左歸降糖解郁方對糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮層IR/IRS-1信號通路和能量代謝的影響

楊蕙，朱青，李薇，雷詩卉，劉檢，孟盼，劉林，肖望重，王宇紅

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南 長沙 410208；3.湖南省腫瘤醫院，中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，湖南 長沙 410013

2020年發布的《中國居民營養與慢性病狀況報告》顯示，我國糖尿病患病率為11.9%，抑郁癥患病率為2.1%。臨床研究顯示，糖尿病與抑郁癥之間存在雙向誘發風險，但誘發因素和機制仍存在較多爭議。胰島素抵抗是糖尿病的典型病理特征，而針對肥胖型抑郁癥患者的臨床研究發現，胰島素抵抗的嚴重程度與患者的抑郁狀態呈正相關。糖尿病不僅會導致外周胰島素抵抗，也會導致中樞胰島素抵抗。胰島素在中樞具有多種神經調節功能，其可通過作用于胰島素受體（IR）參與調控能量代謝等過程和情緒、認知等神經行為。其中，神經元的能量代謝是細胞所有活動的基礎。研究認為，胰島素抵抗可通過影響葡萄糖轉運體（GLUT）的膜表達，干擾神經元的能量代謝。

左歸降糖解郁方是在經典名方左歸丸基礎上化裁而成。前期研究發現，左歸降糖解郁方可通過調節海馬、下丘腦胰島素信號改善糖尿病并發抑郁癥大鼠外周胰島素抵抗。研究還認為，左歸降糖解郁方對下丘腦胰島素信號的調節與其調控外周糖代謝相關度較高，而對海馬胰島素信號的調節則與改善動物抑郁樣行為和認知功能有關。前額葉皮層是 IR高表達的另一腦區，也是與抑郁癥密切相關的腦區之一。本實驗研究左歸降糖解郁方對糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮層 IR/IRS-1信號通路和能量代謝的影響，從而進一步豐富左歸降糖解郁方對多腦區調節的作用特點。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，體質量190～210 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心SPF級動物房，自由攝食飲水，實驗前適應性喂養3 d。

1.2 藥物

左歸降糖解郁方（黃芪、貫葉連翹、姜黃、熟地黃、山萸肉、枸杞子、菟絲子、杜仲、丹參、牡丹皮、牛膝），飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，并由醫學創新實驗中心制成原藥材濃度為1.14 g/mL水煎液（黃芪甲苷≥30 μg/mL、姜黃素≥0.4 mg/mL、貫葉金絲桃素≥18 μg/mL、丹酚酸B≥1.2 mg/mL、丹皮酚≥0.2 mg/mL）。動物造模用高脂乳劑（含10%膽固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%豬油、2%膽酸鈉、20%聚山梨酯 80和 20%丙二醇），醫學創新實驗中心制備，批號 20200306，-20 ℃冰箱保存，臨用前水浴加熱融化。

1.3 主要試劑與儀器

胰島素受體拮抗劑（S961 TFA），上海MCE公司，批號68525；鏈脲佐菌素（STZ），北京Solarbio公司，批號 1012C031；胰島素受體底物-1（IRS-1）、GAPDH、Na,K-ATPase α1抗體，美國CST公司，貨號分別為2382、7074、3010；p-IR、IR、p-IRS-1、GLUT4 抗體，江蘇 Affinity Biosciences公司，貨號分別為AF3099、AF6099、AF4424、AF5386；葡萄糖、丙酮酸 ELISA檢測試劑盒，南京建成生物工程公司，貨號分別為F006、A081；膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）ELISA檢測試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為206021、201651；超敏ECL試劑盒，蘇州新賽美生物科技有限公司，批號 20201201。ChemiDoc XRS+凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；SMART動物行為學檢測系統，美國東樂自然基因生命科學公司；Enspire多功能酶標儀，美國PerkinElmer公司。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

