青黛對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織TGF-β/Smad信號通路相關因子表達的影響

苑致維 ，張爾馨 ，鄭沁薇 ，楊丹 ，吳悠 ，郝微微

1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海 200437；2.上海市中醫藥研究院脾胃病研究所，上海 200032

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及結直腸黏膜及黏膜下層，主要臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便，是消化系統的常見病、多發病。目前有關UC的病因、發病機制尚不明確。一般認為腸道免疫功能紊亂是主要原因。相關流行病學調查顯示，近年來 UC在亞洲國家患病率大幅增加。轉化生長因子-β（TGF-β）是一種多效性細胞因子，具有明顯的抗炎活性，活化的TGF-β與其受體結合，通過TGF-β/Smad信號通路調節黏膜免疫反應，促進組織修復，是治療UC的關鍵靶標。上海市名中醫馬貴同教授認為，濕、熱、瘀互結腸道為UC發病的關鍵，治以清熱化濕、活血止血，并以青黛、三七等中藥制成直腸給藥制劑清腸栓。既往對清腸栓進行多次拆方研究發現，方中青黛對UC治療起主要作用。課題組前期研究表明，青黛及其主要成分靛玉紅能不同程度修復 UC小鼠結腸損傷，促進黏膜愈合。本實驗在前期研究基礎上，基于TGF-β/Smad信號通路進一步探討青黛治療UC的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，6～8周齡，體質量（180±20）g，上海吉輝實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2017-0012。飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物實驗中心，溫度21～25 ℃，相對濕度 40%～70%，進食標準飼料，通風環境。本研究經上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物倫理委員會審查批準（YYLAC-2020-080）。

1.2 藥物及制備

青黛配方顆粒，購自上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院中藥房，批號19052101。將3 g青黛配方顆粒溶于20 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，配制成濃度為0.15 g/mL青黛混懸液。美沙拉嗪栓，黑龍江天宏藥業股份有限公司，批號191203，取1 g美沙拉嗪栓溶于20 mL 0.5%CMC-Na溶液，配制成濃度為0.05 g/mL美沙拉嗪液。

1.3 主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Bio公司，貨號SR01636；BCA蛋白定量檢測試劑盒，上海昕達生物科技有限公司，批號BL521A；組織裂解液、蛋白酶抑制劑、HE染色試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0013B、ZS018、C0105；化學發光試劑盒，美國 Thermo公司，批號 RJ238638；SDS-PAGE配膠試劑盒，上海雅酶生物科技有限公司，貨號 PG111-7.5；TGF-β、Smad2/3、p-Smad2/3抗體，美國CST公司，貨號分別為3711、8685、8828；糞便隱血試劑組，珠海貝索生物技術有限公司，批號BA-2020E；通用型RNA提取試劑盒、RT-PCR反轉錄試劑盒、SYBR-Green試劑盒，上海艾科瑞生物科技有限公司，批號分別為 AG21017、AG11706、AG11701。Synergy H4型多功能酶標儀（美國Bio Tek公司），TG16W微型離心機（北京天根生化科技有限公司），5417R型離心機（德國 Eppendorf公司），X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司），HERA safe KS12型超凈工作臺（美國Thermo Fisher公司），IX71/BX53型顯微鏡（日本Olympus公司），垂直電泳儀、電泳槽、轉膜儀（美國Bio Rad公司），TP1020自動脫水機（德國Leica公司），TEC-2601攤片機（上海精密儀器儀表有限公司），MX-S渦旋混勻儀（美國 Scilogex公司），EG1150H＋C石蠟包埋機（德國Leica公司），RM2235切片機（德國Leica公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

按隨機數字表法將40只大鼠分為正常組、模型組、青黛組、美沙拉嗪組，每組10只。適應性飼養1周，模型組、青黛組、美沙拉嗪組大鼠自由飲用5%DSS溶液7 d，制備UC大鼠模型，正常組飲用蒸餾水。

