玉米赤霉烯酮間接競爭ELISA方法的建立

唐 頌，李巖松，尚翠玲，胡 盼，盧士英，任洪林，柳增善，周 玉,2,

（1.吉林大學人獸共患病研究所，吉林長春 130062；2.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434023）

真菌毒素是一類由真菌產生的在自然界廣泛存在的小分子代謝產物，世界上近1/4的糧食作物受到真菌毒素的污染，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是玉米、小麥等糧食作物中污染最為廣泛的真菌毒素之一[1]。朱風華等對2017～2019年我國山東省6000余份飼料樣品進行真菌毒素污染狀況調查，發現玉米中ZEN污染率接近50%，并有逐年增高的趨勢[2-4]。ZEN具有很高的熱穩定性，在糧食生產、加工和儲存運輸過程中很難被完全去除，通過食物進入人體后嚴重危害人類的健康[5-6]。而ZEN通過飼料進入動物體內會影響動物的生長和繁殖機能，導致流產[7-8]；并抑制動物的免疫功能，誘發腫瘤[9]。

目前，全球100多個國家和地區都制定了ZEN的限量標準。如歐盟對原糧玉米中的ZEN限量為350 μg/kg，對粗加工玉米粉產品及人類食用需要再加工的其他玉米研磨制品的ZEN限量為200 μg/kg，對原糧谷物與可直接食用的玉米的ZEN限量為100 μg/kg，對嬰幼兒加工食品中的ZEN限量為20 μg/kg[10]；我國對玉米、玉米面、小麥和小麥粉中ZEN的限量為60 μg/kg[11]。除嬰幼兒食品外，單純從數值上看我國限量標準比歐盟更嚴格，但糧食的限量種類僅玉米和小麥兩種，原糧與成品糧的品種限量標準還不夠完善，且糧食在生產加工和貯存中會使毒素的含量增多，另外歐盟對嬰幼兒這類特殊人群食品的限量標準遠低于目前我國的限量標準。因此，建立一種ZEN的高靈敏度檢測法對保障糧食安全十分必要。

基于儀器分析技術的高效液相色譜法、熒光光度計法、液相色譜-質譜法是食品中ZEN的國標檢測方法[12]，薄層色譜法和ELISA是國標飼料中的檢測方法[13]，這些儀器分析方法具有檢測靈敏度高的優點，但檢測所需時間長，同時需要大型的儀器設備和專業的操作人員，不便于基層或現場檢測[14]。而間接競爭酶聯免疫分析法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）在ZEN的檢測中具有操作簡單快捷、普通從業人員便可操作、能夠滿足基層或現場檢測中大批樣品的初篩鑒定等優勢。為了增加ic-ELISA靈敏度，多使用各種生物傳感元件或納米材料在ELISA中起到信號放大的目的，在此基礎上可以使傳統ic-ELISA方法[15]的靈敏度由1900 ng/mL提高了一個數量級[16-17]，但是這些改進的ELISA方法使ELISA的操作變得更加復雜。傳統ic-ELISA在快速免疫檢測中仍然是最簡單實用、成本低廉、商業化產品最多的檢測類型。提高ELISA檢測靈敏度最核心的的問題還是提高目標抗體的特異性和靈敏度。本實驗將優選一組高質量的商品化的抗原、抗體，以期建立高靈敏的ic- ELISA檢測方法并用于后續相關免疫檢測方法研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ZEN、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol, DON）、伏馬毒素B1（Fumonisin B1，FB1）、T-2毒素（T-2）標準品 青島普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白偶聯ZEN抗原（ZEN-BSA）、ZEN單抗 大連百奧思科生物有限公司；辣根過氧化物酶標二抗（HRP-IgG） 北京中杉金橋生物技術有限公司；ZEN試劑盒 北京華安麥科有限公司；玉米面吉林省長春市某大型超市。