采用2周高脂乳劑灌胃（10 mL/kg）、一次性STZ（38 mg/kg）尾靜脈注射和4周慢性溫和不可預知應激的聯合造模方法建立糖尿病并發抑郁癥大鼠模型。48只大鼠隨機分為對照組、模型組、陽性藥（二甲雙胍0.18 g/kg＋氟西汀1.8 mg/kg）組、左歸降糖解郁方高（20.52 g/kg）、中（10.26 g/kg）、低（5.13 g/kg）劑量組，每組8只。給藥劑量根據人與大鼠體表面積換算，相當于60 kg成人用藥量的2、1、0.5倍，灌胃體積 10 mL/kg，對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每日1次，連續4周。給藥結束后禁食不禁水12 h，尾尖采血測量大鼠空腹血糖，隨后進行行為學實驗。

2.2 曠場實驗

曠場實驗主要觀察動物的自主活動行為和探究行為。實驗前將敞箱（80 cm×80 cm×40 cm）底部劃分為25個面積相等的方格。實驗時依次將大鼠從同一位置放入敞箱中并適應1 min，記錄大鼠3 min內活動次數。大鼠每經過1個方格或攀爬在箱壁上均記為1次活動。每只大鼠測評結束后，用消毒紙巾擦拭箱體，以免氣味相互干擾。實驗過程中保持房間內光線一致且安靜。

2.3 強迫游泳實驗

強迫游泳實驗用來評價大鼠的抑郁樣行為。將大鼠置于高40 cm、直徑20 cm的圓柱形玻璃缸內，缸中水位以大鼠伸展全身而尾部不碰觸缸底為準，將大鼠放入缸內適應1 min，記錄大鼠在3 min內的不動時間（以大鼠漂浮在水面且四肢不動或四肢輕微劃水為靜止不動）。實驗中注意保證同期實驗大鼠之間不可見，以減少干擾。

2.4 血清膽固醇和三酰甘油含量檢測

行為學檢測后，所有大鼠禁食過夜，次日上午以戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，1 200 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測血清TC和TG含量。

2.5 葡萄糖代謝檢測

取血后頸椎脫臼法處死大鼠并于冰上取腦，分離前額葉皮層組織于液氮中速凍，隨后轉移至-80 ℃冰箱保存。實驗前將前額葉皮層置于冰上快速勻漿，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測葡萄糖和丙酮酸含量。

2.6 Western blot檢測

將樣品分別用不同蛋白提取液處理，總蛋白提取液用于檢測IR、p-IR、IRS-1、p-IRS-1蛋白表達，膜蛋白提取液用于檢測GLUT4蛋白表達。BCA法測定蛋白濃度，依次對蛋白進行變性、凝膠電泳、濕式轉膜，脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入稀釋的GLUT4（1∶2 000）、p-IR（1∶1 000）、p-IRS-1（1∶1 000）、IR（1∶2 000）、IRS-1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）和 Na,K-ATPase α1（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，洗膜，ECL試劑顯色，采用Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

3 統計學方法

4 結果

4.1 左歸降糖解郁方對模型大鼠血糖、血脂的影響

與對照組比較，模型組大鼠空腹血糖、血清 TC和TG含量顯著增加（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠空腹血糖、血清TC和TG含量顯著減少（＜0.01，＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血糖、血脂含量比較（±s，mmol/L）

4.2 左歸降糖解郁方對模型大鼠抑郁樣行為的影響

與對照組比較，模型組大鼠強迫游泳實驗不動時間顯著延長，曠場實驗活動次數顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠強迫游泳實驗不動時間明顯縮短，曠場實驗活動次數明顯增加（＜0.01），左歸降糖解郁方中劑量組大鼠強迫游泳實驗不動時間明顯縮短（＜0.05），曠場實驗活動次數無明顯變化（＞0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠強迫游泳實驗和曠場實驗抑郁樣行為比較（±s）

4.3 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層能量代謝的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層葡萄糖含量顯著增加，丙酮酸含量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠前額葉皮層葡萄糖含量明顯減少，丙酮酸含量明顯增加（＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠前額葉皮層葡萄糖和丙酮酸含量比較（±s）

4.4 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層胰島素受體、胰島素受體底物-1蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值顯著降低（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中劑量組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比值顯著升高（＜0.01，＜0.05）。結果見圖1、表4。

