側流免疫層析技術在食品安全檢測中的研究進展

閆靈芝

（運城學院生命科學系，山西運城 044000）

民以食為天，食以安為先，食品的安全與否直接關系人民群眾的身體健康。現代食品工業技術的不斷發展以及不法商販為了追求最大程度的經濟效益，生物性污染食品事件（細菌及細菌毒素、真菌及真菌毒素等）、化學性污染食品事件（農藥、獸藥、重金屬、激素、多環芳烴類化合物、N-亞硝基化合物等）頻頻發生。對相關危害成分的檢測主要基于高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜質譜聯用法以及酶聯免疫等儀器分析方法，這些方法雖然靈敏度高，但是操作繁瑣，費時，需要專業的技術人員同時檢測價格比較昂貴。因此開發快速、高靈敏度以及廉價的檢測方法用以分析食品中的有害成分對于食品安全的監督管理尤為重要。側流免疫層析技術（lateral flow immunoassay，LFIA）因其檢測快速、所需樣本量小、方便攜帶以及價格低廉等優點而廣泛應用于食品安全檢測中。典型的LFIA以球狀納米金顆粒作為信號標記材料，但是這種檢測方法的結果是定性（yes/no）或半定量的，無法滿足高靈敏的現場檢測需求[1]。

為了增強LFIA的檢測性能，突破傳統技術的缺陷，研究者嘗試從LFIA的信號標記材料、信號增強方法、多元分析物同時檢測以及檢測信號的讀出方式等方面做改進，這些方法一定程度上提高了檢測的靈敏度以及檢測效率。本論文主要對近年來LFIA的各種改進方法進行綜述，以期為免疫層析技術的進一步開發利用提供借鑒。

1 側流免疫層析技術的檢測原理

常規的免疫層析試紙的結構主要由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜、吸水墊以及PVC襯板5部分組成，其相互覆蓋順序如圖1a所示。在硝酸纖維素膜上有用于判定檢測結果的檢測線（test line，T線）和用于判定檢測結果有效與否的質控線（control line，C線）如圖1b所示。檢測原理主要基于免疫試劑抗原抗體的特異性結合，T線上包被捕獲抗原或者捕獲抗體，結合墊上結合有色納米材料標記的抗體，將待檢測樣品滴加到樣品墊上后，層析作用的進行使得免疫試劑相互結合，最終可根據T線區域信號顏色的有無以及信號的強度判定檢測結果[2]。

圖1 側流免疫層析技術的示意圖Fig.1 Schematic diagram of LFIA

2 側流免疫層析技術的發展方向

2.1 開發新型的信號標記材料法

常規的LFIA通常采用20～30 nm的球狀金納米材料，但是該材料發光強度較弱，影響檢測的靈敏度[3]。與此同時其在制備以及存放的過程中一旦出現雜質便非常容易聚集沉淀進而影響納米金的使用。為了改進LFIA的信號標記材料，近年來越來越多的納米材料被應用于免疫層析試紙條上，表1列出了近年來應用于LFIA的納米材料。

表1 在側流免疫層析技術中應用的信號標記材料Table 1 Signal nanoparticles in LFIA

續表 1

2.2 納米材料不標記單克隆抗體法

在傳統的LFIA中，顯色納米標記材料主要通過靜電吸附法和共價結合法標記單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb），但是靜電吸附法很容易受到抗體等電點、溫度和pH等因素的影響，而共價結合法不可避免地會阻塞mAb的部分抗原結合位點，最終均導致LFIA的檢測性能下降[34]。為了克服納米材料對抗體標記過程中產生的不利影響，研究者開發出了將納米材料不標記mAb的方法。研究者通過標記抗原（antigens，ag）、羊抗鼠抗體（gold nanoparticles labeled goat anti-mouse antibodies，GNPs-GAMA）等物質最大程度的暴露mAb的抗原結合位點，同時開發出抗體的替代探針（噬菌體、適配體）用于特異性識別食品中的有害物質，替代探針以其成本低、易合成、穩定性好以及保存時間長的優點使得LFIA的檢測性能提高。表2總結了納米材料標記其他物質的檢測方法。

表2 納米材料不標記單克隆抗體法Table 2 Method by nanomaterials unlabeled mAb

2.3 無納米標記材料法

盡管納米材料在LFIA中的應用非常廣泛，但是納米材料的合成過程相對復雜且比較費時，其和抗體之間的偶聯會影響抗體的活性，不同批次合成的納米材料可能會存在一定的差異進而影響LFIA的檢測性能，同時合成的納米探針在膠體作用力下很容易發生聚集沉淀，需要儲存在4 ℃條件下。因此近年來研究者探索無納米材料標記的LFIA。

