乳及乳制品中蛋白組分測定方法研究進展

白沙沙，趙 笑，孔凡華，徐佳佳，柴艷兵，張耀廣，李興佳，李 飛，朱佳音，袁 芳，崔亞娟,

（1.北京市營養源研究所有限公司，北京 100069；2.石家莊君樂寶乳業有限公司，河北石家莊 050221；3.河北君樂寶君源乳業有限公司，河北石家莊050011；4.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

哺乳動物分泌的乳汁為初生幼崽提供生長發育所需的所有物質，乳蛋白作為乳汁中重要的功能成分，其含量和組成在不同物種、不同泌乳階段會有很大的變化。人乳蛋白質含量為1.97%、牛乳蛋白質含量為3.24%、綿羊乳蛋白質含量為5.25%、水牛乳蛋白質含量為4.18%，人乳泌乳初期酪蛋白與乳清蛋白比例為2:8、泌乳中期和后期酪蛋白與乳清蛋白比例為4:6，牛乳酪蛋白與乳清蛋白比例為8:2[1-2]。人乳與牛乳各酪蛋白成分間的含量和比例及乳清蛋白中的主要成分都存在很大差異，人乳乳清蛋白中乳鐵蛋白的含量在100～300 mg/100 mL[3-4]，牛乳中乳鐵蛋白含量在20 mg/100 g以下[5]，人乳中含有及其微量的β-乳球蛋白，但是β-乳球蛋白確是牛乳乳清的主要蛋白質[2]。準確測定不同乳蛋白組分的含量、研究乳蛋白成分的比例對優質乳制品研發、泌乳牛選育和嬰幼兒配方乳粉蛋白質母乳化至關重要。

目前定量測定乳蛋白含量的方法主要有酶聯免疫法、毛細管電泳法、高效液相色譜法和高效液相色譜串聯質譜法，本文對這4類方法的原理、適用性和方法特點進行綜述和分析（見表1），為乳蛋白組分的準確測定和方法篩選提供可靠的技術參考，為乳品營養研究、乳產品開發、嬰幼兒配方粉優化提供理論支持。

1 酶聯免疫法（ELISA）

1.1 方法原理

酶聯免疫法采用乳蛋白分子作為抗原特異性誘導產生抗體，并制備相應的酶標抗體，根據抗原與酶標抗體特異性親和，利用酶的催化反應使測定液顯色，目標物的量與酶的量等比例，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。

酶聯免疫法測定乳蛋白含量的方式主要有間接競爭法和雙抗夾心法[6-13]。如圖1所示，間接競爭法采用目標乳蛋白為包被抗原，乳蛋白抗體為一抗，酶標記抗體為二抗，樣品中目標蛋白與包被的目標蛋白進行競爭性免疫結合抗體，通過顯色反應和標準工作曲線計算乳蛋白含量。雙抗夾心法以乳蛋白為抗原制備相應的抗體（一抗）進行包被固定，加入待測定樣品溶液，洗板后加入辣根過氧化物酶標記的乳蛋白抗體（酶標二抗），顯色反應后測定吸光度，根據標準工作曲線進行計算乳蛋白含量。

圖1 酶聯免疫法示意圖Fig.1 Schematic diagram of ELISA

1.2 方法應用

目前不同乳源的乳蛋白酶聯免疫試劑盒均有商業化產品，如人乳中酪蛋白、乳白蛋白、乳鐵蛋白、骨橋蛋白和牛乳中骨橋蛋白含量[6]。

袁水林等[7]通過對β-乳球蛋白進行包被，制備β-乳球蛋白抗體和羊抗兔IgG過氧化物酶二抗，建立了牛乳中β-乳球蛋白含量間接ELISA測定方法，并以高效液相色譜法做為比對方法，驗證了間接ELISA方法的可靠性。β-乳球蛋白是乳清蛋白中的主要成分，也是主要的乳蛋白過敏源，通過調整包被抗體濃度ELISA方法可應用于食品中β-乳球蛋白過敏源的測定。吳春香等[8]采用商品化酶聯免疫試劑盒研究了嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量測定的準確性，通過驗證試劑盒法的檢出限、加標回收率、穩定性，與標簽標示值、高效液相色譜法測定結果進行比對，確定酶聯免疫法測定乳粉中乳鐵蛋白含量準確、可靠，方法檢出限為（LOD）2 mg/100 g，能夠滿足檢測需求。

