察因素，具體如下：固定余甘子提取液與圣女果汁的用量體積比1:3、發酵溫度40 ℃、發酵時間30 h，考察不同乳酸菌接入量 （0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）對飲料感官評分的影響；固定乳酸菌接入量0.5%，發酵溫度40 ℃、發酵時間30 h，考察不同余甘子提取液與圣女果汁的用量體積比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）對飲料感官評分的影響；固定余甘子提取液與圣女果汁的用量體積比1:3、乳酸菌接入量0.5%、發酵時間30 h，考察不同發酵溫度 （25、30、35、40、45 ℃）對飲料感官評分的影響；固定余甘子提取液與圣女果汁的用量體積比1:3、乳酸菌接入量0.5%、發酵溫度40℃、考察不同發酵時間 （24、30、36、42、48 h）對飲料感官評分的影響。

1.2.4 響應面優化 基于1.2.3單因素實驗結果，利用Box-Benhken試驗設計對復合飲料制備的關鍵條件，即余甘子提取液與圣女果汁的用量體積比、乳酸菌接入量、發酵溫度和時間進一步優化，響應面試驗因素及水平見表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.2.5 飲料理化與微生物指標檢測

1.2.5.1 pH測定 采用pH計測定飲料pH。

1.2.5.2 總多糖含量 以葡萄糖標準品作對照，于490 nm波長處測定吸光度，采用苯酚-硫酸法測定飲料的多糖含量[14]。

1.2.5.3 總黃酮含量測定 以蘆丁標準品作對照，于510 nm波長處測定吸光度，采用亞硝酸鈉-硫酸鋁法測定飲料的黃酮含量[15]。

1.2.5.4 總多酚含量測定 以沒食子酸標準品作對照，于765 nm波長下測定吸光度，采用福林酚法測定飲料的總多酚含量[16]。

1.2.5.5 番茄紅素含量 參照文獻[17]所述步驟，采用C18作為固定相的色譜柱，在甲醇-乙酸乙酯（95:5）的流動相下等度洗脫，于472 nm檢測波長下測定飲料的番茄紅素含量。

1.2.5.6 乳酸菌量測定 照GB/T 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定飲料的乳酸菌量[18]。

1.2.6 飲料感官評價標準 通過觀察余甘子圣女果復合發酵飲料的性狀，并參考其它飲料評價標準[19]，制定該復合發酵飲料的感官評價標準，見表2所示。挑選10名飲料感官評價經驗豐富人員，按照該標準要求，分別對不同工藝制備的飲料“色澤”、“氣味”、“口感”與“組織形態”進行評價，所以評價分數均去掉最高分與最低分后取平均值。

表2 復合發酵飲料感官評價標準Table 2 Criterion of sensory evaluation on compound fermentation beverage

1.2.7 運動耐力影響評價

1.2.7.1 動物分組與劑量設計 100只小鼠經適應性喂養5 d后，按體質量隨機分為空白對照組、對照組和飲料的低、中、高劑量組，照《保健食品功能評價》要求，三個飲料組小鼠的每日灌胃量，分別給予10、20、30 mL/kg，而空白對照組按照20 mL/kg灌胃0.85%生理鹽水，對照組則按照相同劑量灌胃3%蔗糖溶液，所有小鼠每日灌胃1次，連續30 d[20]。

1.2.7.2 爬桿試驗 末次灌胃結束，休息30 min后，選取各組10只小鼠置于爬桿中，記錄小鼠自肌肉緊張抱緊爬桿至無力脫落的時間[21]。

1.2.7.3 體內生化指標檢測 末次灌胃30 min后，選取各組剩余小鼠置于水中（溫度：30±2 ℃）游泳30 min，取出，休息10 min，眼眶采血離心，照血乳酸、尿酸氮檢測試劑盒使用說明，檢測血清中BLA、BUN含量，同時取出肝臟與后腿肌肉，漂洗、吸干后，利用肝糖原、肌糖原檢測試劑盒測定LG、MG含量[22]。

1.3 數據處理

通過SPSS19.0軟件分析試驗結果并進行方差分析，比較組間差異，當P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乳酸菌接種量對飲料品質的影響 圖1為不同乳酸菌的接種量對復合發酵飲料感官評分與總酸含量的影響，從圖1可見，隨著乳酸菌接種量的增多，飲料的感官評分與總酸含量均先升高后降低，當乳酸菌接種量至0.5%時，飲料的感官評分最高達到83.7分，且總酸含量適宜。這歸因于接種量的高低直接影響乳酸菌的繁殖基數，當接種量偏低時，乙醇與有機酸的產率偏低，但接種量過多，基質中糖類物質消耗過快，使得發酵液中有機酸含量的增加過多，既影響飲料的口感也抑制乳酸菌的活性，從而不利于發酵，這與李昌寶等研究圣女果百香果復合發酵飲料的乳酸菌添加量結果相似[23]，因此選擇0.3%、0.5%、0.7%作為后續響應面試驗中乳酸菌接種量的考察水平。