微孔板分光光度計 美國Biotek公司；高速離心機 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ic-ELISA檢測基本程序 用碳酸鹽緩沖液將ZEN-BSA包被于96孔板上，每孔100 μL，37 ℃恒溫溫育2 h。洗液（含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液）清洗三次，每孔200 μL，將板內殘余液體拍干。5%脫脂乳作為封閉劑，每孔200 μL，37 ℃恒溫封閉1 h，洗液清洗三次，拍干。競爭孔加入ZEN待測樣品和磷酸鹽緩沖液稀釋的單抗各50 μL，非競爭孔加入50 μL磷酸鹽緩沖液和50 μL單抗，陰性孔中加100 μL磷酸鹽緩沖液，37 ℃恒溫溫育1 h。洗液清洗三次，拍干。加入用5%脫脂乳稀釋2000倍的HRP-IgG，每孔100 μL，37 ℃恒溫溫育1 h。洗液清洗三次，拍干。加入100 μL TMB底物溶液，37 ℃避光顯色15 min。加入終止液（2 moL/L H2SO4），每孔50 μL，酶標儀讀取450 nm處的OD值[13]。

1.2.2 ic-ELISA檢測條件優化

1.2.2.1 包被抗原和單抗最佳工作濃度的確定 包被抗原BSA-ZEN用碳酸鹽緩沖液梯度稀釋至300、150、75、37.5、18.75、9.375、4.6875 ng/mL。ZEN

單抗用磷酸鹽緩沖液稀釋至1000、500、250、125、62.5、31.25、0 ng/mL。棋盤滴定法確定抗原和單抗的最佳工作濃度。

1.2.2.2 包被條件、封閉條件和底物作用時間的確定

在“1.2.2.1”的基礎上，進一步確定包被條件、封閉條件和底物作用時間。包被條件設置為4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、37 ℃ 0.5 h 、37 ℃ 1 h、37 ℃ 2 h。封閉條件設置為1% BSA、0.5% BSA、5% 脫脂乳、3%脫脂乳各1 h，同時做不封閉對照組。底物作用時間設置為5、10、15、20 min。最適條件確定以P/N比值最大進行判定。

1.2.3 標準曲線的建立 將標準品的濃度稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 pg/mL，用優化后的ic-ELISA進行測定。橫坐標為ZEN標準品濃度的對數值，縱坐標為抑制率，繪制標準曲線。

1.2.4 特異性 為確定該檢測方法的特異性，對500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81 pg/mL的ZEN以及10000、1000、100、10、1 ng/mL的OTA、AFB1、DON、FB1、T-2標準品進行ic-ELISA檢測，分別繪制標準曲線，并計算各毒素的半數抑制濃度（IC50），通過以下公式計算交叉反應率（CR）。

1.2.5 加標回收 稱取4份玉米面，每份1 g，將不同濃度ZEN標準品加入到玉米面中，使玉米面ZEN含量為20、15、5、2.5 μg/kg后，加入5 mL體積分數為70%的甲醇-水溶液中，充分振蕩5 min，超聲5 min，室溫下4000×g離心10 min，取磷酸鹽緩沖液稀釋20倍的上清，進行ic-ELISA檢測[18]。通過以下公式計算回收率。并用試劑盒進行驗證分析，繪制擬合曲線。

1.2.6 方法驗證分析 用本方法和北京華安麥科ZEN商品化試劑盒同時檢測3份ZEN加標量為120、80、60 μg/kg的玉米面樣品，每份3個重復，試劑盒檢測步驟參考說明書進行操作。

1.3 數據處理

本實驗中的數據均為3次平行實驗結果，并采用Microsoft Excel軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 包被抗原與單抗的最佳工作濃度

棋盤滴定法測定的OD450結果見表1，取OD450值接近1.0所對應的抗原、單抗質量濃度[19]，本著節省單抗的原則，確定抗原質量濃度為75 ng/mL，單抗質量濃度為250 ng/mL。

表1 包被抗原和單抗最佳濃度的確定Table 1 Optimal amount of coating antigen and monoclonal antibody