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白質，分為α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、γ-酪蛋白等單體，于艷麗等[9]采用ELISA方法測定了市售乳粉中酪蛋白含量，測定結果與標簽標示值一致性達到99%以上，本研究直接測定酪蛋白總量，涵蓋了α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白酪蛋白組分。宋宏新等[10]、趙金龍[11]等分別對牛乳中κ-酪蛋白和β-乳球蛋白的ELISA方法進行研究，從抗體選擇、抗體包被濃度、反應條件優化等方面對酶聯免疫法測定乳蛋白進行系統研究，驗證了方法的可靠性。Michaela等[13]采用多克隆抗體模式針對天然α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白及其加熱處理后的形式建立了酶聯免疫測定方法，得到良好的測定特異性和抗干擾特性，同時研究了試劑盒內與試劑盒間的差異，確保了方法的穩定可靠。使用ELISA方法直接測定酪蛋白總量時，不同樣品酪蛋白單體比例對酪蛋白總量會有影響。

1.3 方法特點

酶聯免疫法測定乳蛋白含量的優勢：所需樣品量少（一般加樣量為10～50 μL）；樣品前處理簡單（直接混勻或稀釋后混勻）；酶聯免疫法在批量化測定時具有顯著優勢，自動化程度高，測定快速；酶聯免疫法具有高度的特異性，不同乳蛋白的交叉反應影響小，對微量蛋白組分的測定準確度高，在測定乳蛋白過敏源時適用性強。

由于酶聯免疫法在乳蛋白測定中具有高度的專一性，不能同時對多個乳蛋白組分進行準確定量，不同乳蛋白組分的準確測定需要不同試劑盒進行分析；除此之外，酶聯免疫試劑盒的準確性與所包被抗原或抗體的純度和穩定性有直接關系，不同商品化廠家的產品測定結果會存在一定差異。

2 毛細管電泳法（CE）

2.1 方法原理

毛細管電泳法分離乳及乳制品中乳蛋白組分是采用具有涂層的毛細管為乳蛋白分離載體，通過施加電壓，不同乳蛋白在緩沖液條件下的遷移速度不同而實現分離，采用紫外檢測器測進行定量測定。緩沖液中往往加入尿素溶液使蛋白質變性以達到良好的分離。

2.2 方法應用

乳蛋白的主要組分α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白和免疫球蛋白G等在毛細管電泳中能夠得到有效的分離和準確定量，經過驗證，方法精密度RSD均小于5%，加標回收率為83.7%～113.4%，各乳蛋白在20 min內能夠達到有效分離，且方法穩定可靠[14-16]。

除了乳蛋白各組分含量的測定，毛細管電泳還可有效分離乳蛋白組分的變異體，分析不同乳源乳蛋白的差異。馮慿等[17]研究了毛細管電泳分離A1-β-酪蛋白、A2-β-酪蛋白和B-β-酪蛋白變異體，通過方法線性、精密度、回收率等方法學驗證，得到了良好的β-酪蛋白分離條件，該方法適用于液態牛乳和乳粉中A2-β-酪蛋白和總酪蛋白含量的測定，也為各乳蛋白變異體的含量和功能研究提供可能。Jasmina等[18]和Adel等[19]采用毛細管電泳法對驢乳和單峰駝乳中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶等蛋白組分進行有效分離，結果得到單峰駝乳與牛乳蛋白組分差異很大。

乳蛋白在生產加工過程會有不同程度的變性，熱變性的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白在pH4.6時與酪蛋白共沉淀，丁曉靜等[20]采用毛細管電泳法系統的分析了牛初乳、原料乳及不同乳制品中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A及β-乳球蛋白B的含量，在樣品處理階段采用酸沉淀，取上清液進行毛細管電泳分析，結果得到牛初乳、原料乳中3種乳清蛋白組分的含量高于酸奶、UHT牛乳、復原乳和乳粉，明確了不同加工方式乳蛋白的變性比率。

2.3 方法特點

毛細管電泳法有效分離乳蛋白組分所需時間短、分析效率高，8種主要乳蛋白的分離時間在20 min內完成。方法所需樣品和緩沖液使用量少，上樣量一般為納升級別，幾毫升緩沖液就可完成一個測定程序。由于毛細管電泳優良的分離效率，同時測定不同乳蛋白組分含量，高豐度乳蛋白組分的測定準確性會高于低豐度蛋白測定準確性。納升級別的進樣量會限制測定方法靈敏度。

3 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法定量測定乳蛋白組分主要是酸沉淀后測定乳清蛋白、特異性親和凈化蛋白組分、變性處理測定酪蛋白和乳清蛋白三種形式。

