基于機械敏感性陽離子通道Piezo1的黃芪丹參藥物血清對低流體切應力誘導的人內皮細胞功能紊亂的影響

張蒙，龔覺曉，毛晨晗，高昕，張丞波，王新東，

1.南京中醫藥大學第三臨床醫學院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028

血管內皮功能紊亂是高血壓、動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等血管穩態失衡性疾病的始動因素。流體切應力（FSS）是血流作用于血管壁表面產生的平行于血管壁的切線摩擦阻力，直接作用于血管壁表面內皮細胞（ECs）。FSS通過何種途徑完成力學向生物學信號的轉化從而影響內皮細胞功能，目前尚不十分清楚。有研究表明，與生物力學信號密切相關的新型跨膜蛋白分子機械敏感性陽離子通道Piezo1可能在其中扮演關鍵角色，Piezo1是ECs的FSS傳感器。中醫學認為，低FSS可從氣虛血瘀的病機角度認識，益氣活血法是治療AS等心血管疾病的關鍵治法，該法的代表藥對黃芪-丹參在治療心血管疾病氣虛血瘀證中應用廣泛。本研究基于機械敏感性陽離子通道 Piezo1觀察黃芪丹參藥物血清對低FSS誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）炎癥和功能紊亂的影響，探討其保護內皮細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

SD大鼠30只，體質量（220±30）g，雌雄各半，南京中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（蘇）2018-0049。動物飼養于清潔、（22±2）℃環境，自由攝食飲水，12 h明暗交替。本研究符合南京中醫藥大學倫理委員會動物實驗倫理規范（JL-A2020016）。HUVEC，美國ScienCell公司，貨號YS806C。

1.2 藥物及血清制備

黃芪、丹參飲片購于南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院中藥房，經江蘇省中醫藥研究院童黃錦藥師鑒定為豆科植物膜莢黃芪（Fisch.）Bge.和唇形科植物丹參Bge.的干燥根。根據臨床處方常用劑量，將黃芪、丹參以 2∶1比例配伍，按前期實驗方法制備原藥材濃度為1 g/mL的黃芪丹參水煎液。將30只大鼠隨機分為空白組和給藥組，每組15只，給藥組按4.7 g/（kg?d）灌胃黃芪丹參水煎液（相當于60 kg成人臨床用藥量的6.25倍），2次/d，連續7 d；空白組灌胃等體積生理鹽水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈取血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，0.22 μm濾膜過濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min，即得空白血清和黃芪丹參藥物血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

Piezo1激活劑Yoda-1（美國Selleck公司，貨號S6678），胎牛血清（FBS，美國 Gibco公司，貨號26140-079），內皮細胞培養基（ECM，美國ScienCell公司，貨號8578），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-CK-A211），一氧化氮（NO）、內皮素-1（ET-1）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號分別為A013-1、A018-1），白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號分別為 E-EL-R0012c、E-EL-H0109c），熒光定量 PCR試劑盒（日本Takara公司，貨號DRR096A），Piezo1兔多克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab259949），內皮型一氧化氮合酶（eNOS）兔多克隆抗體（英國 Abcam 公司，貨號ab252439），pro-IL-1β兔多克隆抗體（美國Proteintech公司，貨號16806-1-AP）。FSS加載分析設備（美國Flexcell公司，型號STR-4000），細胞培養載玻片（美國 Flexcell公司，型號 CS-U），CO培養箱（美國Thermo Fisher公司，型號HERAcell 150i），倒置顯微鏡（日本Olympus公司，型號CKX53），酶標儀（中國邁瑞公司，型號 MR-96A），流式細胞儀（美國Thermo Fisher公司，型號Attune NxT），RT-PCR儀（美國Applied Biosystems公司，型號ABI7500），電泳槽（美國Bio-Rad公司，型號Mini-Protean Tetra），電泳轉印槽（美國 Bio-Rad公司，型號 Mini Trans-Blot），型離心機（德國 Eppendorf公司，型號5417R）。