Xu等[45]利用蛋白質染料考馬斯亮藍（coomassie brilliant blue，CBB）開發了一種新型的檢測試紙條，通過使用CBB對抗呋喃唑酮代謝物（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）的mAb進行染色，染色后的mAb即可作為一種顯色信號標簽進而可代替有色納米材料（圖2a），該種方法對AOZ的檢測限為2 ng/mL，同時試紙條的制作成本比其他方法低300倍。Dou等[46]根據結晶紫可以與蛋白質非共價結合的特性，通過使用結晶紫對mAb進行染色（圖2b），以AOZ為目標分析物，對其的檢測限為1.53 ng/mL。Song等[47]通過采用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）染色法使得大腸桿菌和大腸桿菌的單克隆抗體均攜帶上黃綠色的熒光（圖2c），這種方法對大腸桿菌的檢測限可達1 CFU/mL，靈敏度是常規膠體金試紙的10倍。Bu等[48]利用經典的革蘭氏染色法和直接免疫法對食品中的致病菌進行檢測，通過使用結晶紫對革蘭氏陰性菌沙門氏菌和革蘭氏陽性菌李斯特氏菌進行染色，染色后的病原菌即可作為顯色信號（圖2d），該方法對沙門氏菌的檢測限可達80 CFU/mL，對李斯特氏菌的檢測限為104CFU/mL。無納米標記材料法節省了試紙條制備過程中復雜的材料合成過程以及繁瑣的標記過程，僅僅通過染色的方法即可獲得檢測所需的有色信號，節省了時間，同時操作簡單、靈敏度較高，是一種基于染色的新型免疫層析技術。

圖2 無納米標記材料的側流免疫層析技術[45-48]Fig.2 Signal nanoparticles-free LFIA[45-48]

2.4 多元分析物同時檢測法

傳統的LFIA只能用來檢測一種目標分析物，檢測效率較低，不能滿足多種目標分析物的同時檢測需求。為了提升試紙條的檢測性能，近年來研究者開發了能夠同時檢測多元目標物的試紙條。

2.4.1 單通道多條T線多元檢測法 Han等[49]利用金納米顆粒標記八種不同待檢物質的mAb/受體，同時在試紙條NC膜上建立八個檢測區域以分別固定八種不同物質的捕獲抗原（圖3a），該種方法實現了對喹諾酮（quinolone，QN）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1）、三聚氰胺（melamine，MEL）、四環素（tetracycline，TC）、β-內酰胺類抗生素（β-lactams，BL）、氯霉素（chloramphenicol，CAP）、磺胺類藥物（sulfonamide，SA）和鏈霉素（streptomycin，STR）的同時檢測，檢測時間少于20 min[49]。這種方法雖然檢測效率高，但是每條檢測區域的顏色相同，因此在檢測過程中很容易混淆檢測目標物。為了克服這一缺點，Zhang等[50]開發出一種T線和C線顏色均不同的免疫層析試紙條用于檢測魚類中的兩種海藻毒素，該方法將紅色和綠色的熒光微球分別標記抗微囊藻毒素和岡田酸的mAb，T線區域分別固定兩種毒素的ag，樣品的加入和層析作用的進行即可在檢測線區域觀察到紅色和綠色的條帶，C線區域則是兩條T線顏色的混合色（圖3b）。檢測過程在20 min可以完成，對微囊藻毒素和岡田酸的檢測限分別為0.074和2.42 μg/kg。該方法可通過信號顏色的不同來區分不同的檢測目標物，使得結果更加容易辨別分析。

圖3 單通道多條檢測線的側流免疫層析技術[49-50]Fig.3 Single channel with multiple T line LFIA[49-50]