3.1 酸沉淀測定乳清蛋白

乳樣品經過溶解、調節pH4.6沉淀酪蛋白等前處理，采用高效液相色譜系統經過流動相梯度洗脫，分離乳樣品中各乳清蛋白組分后進行定量測定。

采用乳中酪蛋白pH4.6等電點，熱變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與酪蛋白共沉淀的特性，研究活性乳清蛋白組分和含量[21-23]，經過驗證α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A、β-乳球蛋白B和牛血清白蛋白，檢出限為0.002 g/L，決定系數R2大于0.99，回收率93.0%～97.0%，可以準確測定乳及乳制品中活性乳清蛋白組分的含量。

Efstathia等[24]研究了不同種類乳中乳鐵蛋白含量，使用牛乳來源乳鐵蛋白對照，在液相條件下，作者采用比對各種乳樣品和對照品光譜圖及在樣品測定液中加入對照品確定目標峰位置的方法排除不同乳清蛋白組分對乳鐵蛋白的干擾，建立了不同乳中乳鐵蛋白定性定量分析方法。Cai等[25]采用酸沉淀超高效液相色譜分離測定分析248份來自中國不同地區的人乳乳鐵蛋白，得到不同泌乳階段人乳中乳鐵蛋白含量在102～385 mg/100 mL。

3.2 特異性親和凈化蛋白組分

3.2.1 方法原理 肝素是一種帶多個負電荷的含硫酸酯的酸性多糖，乳中非熱變性的乳鐵蛋白可通過親和層析結合肝素，通過磷酸鹽淋洗和鹽溶液洗脫，實現乳鐵蛋白的分離[26-27]。金黃色葡萄球菌等細菌表面的蛋白質與免疫球蛋白IgG分子Fc部分以非免疫學的方式進行高選擇性的特異性結合，乳樣品中的免疫球蛋白經過磷酸鹽提取，由IgG凈化柱分離后測定含量[28-29]。

3.2.2 方法應用 乳樣品經過溶解提取后，通過乳蛋白組分的特異性結合性質進行凈化處理，由高效液相色譜對單一蛋白組分進行定量測定，已報道應用此類方法的有乳鐵蛋白和免疫球蛋白G。

食品安全國家標準食品中乳鐵蛋白的測定（征求意見稿）高效液相色譜法原理即樣品中非熱變性的乳鐵蛋白經磷酸鹽提取，肝素親和柱凈化，C4色譜柱（300 ?，5 μm，4.6 mm×250 mm）分離測定。Chen等[30]和賈云虹等[31]在利用肝素親和柱分離乳鐵蛋白前，使用乙酸或磷酸調節乳樣品至pH4.6，除去酪蛋白和變性的乳清蛋白，通過響應面設計，確定了肝素親和柱富集乳鐵蛋白的最佳條件，能夠得到單一對稱的乳鐵蛋白色譜峰，得到方法檢出限和定量限（LOQ）分別為0.57和1.90 mg/L，不同水平添加量回收率在86%～99%之間，方法精密度相對標準偏差（RSD）為3.4%，建立了簡便、快捷的嬰兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量測定方法，可以滿足生產企業日常檢測和質量監督部門監督產品質量的要求。

孔祥虹等[32]建立了配方粉中免疫球蛋白G的高效液相測定方法，樣品提取后經protein G親和柱凈化、凝膠色譜液相分離，經方法學驗證，表明樣品在0.2～5.0 mg/mL范圍內線性相關性良好，加標回收率為86.0%～117.7%，能夠滿足奶粉中免疫球蛋白G含量的測定。

3.3 變性處理測定乳蛋白

樣品中乳蛋白經鹽酸胍、尿素、二硫蘇糖醇等溶液變性處理后，破壞乳蛋白間的聚合，采用高效液相色譜梯度洗脫，優化儀器條件和參數達到各蛋白組分的有效分離。

王浩等[33]通過優化色譜柱型號、柱溫、流動相梯度比例等條件建立了κ-酪蛋白、αS2-酪蛋白、αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白B和β-乳球蛋白A共7種蛋白成分的有效分離方法，回收率達88.9%～97.1%，相對標準偏差為0.8%～5.1%。豆劍偉等[34]使用C8色譜柱分別建立了分離測定乳中4種酪蛋白組分的方法，通過優化檢測波長、流速、柱溫等條件，4種酪蛋白組分得到有效的分離，加標回收率分別為92.74%～98.48%和95.2%～100.6%，測定準確性良好。