2.2 包被條件、封閉條件和底物作用時間的確定

包被條件與P/N值結果見圖1。從圖1中可以看出，4 ℃包被12和24 h的P/N值一致，37 ℃包被0.5 h P/N值較低，1和2 h的P/N值較高并接近，綜合37 ℃和4 ℃兩種條件下的P/N值，同時為了縮短檢測所需時間，選擇了37 ℃ 1 h的最佳包被條件。

圖1 抗原最佳包被條件的選擇Fig.1 Selection of optimal conditions for coating antigen

不同封閉條件與P/N值結果見圖2。從圖2中可以看出，不封閉和其他四種封閉P/N值之間不具有明顯差異，為節省反應時間，故本方法不需要封閉。

圖2 最佳封閉條件的選擇Fig.2 Selection of optimal conditions for blocking plate

酶催化底物的反應時間與P/N值結果見圖3。5～15 min，P/N值隨著酶作用時間的延長而增大，在15～20 min時P/N趨于平衡。因此，選擇酶催化底物的作用時間確定為15 min。

圖3 底物最佳作用時間的選擇Fig.3 Selection of optimal reaction time of substrate

2.3 標準曲線

標準曲線如圖4，以lg（ZEN的濃度）為自變量x，以抑制率的百分數為因變量y建立的曲線回歸方程為：y=42.19x-23.994，R2=0.9919。線性檢測范圍（IC20～IC80）為11～292 pg/mL，檢測限（IC10）為6 pg/mL，靈敏度（IC50）為57 pg/mL。

圖4 標準曲線Fig.4 Standard curve

2.4 特異性

該方法與5種常見真菌毒素的交叉反應見表2。與OTA、AFB1、DON、FB1、T-2毒素均無交叉反應，表明本方法具有良好特異性。

表2 單抗與其他5種真菌毒素的交叉反應率Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibody with 5 mycotoxins

2.5 回收率

玉米面ZEN加標回收實驗結果見表3。從表中可以看出平均回收率為81.29%～105.80%，變異系數小于10%，建立的ic-ELISA方法可滿足實際樣品中ZEN的檢測需要。

表3 玉米面中添加ZEN回收率Table 3 ZEN recovery added in corn flour

2.6 方法驗證分析

采用ZEN商品化ELISA試劑盒和本文建立方法同時對ZEN加標樣品進行驗證分析，結果如圖5所示：以本方法的檢測值為自變量x，以商品化試劑盒的檢測值為因變量y建立的曲線回歸方程為y=1.0267x-1.8403，R2=0.972（相關性較好）。因此，本方法適用于在玉米面中快速篩查ZEN。

圖5 ic-ELISA與商品化ELISA試劑盒相關性Fig.5 Correlation between ic-ELISA and commercial ELISA kit

3 結論與討論

本實驗建立的ZEN常規ic-ELISA方法靈敏度（IC50）達到了57 pg/mL，優于文獻[15,20]報道的常規ELISA方法靈敏度1900 pg/mL和130 pg/mL。此外，為提高ELISA檢測靈敏度，一些生物傳感器被引入ELISA中[21]。Liu等[17]基于親和素-生物素放大系統使IC50達到180 pg/mL；肖佳麗等[16]基于納米磁珠偶聯ZEN抗原和ZEN單抗雙標探針使IC50達到220 pg/mL；Liu等[22]基于納米磁珠-偶聯噬菌體模擬物（替代抗原）和化學發光底物建立ZEN的磁性噬菌體化學發光酶免疫（P-MCLEIA）檢測方法中IC50達到31.4 pg/mL，這些生物傳感器的引入都相對于傳統ELISA方法提高了靈敏度，但也增加了額外的探針制備過程和檢測步驟。本實驗建立的ic-ELISA方法，其靈敏度與國家標準中液相色譜-質譜法[12]相當，優于國家標準規定的熒光光度計法、高效液相法[12]、薄層色譜法和ELISA[13]，能夠滿足玉米面中ZEN的痕量快速檢測。

傳統ELISA方法靈敏度主要受抗原、抗體性質決定，實驗結果說明該ZEN抗體具有較好的特異性和靈敏度。后續將在前期完成ic-ELISA的基礎上，開發其它快速免疫學檢測方法。