2.2 給藥

造模結束后，青黛組和美沙拉嗪組分別予青黛混懸液（0.27 g/kg）、美沙拉嗪液（0.1 g/kg）灌腸（給藥劑量按70 kg成人臨床常用劑量與大鼠體表面積換算），給藥體積 0.4 mL，正常組和模型組予等體積CMC-Na溶液灌腸，連續7 d。將大鼠置于固定器內，暴露肛門位置，一手固定其尾部，一手將采血軟管輕輕旋轉進入腸管（約7～8 cm），軟管另一端連接注射器，緩慢推入相應藥液，灌腸完畢拔出軟管，用紗布及夾子夾住肛門，提起大鼠尾巴倒懸15 min，將大鼠放回籠內，自由活動15 min后取下夾子。

2.3 疾病活動指數評分

每日記錄大鼠體質量變化，觀察大鼠糞便性狀改變，按試劑盒說明書檢測糞便隱血情況，計算大鼠疾病活動指數。疾病活動指數＝（體質量評分＋糞便性狀評分＋隱血評分）÷3。體質量評分標準：體質量無減輕計0分，體質量減輕≤5%計1分，5%＜體質量減輕≤10%計2分，10%＜體質量減輕≤15%計3分，體質量減輕＞15%計4分；糞便性狀評分標準：正常計0分，松散便計2分，水樣腹瀉計4分；隱血評分標準：正常計0分，隱血計2分，肉眼血計4分。

2.4 取材

干預結束后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置15 min，4 ℃、3 000/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用。取回盲部至遠端直腸區結腸，縱向剪開，預冷的生理鹽水沖洗2次，洗凈糞便，吸干水分，記錄結腸長度。每只大鼠取1 cm結腸，放入10%多聚甲醛中固定，用于后續病理觀察。其余結腸分裝于凍存管，置于-80 ℃冰箱保存。

2.5 HE染色

大鼠結腸置于10%多聚甲醛中固定2 d，蒸餾水沖洗5 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結腸組織病理變化。

2.6 Western blot檢測

取大鼠結腸，加入裂解液裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后，等量蛋白上樣，經SDS-PAGE、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入TGF-β（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和p-Smad2/3（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入相應二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，采用GelDoc Go凝膠成像系統曝光顯影，Image J圖像分析軟件分析目的蛋白灰度值。

2.7 RT-PCR檢測

稱取50 mg大鼠結腸，液氮中研磨成粉末，加適量裂解液，超低溫勻漿器勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，RNA提取試劑盒提取總RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度及純度，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。進行PCR，配制20 μL反應體系，按試劑盒說明書進行擴增，引物序列見表1，以β-actin為內參，采用2法分析mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

3 統計學方法

4 結果

4.1 青黛對模型大鼠疾病活動指數的影響

正常組大鼠反應靈敏、毛色光滑，體質量正常增長，糞便呈麥粒狀；模型組大鼠反應遲鈍、毛色黯淡、體形消瘦，糞質較軟，出現肉眼血便，其中因便血嚴重、體質量下降明顯死亡2只；青黛組、美沙拉嗪組大鼠上述表現均有不同程度改善，因便血嚴重、體質量下降明顯各死亡1只。

與正常組比較，模型組大鼠疾病活動指數明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，青黛組、美沙拉嗪組大鼠疾病活動指數明顯降低（＜0.05，＜0.01），見表2。青黛組、美沙拉嗪組肉眼血便轉為無血便。

表2 各組大鼠疾病活動指數比較（±s）

4.2 青黛對模型大鼠結腸長度的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸長度明顯縮短（＜0.01）；與模型組比較，美沙拉嗪組大鼠結腸長度明顯增加（＜0.05），青黛組大鼠結腸長度無明顯變化（＞0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠結腸長度比較（±s，cm）

4.3 青黛對模型大鼠結腸組織病理形態的影響

正常組大鼠結腸黏膜上皮完整，無充血及水腫，腺體結構完整，排列整齊，無潰瘍形成，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠結腸黏膜上皮破損，伴充血水腫，腺體排列紊亂，部分壞死或消失，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，并有潰瘍形成；青黛組及美沙拉嗪組大鼠結腸黏膜上皮損傷有所修復，腺體、杯狀細胞增多，排列較整齊，炎性細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織形態（HE染色，標尺＝100 μm）