1.4 細胞培養、分組及造模

HUVEC用含20%FBS的ECM培養。將細胞分為空白組、模型組、Piezo1激活劑組和芪參血清組，每組5個復孔。消化收集細胞，接種于載玻片上，待細胞融合至80%左右時，給予相應干預。空白組、模型組予15%空白血清培養基，Piezo1激活劑組予含2 μmol/L Yoda-1的15%空白血清培養基，芪參血清組予15%黃芪丹參藥物血清培養基，各組繼續培養6 h后棄去上清液，將載玻片置于FSS加載分析設備流動小室中，按設備說明書操作，空白組加載正常FSS（1.2 Pa），其余各組加載低FSS（0.12 Pa），于加載6 h收集細胞及灌流液，檢測相關指標。

1.5 指標檢測

1.5.1 細胞活力檢測

收集各組細胞接種于96孔板，MTT法檢測細胞活力，每孔加入5%MTT溶液15 μL，37 ℃培養4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于酶標儀波長570 nm處檢測各孔OD值。

1.5.2 細胞凋亡檢測

各組細胞分別給予相應干預和FSS處理后，加入10 μL Annexin V-FITC和PI避光染色15 min，于流式細胞儀激發波長488 nm，發射波長530 nm（FITC通道）、617 nm（PI通道）處檢測細胞凋亡情況。

1.5.3 細胞灌流液一氧化氮、內皮素-1、白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α含量檢測

細胞灌流液3 000 r/min離心5 min，吸取上清液，硝酸還原酶法檢測總硝酸鹽（NOX）含量，以 NOX含量表示NO含量，均相競爭法檢測ET-1含量，ELISA檢測IL-1β和TNF-α含量。

1.5.4 RT-PCR檢測細胞Piezo1、內皮型一氧化氮合酶mRNA表達

收集各組細胞，PBS洗滌3次，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入Trizol提取總RNA，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒對樣品DNA進行分析。根據樣品的Ct值，采用2法測定Piezo1和eNOS mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測細胞Piezo1、內皮型一氧化氮合酶和pro-白細胞介素-1β蛋白表達

收集各組細胞，加入裂解液提取總蛋白并測定蛋白濃度。等量蛋白上樣，經 SDS-PAGE后，轉膜至PVDF膜（150 mA、90 min），5%脫脂奶粉封閉1 h，按1∶1 000比例分別加入Piezo1、eNOS和pro-IL-1β一抗，4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，化學發光法顯影。以GAPDH為內參，分析目的蛋白條帶相對表達量。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 黃芪丹參藥物血清對模型細胞活力的影響

MTT結果顯示，與空白組比較，模型組細胞活力顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，Piezo1激活劑組細胞活力無明顯變化（＞0.05），芪參血清組細胞活力顯著升高（＜0.01）。結果見表2。

表2 各組HUVEC細胞活力比較（±s，OD值）

2.2 黃芪丹參藥物血清對模型細胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細胞凋亡率顯著降低（＜0.01）。結果見圖1。

圖1 各組 HUVEC 凋亡比較（±s，n＝5）

2.3 黃芪丹參藥物血清對模型細胞一氧化氮、內皮素-1、白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α含量的影響

與空白組比較，模型組細胞灌流液NO含量顯著減少（＜0.01），ET-1、IL-1β和TNF-α含量顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細胞灌流液NO含量顯著增加（＜0.01），ET-1、IL-1β和 TNF-α含量顯著減少（＜0.01）。結果見表3。

表3 各組 HUVEC灌流液 NO、ET-1、IL-1β和TNF-α含量比較（±s）

2.4 黃芪丹參藥物血清對模型細胞 Piezo1和內皮型一氧化氮合酶 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組細胞 Piezo1和 eNOS mRNA表達降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細胞Piezo1和eNOS mRNA表達升高，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見表4。

表4 各組HUVEC Piezo1和eNOS mRNA表達比較（±s）

2.5 黃芪丹參藥物血清對模型細胞Piezo1、內皮型一氧化氮合酶和pro-白細胞介素-1β蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞Piezo1和eNOS蛋白表達顯著降低（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，Piezo1激活劑組和芪參血清組細胞 Piezo1和 eNOS蛋白表達顯著升高（＜0.01），pro-IL-1β蛋白表達顯著降低（＜0.05，＜0.01）。結果見圖2。