2.4.2 單通道單條T線多元檢測法 Shu等[51]采用混合雜交細胞技術制備了一種具有兩個抗原識別位點的雙功能抗體可用于同時識別甲基對硫磷和吡蟲啉，將此抗體固定于試紙條的一條檢測線上，結合時間分辨化學發光技術即可實現在一條T線上可完成對兩種物質的檢測（圖4a），在2.5和300 s時即可分別采集到甲基對硫磷和吡蟲啉的檢測信號結果。Fabio等[52]采用紅色和藍色的金納米材料分別標記抗AFB1和伏馬毒素（fumonisins B，FMB）的mAb，將兩種分析物的抗原混合固定于一條T線上，最終T線的顏色取決于分析物的種類、數量。檢測原理基于待檢物質和固定于T線處的相應抗原競爭結合相對應的金納米材料標記的mAb，樣品中存在待檢物質時，待檢物質優先和mAb結合，進而不與T線處的相應抗原結合，即T線處不出現該類物質對應的標記色。而樣品中不存在待檢物質時，納米材料標記的抗體即可與T線處的相應抗原結合出現相應的顏色，分析結果如圖4b所示。該方法對黃曲霉毒素和伏馬毒素的檢測限分別為1和50 ng/mL[52]。該方法和單通道多條T線檢測法相比，在試紙條的制備過程中節約了多條T線的制作所需要的劃線時間，操作比較簡單，但是此法在檢測目標物過多時，會使結果的觀察不直觀。

圖4 單通道單條檢測線的側流免疫層析技術[51-52]Fig.4 Single channel with one T line LFIA[51-52]

2.4.3 多通道多元檢測 近年來，為了實現LFIA的高通量檢測，不同的試紙條結構被設計（圖5），比如三通道120度交叉[53]、樹枝狀、花狀、圓盤形、四通道垂直交叉、通道一端平行排列、通道兩端平行排列等[54]。

圖5 多元檢測方法的檢測通道結構[53-54]Fig.5 Channel structure of multiple detection method[53-54]

Cheng等[29]開發了一種雙通道的LFIA以同時檢測兩種不同的目標分析物，同時可以消除兩個目標物之間的潛在交叉反應，該方法設置一個樣品墊，左右兩條通路分別各設置一個結合墊，一條T線和C線（圖6a），對乙草胺、甲氰菊酯的檢測限分別為0.63和0.24 ng/mL。Zhao等[55]開發了一種具有10通道的檢測試紙盤用以同時檢測10種食源性致病菌（圖6b），整個檢測過程在20 min內可完成，對菌體的檢測限可達到10 CFU/0.6 mg。Rong等[56]設計了一種可以同時檢測四種目標分析物的多通道測試筒，測試桶的頂部提供了樣品進樣通道，四個流體輸送通道由底盒密封，在420 r/min時產生的離心力可以將裝載的樣品溶液以1 mm/s的最大流速送入四個反應室（圖6c）。整個分析工作流程只包括以下幾部分：將樣品加入測試桶入口，快速旋轉以啟動免疫反應的自動送樣，最后將測試桶裝入讀條器進行旋轉和光信號掃描。該測試桶操作簡單，特別適合食品安全有害物質分析過程的現場實時檢測。

圖6 多通道多條檢測線的側流免疫層析技術[29,55-56]Fig.6 Multiple channel with multiplex T line LFIA[29,55-56]

2.5 多種信號的讀出方式

傳統的LFIA檢測結果主要分析出現在試紙條上條帶的顏色信號，通過比色的方法對物質進行定性和定量檢測。但是該方法在試紙顏色差異不明顯或者樣本背景顏色較深時會導致讀出結果不準確，近年來，為了提高試紙條結果的準確性，研究者開始探索其他的信號讀出方式。

2.5.1 化學信號 酶催化反應的高效性以及出現的相關顏色反應可被儀器設備所采集，進而使得試紙條的讀數方式不僅僅限于讀取條帶的顏色信號，通過采集酶催化反應出現的化學信號來提高試紙條讀數的準確性。Wang等[40]利用普魯士藍納米顆粒具有過氧化物酶活性，將層析之后的T線區域剪下來放入3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）溶液中，T線結合的普魯氏藍納米顆粒即可催化TMB產生藍色的化學信號。Hui等[57-58]使用魯米諾還原氯金酸制備魯米諾還原的金納米粒子（Luminol-reduced gold nanoparticles，LuReGNPs），同樣在免疫層析結束后將T線區域剪下來，在過氧化氫和辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）存在的條件下即可收集到化學發光信號。然而上述方法均需要剪T線區域，為了提升檢測試紙條的使用便捷性，Deng等[59]開發了一個小型檢測設備，所有需要的檢測試劑均預先儲存于該設備中。該設備由三部分組成：傳統的試紙條、化學發光試劑墊和聚碳酸酯殼（polycarbonate holder，PCH），試紙條的金納米顆粒同時標記HRP和檢測抗體，化學發光試劑墊中儲存有提前凍干的氧化劑過硼酸鈉和魯米諾。傳統的試紙條經過反應和肉眼定性分析后，用水溶解化學發光試劑墊上的試劑，接著將試劑墊覆蓋于試紙條上，試劑在HRP的催化下反應，生成化學發光信號用于定量檢測。