圖1 乳酸接種量對復合發酵飲料感官評分與總酸含量的影響Fig.1 Effects of inoculum on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.1.2 余甘子提取液與圣女果汁體積比對飲料品質的影響 圖2為余甘子提取液與圣女果汁的體積比對復合發酵飲料的感官評分與總酸含量影響，從圖2可知，復合發酵飲料的感官評分隨著余甘子提取液與圣女果汁體積比的增多呈先增大后減小的趨勢，總酸的含量則不斷減小，當余甘子提取液與圣女果汁的體積比為1:3時，復合發酵飲料的感官評分達到最高。這歸因于隨著圣女果汁的用量增多，飲料的色素濃度增大，含糖量升高，有助于“色澤”與“口感”項評分提高，但缺失余甘子的酸甜風味，其有機酸含量也逐步下降，因此選擇1:2、1:3、1:4作為后續響應面試驗中余甘子提取液與圣女果汁的體積比考察水平。

圖2 余甘子提取液與圣女果汁體積比對復合發酵飲料感官評分與總酸含量的影響Fig.2 Effects of ratio of Phyllanthus emblica extract and cherry tomato juice on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.1.3 發酵溫度對飲料品質的影響 發酵溫度影響乳酸菌的生長速度，因此分別考察不同發酵時間對復合發酵飲料的感官評分與總酸含量的影響，結果見圖3。從圖3可知，隨著發酵溫度的升高，復合飲料的感官評分與總酸含量均先增大后較小，當發酵溫度為40 ℃時，飲料的感官評分達到最高，這歸因于當發酵溫度過低，發酵速度較緩慢，影響飲料的口感，這與張婉瀅等考察胡蘿卜乳酸飲料的發酵溫度結果相近[24]，因此選擇35、40、45 ℃作為后續響應面試驗中發酵溫度的考察水平。

圖3 發酵溫度對復合發酵飲料感官評分與總酸含量的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on sensory score andtotal acid content of compound fermented beverage

2.1.4 發酵時間對飲料品質的影響 發酵時間的長短影響乳酸菌的產酸量，從而影響飲料的風味，因此分別考察不同發酵時間對復合發酵飲料的感官評分與總酸含量影響，結果見圖4。從圖4可知，當發酵時間為30 h，復合飲料的感官評分達到最高，隨后逐漸下降，而總酸含量升高緩慢。這歸因于在發酵初始階段，乳酸菌利用基質中的糖類物質快速生成乳酸，對飲料的風味具有一定的提升作用，但隨著發酵時間的延長，乳酸菌的活性開始降低，同時大量乳酸的累積將抑制發酵過程，這與龐庭才等研究小球藻紅棗乳酸發酵飲料的結果基本一致[25]，因此選擇24、30、36 h作為后續響應面試驗中發酵時間的考察水平。

圖4 發酵時間對復合發酵飲料感官評分與總酸含量的影響Fig.4 Effects of fermentation time on sensory score and total acid content of compound fermented beverage

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與方差分析 采取Box-Behnken試驗設計，以乳酸菌接種量、余甘子提取液與圣女果汁體積比、發酵溫度及時間為考察因素，進行四因素三水平響應面優化試驗，試驗結果與方差分析見表3、表4所示。

表4 響應面方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表3結果進行二次回歸方程擬合，得到感官評分對各因素水平的二次多項回歸方程：Y=85.42+2.10A+1.87B+5.28C-1.34D-2.82AB+0.075AC+0.05AD-2.58BC+2.55BD+1.57CD-5.39A2-3.93B2-2.47C2-4.2D2。

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of the response surface experiment

從表4可知，該回歸模型具有極顯著性（P＜0.01），決定系數為0.9896，失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型方程可準確反映各因素與響應值的變化關系。從顯著性分析可知，一次項A、B、C，二次項A2、B2、D2對復合飲料的感官評分影響均極顯著（P＜0.01），一次項D，二次項C2，交互項AB、BC、BD對復合飲料的感官評分影響均顯著（P＜0.05），各因素在考察的水平范圍內對復合飲料的感官評分影響順序為：發酵溫度（C）＞乳酸菌接種量（A）＞原料體積比（B）＞發酵時間（D）。

2.2.2 響應面交互作用分析與最佳發酵條件確定圖5為不同考察因素之間相互作用的響應曲面，從圖5可知，在AB、BC、BD的交互曲面中，曲面陡峭，表明兩因素之間交互作用顯著（P＜0.05），且隨著各因素水平的增加，飲料的感官評分均呈先升高后下降的趨勢，而在AC、CD、AD的交互曲面中，感官評分隨著各因素水平的增加升高緩慢，兩因素之間交互作用不顯著（P＞0.05）。通過Design-Expert 8.0.6軟件擬合得出余甘子圣女果復合飲料的最佳發酵工藝為：乳酸菌接種量0.55%、余甘子提取液與圣女果汁的體積比1:2.86、發酵溫度45 ℃、發酵時間29.83 h，感官評分預測值88.6分。但為后續操作方便，修改工藝條件為：乳酸菌接種量0.6%、余甘子提取液與圣女果汁的體積比1:3、發酵溫度45 ℃、發酵時間29.8 h。在此工藝條件下，飲料的感官評分為88.2分，與預測值較接近，表明該回歸模型預測性較好。