4.4 青黛對模型大鼠結腸組織轉化生長因子-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織 TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，青黛組大鼠結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表達明顯升高（＜0.05），美沙拉嗪組大鼠結腸組織TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結果見表4、圖2。

表4 各組大鼠結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白表達比較（±s）

圖2 各組大鼠結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和p-Smad2/3蛋白免疫印跡

4.5 青黛對模型大鼠結腸組織轉化生長因子-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，青黛組大鼠結腸組織TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達明顯升高（＜0.05），美沙拉嗪組大鼠結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、Snail mRNA表達明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結果見表5。

表5 各組大鼠結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3和Snail mRNA 表達比較（±s）

5 討論

UC屬中醫學“痢疾”“腸澼”范疇。《素問?太陰陽明論篇》指出，“食飲不節，起居不時者，陰受之……陰受之則入五臟……入五臟則?滿閉塞，下為飧泄，久為腸澼”。主要因外感濕熱邪毒、情志失調、飲食不節等致濕熱瘀滯大腸，氣滯血瘀、脂膜血絡受損。

青黛味咸，性寒，歸肝、肺、胃經，有清熱、涼血、解毒之功。《仙拈集》記載久瘧飲治療久瘧：“青黛（澄去灰土）、雄黃（水飛）各等分。為末。每歲一分，空心及夜，淡醋湯下，塊消其病即止。”現代研究表明，青黛具有抑制炎癥反應、調節免疫、促進黏膜愈合等作用。本研究結果顯示，正常組大鼠結腸黏膜上皮完整，無充血及水腫，腺體結構完整，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠結腸黏膜上皮破損，伴充血及水腫，腺體排列紊亂，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤；青黛組和美沙拉嗪組大鼠結腸黏膜上皮損傷有不同程度修復，腺體增多，排列較為整齊，炎性細胞明顯減少。表明青黛能有效抑制炎癥反應，修復UC大鼠結腸損傷，促進黏膜愈合。

免疫功能障礙、易感基因及環境等綜合作用是導致UC發病的最主要原因，機體分泌大量炎癥介質與炎癥細胞因子造成腸黏膜受損。UC發病時，腸黏膜通透性發生改變，腸腔內有害物質進入黏膜固有層，進而激活免疫細胞，誘導炎癥反應發生。課題組前期研究發現，青黛可能通過調節 CD4CD25Treg細胞、CD4T細胞及Foxp3蛋白表達，發揮治療UC的作用。TGF-β是由多種細胞產生的多效性細胞因子，包括免疫細胞、上皮細胞和成纖維細胞，其作為抑制免疫反應、細胞增殖和腫瘤發生的細胞因子，可調節多種細胞功能。TGF-β可抑制腸道炎癥反應，有助于誘導免疫耐受，恢復受損的TGF-β信號通路被認為是治療炎癥性腸病的途徑。在Smad依賴的經典途徑中，p-Smad2和p-Smad3可形成二聚體后再與Smad4形成復合物，復合物可進入細胞核調節靶基因轉錄。研究顯示，炎癥性腸病腸內炎癥特征由TGF-β信號傳導受損、p-Smad2/3表達降低和Smad7（Smad3磷酸化抑制劑）表達升高引起。本實驗結果顯示，模型組大鼠結腸組織TGF-β、p-Smad2/3蛋白表達降低，青黛干預后，結腸組織TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3 蛋白及 TGF-β、Smad3、Snail mRNA表達上調，提示青黛可能通過TGF-β/Smad信號通路抑制炎癥反應，促進黏膜修復。

綜上所述，青黛在抑制UC大鼠炎癥反應和促進損傷修復兩方面同時發揮作用，其作用機制可能與TGF-β/Smad信號通路有關。青黛如何調控TGF-β/Smad信號通路發揮治療 UC的作用有待今后進一步研究。