靈芝菌株性狀穩(wěn)定性試驗(yàn)和品比試驗(yàn)

李希政徐作成夏宏志朱琳張智超王宏越

(1.吉林省生物研究所，吉林 長(zhǎng)春 130012；2.舒蘭市新安鄉(xiāng)綜合服務(wù)中心，吉林 舒蘭 132625)

靈芝(Ganoderma lucidum(Lesyss ex Fr.)Karst)在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目、靈芝菌科、靈芝屬[1]，以其較高的藥用價(jià)值在醫(yī)藥學(xué)史上具有兩千多年的歷史。其子實(shí)體木質(zhì)化，可以長(zhǎng)久保存，故有“萬(wàn)年菌”之稱[2]。在我國(guó)，靈芝有著悠久的歷史，是中國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的一顆璀璨明珠[3]。2000年，《中華人民共和國(guó)藥典》修訂版首次收錄赤芝為靈芝正品。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)靈芝產(chǎn)量達(dá)到16.8萬(wàn)t，比2017年產(chǎn)量增加22.13%，是世界上靈芝的主要生產(chǎn)和出口國(guó)[4]。靈芝含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、三萜、氨基酸、維生素、生物堿、甾醇類物質(zhì)等，而多糖和三萜是其中的主要藥效成分，其含量可作為衡量靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[5]。靈芝多糖具有降血壓、降血脂、降血糖、抗癌防癌、抗氧化、提高身體免疫力和增強(qiáng)體質(zhì)的作用，靈芝三萜具有保肝排毒、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤細(xì)胞、抗HIV病毒和抗炎等活性。此外，靈芝還具有強(qiáng)精、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解毒、利尿、凈血、美容等多種功效，是當(dāng)之無(wú)愧的萬(wàn)藥之首。可見(jiàn)，赤芝的藥用價(jià)值已經(jīng)深入應(yīng)用到醫(yī)療、保健上。目前，我國(guó)栽培的靈芝品種多為赤芝。但新品種選育較少，特別是吉林省栽培菌種多來(lái)源于南方，本地赤芝品種相對(duì)缺乏。通過(guò)對(duì)野生靈芝資源的選育研究，項(xiàng)目組成功選育出“吉芝1號(hào)”赤芝菌株，并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，穩(wěn)定其農(nóng)藝性狀，為該菌種的推廣打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

“吉芝1號(hào)”赤芝(由CJ12、SW6雜交選育)、CJ12(野生菌株)、SW6(長(zhǎng)白山菌種資源庫(kù))。

1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA試管加富培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蛋白胨1.5g、硫酸鎂1g、磷酸二氫鉀2g、維生素B11片，水1000mL，pH值自然。

原種培養(yǎng)料：木屑75%、麩皮18%、玉米粉5%、石灰1%、石膏1%，含水量控制在60%～65%，高壓聚丙烯袋高壓滅菌，袋溫降至28℃左右時(shí)無(wú)菌箱或超凈工作臺(tái)接種。

栽培木段：以硬雜木為主，接種前15d砍伐經(jīng)濟(jì)林疏枝，帶皮切段拼盤(pán)，含水量45%。常壓聚乙烯袋100℃滅菌12h以上。木段出鍋降溫至28℃左右即可進(jìn)行接種。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以CJ12和SW6為對(duì)照，采用段木栽培方式進(jìn)行“吉芝1號(hào)”性狀穩(wěn)定性試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)量為150段，3次重復(fù)，每次重復(fù)50段。每段段木濕重8kg，含水量45%。試驗(yàn)時(shí)間2020年和2021年。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，說(shuō)明“吉芝1號(hào)”性狀穩(wěn)定性。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，栽培所需要的母種、原種、栽培種培養(yǎng)基(料)要嚴(yán)格按照1.2中配方進(jìn)行配制，制作完成后滅菌。滅菌條件：母種培養(yǎng)基121～125℃滅菌20min,原種培養(yǎng)基121～125℃滅菌90～120min[6]，栽培種木段121℃滅菌6h悶鍋一夜，第2天出鍋接種。接種后，將其轉(zhuǎn)入25～28℃培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)。栽培種菌絲長(zhǎng)滿段木表面后，進(jìn)入后熟管理，然后移至栽培棚內(nèi)脫袋地埋出芝。出芝時(shí)，既要保證棚內(nèi)濕度85%～90%，又要保證棚內(nèi)避光，達(dá)到三分陽(yáng)七分陰的出芝條件，同時(shí)還要保證溫度達(dá)到28～30℃(靈芝屬高溫出芝真菌，低溫低產(chǎn))，并保證空氣新鮮。在發(fā)菌期間，子實(shí)體分化、生長(zhǎng)期間對(duì)二氧化碳敏感，應(yīng)注意通風(fēng)；若通風(fēng)不足，二氧化碳深度超過(guò)0.1%易形成鹿角狀的畸形芝[7]。前期，每天3次通風(fēng)，每次15min，后期酌情將棚門(mén)一側(cè)或兩側(cè)24h開(kāi)啟。當(dāng)靈芝芝蓋邊緣白色或黃色生長(zhǎng)圈消失并轉(zhuǎn)為棕褐色，菌蓋革質(zhì)化，菌蓋上有褐色孢子覆著時(shí)，說(shuō)明靈芝子實(shí)體已經(jīng)成熟，可以進(jìn)行采收。從子實(shí)體產(chǎn)孢子開(kāi)始用風(fēng)機(jī)吸附法進(jìn)行孢子粉采集，直至子實(shí)體采收。采收后的子實(shí)體進(jìn)行分級(jí)烘干，試驗(yàn)采用60℃烘箱烘干法。生產(chǎn)上還可以用風(fēng)干法、烘干房烘干法等。烘干的子實(shí)體可作為后續(xù)成分測(cè)定的原料。記錄子實(shí)體產(chǎn)量、孢子粉產(chǎn)量，計(jì)算生物學(xué)效率。并對(duì)子實(shí)體菌蓋厚度和菌蓋直徑進(jìn)行測(cè)量。利用劃線法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度，計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度cm·d-1。