圖2 各組 HUVEC Piezo1、eNOS和 pro-IL-1β 蛋白表達比較（±s，n＝3）

3 討論

FSS在維持ECs功能穩態和AS病理進展方面發揮重要作用。AS的易感性與ECs不能在流動方向上排列有關，通常歸因于低FSS和/或振蕩FSS。生理性的層流FSS（1.5～7 Pa）能使ECs的形態沿血液流動方向拉伸變長，從而維持內皮穩態；低FSS（＜1.0～1.2 Pa）多發生在血管狹窄部位的下游和彎曲部位內側壁，使ECs不再沿流動方向排列，從而引起內皮功能紊亂，進一步激活炎癥信號，加速血管炎癥性疾病的進展。研究發現，FSS較低且受方向變化影響的動脈區域可表現出慢性低度炎癥；垂直于ECs骨架軸的FSS可激活炎癥，而平行方向的FSS則具有抗炎作用。

ECs能感應不同特征的血流，并相應地調節血管生理和重塑。FSS可觸發ECs釋放多種血管活性介質，其中由eNOS參與生成的NO被認為是最主要的血管舒張因子。血流誘導NO和前列環素呈劑量依賴性分泌是維持FSS恒定的穩態機制。本研究發現，低FSS可誘導HUVEC功能表型發生變化，主要表現為降低細胞活力，促進細胞凋亡，抑制血管舒張因子NO分泌，促進血管收縮因子ET-1分泌，降低eNOS mRNA和蛋白表達。黃芪丹參藥物血清可提高細胞活力，抑制細胞凋亡，促進血管舒張因子NO分泌，抑制血管收縮因子ET-1分泌，升高eNOS mRNA及蛋白表達，提示其對ECs具有保護和調節作用。

Piezo1廣泛存在于血管ECs和平滑肌細胞中，是機械敏感性陽離子通道，介導機械敏感陽離子電流。研究表明，Piezo1可被FSS和施加在ECs質膜上的側向力（膜張力）激活，且 Piezo1參與FSS誘導的ECs Ca內流和細胞排列。本研究發現，低FSS可誘導HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表達降低，Piezo1激活劑 Yoda-1可抑制低 FSS誘導的HUVEC凋亡，增加血管舒張因子NO分泌及Piezo1 mRNA和蛋白表達，驗證了Piezo1作為感受器在低FSS介導的HUVEC功能紊亂中的關鍵作用。黃芪丹參藥物血清可上調Piezo1 mRNA和蛋白表達，提示其可能通過激活Piezo1抑制低FSS誘導的 HUVEC損傷，從而發揮保護ECs和調節細胞功能的作用。

盡管Piezo1可以介導ECs的流量感應，并且在維持ECs功能中具有重要作用，但ECs Piezo1下游的機制仍不清楚。炎癥及炎性微環境的形成是誘導ECs功能障礙的關鍵機制之一。促炎因子IL-1β在AS炎癥的發生發展中起重要作用，靶向IL-1β是當前抗血管炎癥藥物研發的熱點。本研究發現，低 FSS可促進HUVEC炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌，上調pro-IL-1β蛋白表達，表明低FSS誘導的HUVEC損傷與炎癥的相關性。進一步研究發現，Piezo1激活劑Yoda-1和黃芪丹參藥物血清均可抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌，下調pro-IL-1β蛋白表達，提示Piezo1可能介導低FSS相關的ECs炎癥，而黃芪丹參藥物血清可能通過激活 Piezo1，抑制低 FSS誘導的HUVEC炎癥，從而發揮血管內皮保護效應。

綜上所述，低FSS可下調HUVEC Piezo1 mRNA和蛋白表達，激活 IL-1β介導的炎癥反應，誘導HUVEC凋亡和功能障礙，黃芪丹參藥物血清可上調HUVEC Piezol mRNA和蛋白表達，抑制促炎因子IL-1β和 TNF-α分泌，提示黃芪-丹參可能通過上調Piezo1表達，發揮抑制ECs炎癥反應、保護ECs功能的作用。