3.4 方法特點

乙酸或鹽酸沉淀前處理操作快速簡便，去除酪蛋白后，乳清蛋白組分得到更好的分離。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白對熱處理敏感，活性乳蛋白含量的測定可以判斷乳的熱變性程度和加工處理強度。未進行變性處理的測定方式，分離后乳蛋白具有可制備特性。但文獻中采用的乳蛋白對照品純度范圍在70%～95%，乳蛋白純度的不確定性限制了乳蛋白的準確定量。樣品與對照品中乳蛋白不同變異體的存在也為樣品中乳蛋白的準確定性定量和有效分離帶來困難。乳樣品中微量蛋白組分的測定容易受酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等高含量蛋白組分的影響，在液相色譜圖中不易檢出或得到較小的色譜峰，使準確定量受限。

4 高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）

4.1 方法原理

利用蛋白組學定量測定乳蛋白組分是采用胰蛋白酶特異性酶切目標蛋白生成肽段，通過定量測定目標蛋白肽段含量，根據肽段與乳蛋白等摩爾比例的關系，計算乳蛋白組分含量。高效液相色譜串聯質譜法測定乳蛋白示意圖如圖2所示。

圖2 高效液相色譜串聯質譜法測定乳蛋白示意圖Fig.2 Schematic diagram of determination of milk protein by HPLC-MS/MS

胰蛋白酶特異性酶切氨基酸鏈中精氨酸和賴氨酸位點的C末端（酶切位點后為脯氨酸時則失去酶切能力）生成多條肽段，使用高分辨質譜測定和分析不同肽段的氨基酸組成、長度、質譜信號強度、肽段特異性等，優選氨基酸個數為7～20個且不含有甲硫氨酸、半胱氨酸和色氨酸等易被氧化氨基酸的肽段作為定量測定特異肽段[35]。

4.2 方法應用

質譜法測定乳蛋白組分含量在定量測定時的校正方式主要有4種。合成同位素標記特異性肽段（和同位素標記標簽肽）進行內標法校正，這種方式綜合校正了酶解效率、前處理過程中的損失和基質效應[36-38]。Zhang等[39]和Li等[40]分別篩選了牛乳鐵蛋白和駱駝乳鐵蛋白特異肽段LRPVAAEIYGTK、DVTVLDNTDGK，通過合成內標特異肽段和乳鐵蛋白內標肽段進行內標法校正，方法學研究結果得到不同牛乳制品乳鐵蛋白和乳鐵蛋白內標肽段的酶解效率均能達到90%以上，乳鐵蛋白不同含量水平的加標回收測定結果在87.8%～104.7%，日內和日間精密度測定RSD均小于8%；駱駝乳鐵蛋白添加量6、30和60 mg/100 g的測定回收率分別為74.5%、103.6%和97.1%，具有良好的方法準確性。杜鵑等[41]在建立乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的質譜測定方法時分別選定了選定VGINYWLAHK和IDALNENK為目標蛋白質特異性肽段，采用同位素標記特異性肽段VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK進行內標校正，經過方法學優化得到良好的方法回收率和測定準確性。

在樣品測定液中加入已知量的外源非目標蛋白酶解液作為內標進行校正。馮小燕等[42]在研究α-酪蛋白的液相色譜-質譜測定方法時采用卵清蛋白酶解液中的特征離子對673.3/222.9作為內標離子對，用來控制不同樣品體系、不同進樣批次的離子化效率差異。此文獻未給出方法回收率或者與同位素標記肽段結果的比較，不能判斷外源非目標蛋白特征離子對作為內標方法的準確性。

加入非目標肽段的同位素標記特異性內標肽或者合成的非目標同質肽段進行內標法定量，校正了前處理過程中肽段的損失和基質效應。袁明美等[43]在研究牛乳及其制品中β-乳球蛋白的定量測定方法時，采用VLVLDTDYK為目標肽段，ETTVFENLPEK*為同位素內標肽段，方法學驗證結果日內與日間精密度均小于8%，回收率結果91.5%～100.2%，驗證了加入非目標肽段的特異性內標肽進行內標法定量的可靠性。詹麗娜等[44]在定量研究食品中牛乳過敏性酪蛋白時，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白定量肽段分別為HQGLPQEVLNENLLR、FALPQYLK、VLPVPQK和SPAQILQWQVLSNTVPAK，采用在目標肽段中加入一個氨基酸作為內標物，其中一組內標物為HQGGLPQEVLNENLLR、FVALPQYLK、SPAQILQWQVVLSNTVPAK和VALPVPQK，另一組內標物為HQGILPQEVLNENLLR、FIALPQYLK、SPAQILQWQALSNTVPAK和VILPVPQK，經過前處理條件的優化、方法驗證和食品中牛乳酪蛋白過敏源測定得到可靠的測定穩定性。