圖5 兩因素交互作用的響應曲面Fig.5 Response surface of interaction between each two factors

2.3 復合飲料的品質分析

2.3.1 感官結果 采用最佳發酵工藝制得的余甘子圣女果復合發酵飲料呈紅色，色澤均一、透亮，富有余甘子與圣女果的混合香味、酸甜適宜，口感細膩，靜置未有明顯分層。

2.3.2 理化與微生物結果 采用最佳發酵工藝制得的余甘子圣女果復合發酵飲料的理化與微生物指標測定結果，見表5所示。從表5可知，該復合發酵飲料pH適宜，多糖、黃酮、多酚、番茄紅素及乳酸菌的含量較高，營養價值豐富，乳酸菌含量≥106，符合GB 7101-2015 食品安全國家飲料標準要求。

表5 復合發酵飲料的品質結果Table 5 Results of quality indexes of compound fermented beverage

2.4 復合飲料對小鼠爬桿時間影響

動物的爬桿時間長短可間接反映其運動耐力，表6為不同組別的小鼠爬桿時間，與空白對照組和對照組相較，不同組別小鼠的爬桿時間均有延長，且具有極顯著性差異（P＜0.01），其中低、中、高劑量組的爬桿時間較空白對照組分別延長5.1、8.3、10.7 min，表明余甘子圣女果復合發酵飲料有助于增強動物的運動耐力，延長其運動時間；同時低、中、高劑量組的爬桿時間較對照組分別延長4.3、7.5、9.9 min，表明飲料中其它組分不影響主成分對動物運動耐力的影響，這與劉媛媛研究人參不老莓復合飲料的抗疲勞功能結果相近[26]。

表6 不同組別小鼠的爬桿時間Table 6 Climbing time of mice in different groups

2.5 復合飲料對運動后小鼠MG、LG含量影響

體內的糖類物質主要以血糖、肝糖原、肌糖原形式存在，為機體運動提供能量[27]，由于體內糖原含量的高低影響機體的運動耐力，為此分別考察復合發酵飲料對運動后不同組別小鼠體內MG、LG含量的影響，結果見表7。與空白對照組相較，各劑量組小鼠運動后體內的MG、LG含量均明顯較高，而各劑量組小鼠運動后體內的MG、LG含量較對照組也明顯提高，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01），這主要歸因于余甘子與圣女果中多糖可以動物多糖形式存在于小鼠肝臟與肌肉中，為其運動代謝提供能量，這與王書全等研究螺旋藻多糖的抗運動疲勞結果一致[28]，因此余甘子圣女果復合發酵飲料有利于提高體內肝、肌糖原的儲備，保持運動后機體的糖原含量。

表7 不同組別小鼠運動后體內MG、LG含量Table 7 Contents of MG and LG of mice in different groups after swimming

2.6 復合飲料對運動后小鼠BLA、BUN含量影響

機體運動過度時，肌肉收縮加劇，致使供氧不足發生糖酵解反應生成乳酸，繼而體內環境pH下降，引發其他等生化反應，出現疲勞感，同時糖類、脂肪的過度消耗，致使蛋白質、氨基酸分解，體內血清中BUN含量升高[29]，因此考察不同組別小鼠運動后BLA、BUN含量，結果見表8。從表8可知，與空白對照組、對照組相較，各劑量組小鼠運動后體內的BLA、BUN含量均明顯減小，具有極顯著性差異（P＜0.01），表明余甘子圣女果復合發酵飲料有助于加快乳酸代謝，減少運動時體內的蛋白質與氨基酸分解。

表8 不同組別小鼠運動后體內MG、LG含量Table 8 Contents of MG and LG of mice in different groups after swimming

3 結論

本研究采用余甘子提取液與圣女果汁為原料，經調配、均質、滅菌后，利用乳酸菌發酵制得余甘子圣女果復合發酵飲料。通過單因素與響應面試驗確定該復合發酵飲料的最佳工藝條件為：乳酸菌接種量0.6%、余甘子提取液與圣女果汁的體積比1:3、發酵溫度45 ℃、發酵時間29.8 h，感官評分達到88.2分，所得飲料呈紅色，色澤均一、透亮，富有余甘子與圣女果的混合香味、酸甜適宜，口感細膩，靜置未有明顯分層，富含多糖、黃酮、番茄紅素等物質，營養價值較高。動物實驗結果表明，余甘子圣女果復合發酵飲料有助于延長小鼠的爬桿時間，提高體內肝、肌糖原的儲備，并可加快乳酸代謝，減少蛋白質與氨基酸的分解，因此有利于提高機體的運動耐力，可推廣用于相關食品領域。