表4 各組大鼠前額葉皮層p-IR/IR、p-IRS-1/IRS-1比較（±s）

圖1 各組大鼠前額葉皮層p-IR、IR、p-IRS-1、IRS-1蛋白免疫印跡

4.5 左歸降糖解郁方對模型大鼠前額葉皮層葡萄糖轉運體4蛋白膜表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠前額葉皮層 GLUT4蛋白膜表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高、中、低劑量組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白膜表達顯著升高（＜0.01）。結果見圖2、表5。

圖2 各組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠前額葉皮層GLUT4蛋白膜表達比較（±s）

5 討論

近年來有研究提出，腦胰島素抵抗是糖尿病和抑郁癥的共同病理機制。動物實驗發現，轉基因糖尿病小鼠存在腦胰島素信號紊亂，并從5月齡開始表現出明顯的抑郁樣行為。C57BL/6小鼠經高脂飼料喂養后也表現出明顯的焦慮和抑郁樣行為，且與腦胰島素信號損傷密切相關。糖尿病誘發的中樞胰島素抵抗會影響腦神經元存活和中樞能量代謝穩態。中樞胰島素抵抗的具體表現形式是以 IR/IRS-1為核心的胰島素信號異常。胰島素進入腦內后特異性作用于IR，進而誘導IRS-1磷酸化，激活PI3K、MAPK等多條下游信號通路，調節神經能量代謝和突觸可塑性等。前額葉皮層功能障礙與大部分情感障礙疾病相關，包括重度抑郁癥。但糖尿病并發抑郁癥是否存在前額葉皮層胰島素信號異常，目前并不清楚。本實驗發現，糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮層p-IR和p-IRS-1表達均顯著降低，提示前額葉皮層存在胰島素抵抗。

GLUT4是葡萄糖轉運蛋白家族的成員之一，由12個跨膜片段和1個位于N端的胞外環狀結構域組成。與肌肉組織類似，前額葉皮層中的GLUT4同樣屬于胰島素敏感性葡萄糖轉運蛋白，胰島素可刺激GLUT4從胞漿轉位到細胞膜，并增加神經元對葡萄糖的攝取。本研究發現，模型組大鼠前額葉皮層細胞膜表面GLUT4蛋白表達顯著降低，而前額葉皮層中葡萄糖含量顯著增加，提示糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮層可能存在神經元對葡萄糖的攝取異常，而丙酮酸的含量變化進一步確定了神經元對葡萄糖的攝取和利用異常。此外，推測模型大鼠前額葉皮層葡萄糖含量增加可能是由于糖尿病腦胰島素抵抗導致葡萄糖消耗減少，堆積增加。

左歸降糖解郁方中熟地黃為君，滋養腎陰；山萸肉、枸杞子為臣，合君藥以加強滋補腎陰作用；佐以菟絲子、牛膝、杜仲補肝腎，黃芪健脾益氣，丹參、牡丹皮活血散瘀，姜黃、貫葉連翹化瘀行氣、疏肝解郁。全方共奏疏肝解郁、活血化瘀之功。前期研究發現，左歸降糖解郁方可調節糖尿病并發抑郁癥大鼠部分腦區的胰島素信號。故本實驗觀察該方對大鼠前額葉皮層胰島素信號的干預作用。結果發現，左歸降糖解郁方可提高糖尿病并發抑郁癥大鼠前額葉皮層p-IR、p-IRS-1蛋白表達及GLUT4蛋白的膜表達，推測左歸降糖解郁方可通過改善前額葉皮層胰島素信號，促進GLUT4蛋白由細胞質向細胞膜轉位，從而增加神經元的能量利用。此外，左歸降糖解郁方降低前額葉皮層葡萄糖含量、增加丙酮酸含量的實驗結果為上述結論提供了佐證。同時實驗發現，左歸降糖解郁方高、中、低劑量對GLUT4的膜表達均有顯著影響，故推測該方可能不僅通過改善胰島素信號促進GLUT4膜轉位，其對GLUT4的易位是否還有直接或其他間接作用值得進一步深入研究。

綜上所述，左歸降糖解郁方可能通過調節大鼠前額葉皮層胰島素信號，改善神經元的能量代謝水平，從而發揮抗抑郁作用。