2.5.2 光熱信號 光熱材料在近紅外光的照射下可被加熱，溫度變化的信號可被溫度計或者紅外照相機采集。大多數研究表明通過讀取該溫度信號可提高LFIA的檢測靈敏度[60-62]。Zhang等[33]合成納米金功能化的花狀二氧化錳納米復合材料，該納米材料可做為光熱信號的標簽，在808 nm激光下輻照T線3 min，通過使用紅外照相機即可記錄溫度的變化。該方法對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測限為0.013 ng/mL，靈敏度是傳統膠體金試紙條的58倍。Li等[63]將金納米顆粒負載到二維黑磷納米片上（Au nanoparticleloaded two-dimensional black phosphorus，BP-Au），其具有較好的光熱轉換性能，通過結合抗體制成免疫層析試紙條的探針進而實現對恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）的檢測，該方法對ENR的檢測限為0.023 μg/L。Su等[64]也利用MnO2-Au納米復合材料的光熱特性檢測AOZ，該方法對其檢測限為0.43 ng/mL。光熱信號讀出模式的應用提供了更為準確的結果，同時具有強大的抗干擾能力，大大提升了試紙條的檢測性能。

2.5.3 拉曼信號 近年來，在LFIA中使用拉曼信號標記免疫探針的方法已經成為提高靈敏度的有效方法，該類信號穩定性較好，同時可以通過合理設計拉曼信號分子的結構，大大提高信號的強度進而提升檢測性能。Li等[65]將具有拉曼信號的5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）標記金納米顆粒，通過在LFIA中采集該探針的拉曼信號以實現對生鮮奶中的粘菌素的檢測。該方法對粘菌素的檢測限為0.10 ng/mL，遠遠低于用ELISA方法獲得的報告值和歐盟規定的最大殘留限量值。Su等[66]開發了以金納米顆粒為核，金納米星為殼，DTNB位于兩種材料中間，以最后形成的夾心結構作為拉曼信號的標簽，用該方法檢測食品中的克倫特羅，對其檢測限為0.05 ng/mL，檢測限比傳統的膠體金試紙條低200倍。同時金納米星形成的殼結構阻止DTNB被解吸，進而使得信號更加穩定。Sheng等[67]合成銀核金殼納米材料并將拉曼信號分子4-硝基噻吩（4-nitrothiophenol，4-NTP）封裝在核殼材料中間，最終形成的Ag4-NTP@Au作為拉曼信號標簽用以檢測百菌清（Chlorothalonil，CHL）、吡蟲啉（imidacloprid，IMI）和乙氧氟草醚（oxyfluorfen，OXY）。

2.6 增強顯色信號法

2.6.1 金屬染色增強法 為了提升試紙條的顯色信號，研究者試圖通過銀增強、金增強、銅增強及鉑增強方法提升信號的強度。銀增強法采用對苯二酚和銀鹽溶液（硝酸銀或乳酸銀）作為增強試劑，銀離子在金納米顆粒上被還原，顆粒尺寸因還原銀層的形成而增大，同時形成的銀層是黑色的，在NC膜的白色背景上更為明顯[68]。金增強法采用氯金酸（HAuCl4）和鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）通過金納米顆粒催化HAuCl4和NH2OH·HCl形成更大的金納米顆粒進而使得信號顏色更強[69-70]。銅增強法則利用抗壞血酸（ascorbic acid，AA）和硫酸銅（CuSO4），利用還原劑抗壞血酸可以將Cu2+還原為Cu+，然后在金納米顆粒存在的情況下Cu+轉化為銅，銅沉積于檢測線上也使得信號強度增強[71]。鉑增強法先使用硝酸銀、對苯二酚使得在試紙條上形成金核銀殼納米材料（Au@AgNPs），緊接著將氯鉑酸（H2PtCl6）和AA加入反應體系，進而形成Au@AgPtNPs實現信號放大的目的。但是上述方法操作繁瑣，延長了檢測時間[72]。為了解決上述方法的弊端，Yosita等[73]通過噴蠟打印法在試紙條上設置延遲通道和非延遲通道（圖7），免疫試劑置于非延遲通道，增強試劑（KAuCl4和NH2OH·HCl）置于設置有蠟障礙的延遲通道，層析過程中增強試劑的流動速度慢于免疫試劑的流速，試紙條可通過金增強方法的原理一步實現信號增強的目的。