經加標回收等方法學驗證后直接用特異肽段外標法定量，在優化了前處理條件和方法學驗證后，外標法能夠得到準確的定量測定結果[45]。王震[46-47]以牛乳α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為研究對象，系統地分析了不同質譜儀器、同位素內標特異性肽段與目標肽濃度比、進樣小瓶、濾膜等條件對質譜響應信號的影響，結果得到不同質譜儀器和不同內標特異性肽段與標簽肽濃度比對α-乳白蛋白內標特異性肽段的質譜響應值影響很大，RSD分別為70.89%和20.77%，β-乳球蛋白的內標特異性肽段的質譜響應值很穩定，RSD分別為5.61%和8.30%，不同材質進樣小瓶、濾膜等前處理條件因素質譜響應值也得到α-乳白蛋白的內標特異性肽段差別較大，β-乳球蛋白的內標特異性肽段的質譜響應值差別很小；分析結論為同位素內標的質譜響應值變化主要受肽段氨基酸組成的影響；研究者分別利用內標法和外標法分析了15種嬰幼兒奶粉中兩種乳清蛋白的含量，得到α-乳白蛋白含量兩種方法的結果比值在115.53%～151.94%，β-乳球蛋白含量98.35%～132.21%，且目標蛋白樣品處理液濃度越低兩種方法的結果越接近。

4.3 方法特點

蛋白組學在乳蛋白組分測定中的應用解決了無商業化乳蛋白組分標準品和標準品純度低的問題。質譜的高通量、高靈敏度特點，使得多種成分的同時測定成為可能，為乳蛋白含量的測定提供一種準確的測定方法。非同位素標記法測定乳蛋白含量經過方法學驗證和比對，均能得到滿意的測定結果，也使得質譜法在不同乳源乳蛋白組分含量測定中適用性更強。

質譜法測定乳蛋白含量前處理繁瑣，乳蛋白需要經過變性、烷基化和長時間的酶解；胰蛋白酶的純度會直接影響肽段的含量和序列長度，優選質譜級和測序級胰蛋白酶；其中合成同位素標記特異性肽段與同位素標記標簽肽顯著增加測定成本；質譜儀檢測器運行成本和測定環境要求嚴格。

5 結論與展望

乳及乳制品中蛋白組分含量差異大，液態牛乳β-酪蛋白含量在1.0 g/100 g左右，乳鐵蛋白含量在2～20 mg/100 g，堿性磷酸酶、乳過氧化物酶等蛋白酶類含量在μg/100 g水平或者更低。篩選合適的方法是準確測定不同含量乳蛋白成分的關鍵因素。乳蛋白在加工過程中會不同程度的變性，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白等對熱敏感，準確測定乳制品中活性乳蛋白含量，對乳蛋白發揮生物活性更具意義。本文從測定方法原理、前處理、儀器和測定參數、方法特點等方面綜述了目前應用較多乳蛋白測定方法：酶聯免疫法、毛細管電泳法、高效液相色譜法和高效液相色譜串聯質譜法，為不同乳蛋白成分的準確測定提供方法篩選依據。

隨著乳蛋白功能特性研究的深入，在嬰幼兒配方粉、保健食品中添加了乳鐵蛋白、免疫球蛋白、乳脂肪球膜蛋白等功能性成分的產品往往具有更好的消費傾向性。準確測定乳及乳制品中蛋白組分的含量，建立標準測定方法，是乳品研發和質量控制與監管的重要環節。乳蛋白成分復雜，不同蛋白組分的分子量和含量都存在很大差異，蛋白組分的糖基化和磷酸化修飾程度、乳蛋白間的聚合與交聯、發酵與加熱等加工處理方式對蛋白含量有不同程度的影響，這些因素都對乳蛋白組分的準確定量帶來不小的挑戰。隨著乳蛋白測定技術的發展，精準的樣品前處理、乳蛋白理化和生化特性的研究、分離凈化方法的聯合使用[48-50]、高通量質譜檢測器的應用，將會對乳蛋白組分準確定量提供更多可能性。