圖7 帶有非延遲通道和延遲通道的側流免疫層析技術[73]Fig.7 LFIA with non-delay channel and delay channel[73]

2.6.2 酶催化染色增強法 生物酶具有高效的底物催化活性，進而會產生明顯的肉眼可見的顯色。利用這一特性，研究者試圖在試紙條的納米材料上同時標記單克隆抗體和辣根過氧化物，在常規讀取結果完成后，把試紙條放入含有底物的溶液中，酶催化底物產生更深的顯色信號，該方法使得檢測靈敏度提高一個數量級[74]。而近年來納米模擬酶由于其較高的穩定性，較好的底物催化活性也越來越引起研究者的關注。Liu等[25]采用磁性普魯士藍納米模擬酶作為試紙條的標記材料，同時其可催化顯色底物TMB顯色使得信號強度增強，進而提升試紙條的檢測靈敏度，該方法使得檢測范圍提高兩倍。

2.6.3 雙標記增強信號法 為了提升試紙條的檢測信號強度，研究者通過雙標記方法使得納米材料聚集在一起進而使得顯色信號增強。Fang等[75]利用生物素-鏈酶親和素（streptavidin, Sa）之間的高親和性，將金納米顆粒標記生物素化的抗體和Sa，通過生物素-Sa系統實現金納米顆粒的聚集，用該方法檢測吡蟲林，檢測靈敏度比傳統試紙條提高160倍。Zhong等[76]通過將納米金標記抗三聚氰胺的抗體以及抗牛血清白蛋白抗體，由于在試紙條的制備過程中會用到牛血清白蛋白封閉非特異性的結合位點，進而通過牛血清白蛋白抗原抗體系統實現納米顆粒的聚集。該方法使得檢測靈敏度提高10～25倍。Dou等[77]將納米金標記mAb和GAMA，通過抗體和二抗結合系統實現納米標記材料的聚集，進而起到增強檢測信號的目的，該方法和傳統的試紙條相比檢測限提高了5倍。

2.6.4 增加通道障礙增強信號法 影響LFIA檢測限和靈敏度的一個關鍵因素是樣品、免疫試劑和預先固定在T線的捕獲抗體/抗原之間的反應時間。近年來研究者通過降低液體在試紙條上的流動速率以增加該反應時間[78-79]。Ioannis等[80]采用激光直寫技術（laser-direct write，LDW）在NC膜的特定區域固定液態的光聚合物，在光聚合作用下其可于NC膜內形成一個較窄的流體通道（圖8a），液體流動通道空間收縮使得液體流速變慢，檢測區域變小，最終使得檢測靈敏度提高62倍。Amadeo等[81]在T線位置后的1 mm處設置可溶性蠟障礙，使得液體溶液短暫停留12 min（圖8b），進而延長了免疫試劑在試紙條上的反應時間，最終使得檢測靈敏度提高了51.7倍。

圖8 帶有通道障礙的側流免疫層析技術[80-81]Fig.8 LFIA with channel barrier[80-81]

3 結語

LFIA經過多年的不斷完善和發展，為食品安全檢測提供了一個方便、快捷和靈敏的技術平臺。該技術已經相對比較成熟，對部分分析物的檢測已實現商品化應用。目前面臨的主要挑戰及發展趨勢簡述如下：基于納米標記材料的檢測試紙存在材料合成步驟繁瑣、條件較為嚴苛、耗時耗能、穩定性及單分散性較差的缺陷，開發性能優良的信號標記材料仍然是未來發展的一大方向；近年來大部分試紙仍然利用mAb來實現對目標分析物的特異性識別，但是mAb制備過程耗時較長，需要耗費大量的人力、物力和財力，同時不同批次間存在差異。開發可替代mAb的特異性識別探針諸如核酸適配體、噬菌體及其細胞內溶素等對LFIA的發展具有重要的意義；檢測靈敏度必然是考查試紙條性能優良與否的重要參數，傳統的信號增強方法依賴額外的操作步驟進而使得試紙條的檢測時間延長，開發便捷、省時的一步信號增強方法對提高試紙條的檢測性能具有重要的意義；對多元目標物質的同時檢測雖然提高了檢測的效率，但是存在互相干擾的問題使得檢測靈敏度相對較低，因此也依賴于高特異性識別探針技術的發展。