1.3.2 品比試驗(yàn)

以CJ12和SW6為對(duì)照，采用段木栽培方式進(jìn)行品比試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)量為150段，3次重復(fù)，每次重復(fù)50段。每段段木濕重8kg，含水量45%。試驗(yàn)時(shí)間2020年和2021年。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定“吉芝1號(hào)”品比試驗(yàn)結(jié)果。品比試驗(yàn)栽培管理過(guò)程同1.3.1栽培管理過(guò)程。靈芝粗多糖提取依據(jù)NY/T 1676采用熱水浸提法。將干燥的子實(shí)體粉碎后，稱取2g，加入20mL蒸餾水充分?jǐn)嚢瑁?0℃水浴鍋中加熱2.5h，然后將其6000r·min-1離心3min，取上清液5mL。剩余樣品倒入10mL蒸餾水,90℃水浴加熱2.5h，不斷攪拌。重復(fù)離心取上清液5mL。2次離心合并共計(jì)10mL提取液。加入30mL無(wú)水乙醇進(jìn)行醇提15h，離心10min,將沉淀物取出加蒸餾水定溶至50mL，使沉淀物充分溶解。利用苯酚硫酸法對(duì)靈芝粗多糖進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，取平均值。三萜含量測(cè)定依據(jù)NY/SJ 339法進(jìn)行提取，檢測(cè)方法用香草醛-冰醋酸法。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)過(guò)程中記錄所得數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel和SPSS軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值進(jìn)行計(jì)算。多糖和三萜含量(%)按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)中，“吉芝1號(hào)”、CJ12、SW6 3個(gè)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。3個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)速、子實(shí)體大小、出芝率、產(chǎn)孢量及產(chǎn)量等具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和圖1。圖1為菌絲長(zhǎng)速比較。從圖1可知，3個(gè)菌株2021年菌絲長(zhǎng)速均優(yōu)于2020年。3個(gè)菌株的表現(xiàn)相同，說(shuō)明菌絲長(zhǎng)速差別來(lái)源于栽培管理的環(huán)境控制。2021年，穩(wěn)定性試驗(yàn)條件控制更加精確，所以整體而言，2021年靈芝菌絲長(zhǎng)速較快。同年3個(gè)菌株間比較可知，“吉芝1號(hào)”菌絲長(zhǎng)速最快，與CJ12和SW6之間達(dá)到顯著水平。對(duì)其它指標(biāo)而言，2020年，“吉芝1號(hào)”菌株子實(shí)體各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照CJ12和SW6；2021年，“吉芝1號(hào)”菌株子實(shí)體各項(xiàng)指標(biāo)同樣優(yōu)于對(duì)照CJ12和SW6。2a栽培試驗(yàn)中“吉芝1號(hào)”性狀相對(duì)穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，“吉芝1號(hào)”無(wú)論是生長(zhǎng)速度，還是子實(shí)體出芝率、產(chǎn)量、菌蓋厚度以及菌蓋直徑、性狀都較穩(wěn)定，而且比其它2個(gè)菌株具有明顯的農(nóng)藝性狀優(yōu)勢(shì)。對(duì)3個(gè)菌株2a間產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(T測(cè)驗(yàn)),計(jì)算得到P>0.05，說(shuō)明“吉芝1號(hào)”產(chǎn)量穩(wěn)定，2a產(chǎn)量間差異未達(dá)到顯著水平；生物學(xué)效率比較見(jiàn)圖2，“吉芝1號(hào)”2020年、2021年雖然出現(xiàn)差距，但對(duì)其進(jìn)行差異顯著性比較后發(fā)現(xiàn)P>0.05，2a的數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析其原因可能是2021年管理質(zhì)量有所提高，環(huán)境參數(shù)控制更為精確。

圖1 “吉芝1號(hào)”赤芝、CJ12、SW6 3個(gè)靈芝菌株菌絲長(zhǎng)速比較

圖2 2020年、2021年“吉芝1號(hào)”赤芝、CJ12、SW63個(gè)靈芝菌株生物學(xué)效率比較

表1 “吉芝1號(hào)”穩(wěn)定性試驗(yàn)的農(nóng)藝性狀特征

2.2 品比試驗(yàn)結(jié)果

品比試驗(yàn)中，“吉芝1號(hào)”、Cj12、SW6 3個(gè)菌株進(jìn)行段木栽培對(duì)比試驗(yàn)。3個(gè)靈芝菌株的品質(zhì)指標(biāo)參見(jiàn)表2中數(shù)據(jù)。品質(zhì)檢測(cè)時(shí)，子實(shí)體粗多糖含量測(cè)定依據(jù)是NY/T 1676法，三萜含量測(cè)定依據(jù)NY/SJ 339法。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析(SPSS分析法)，“吉芝1號(hào)”粗多糖含量較高，在顯著水平和極顯著水平上，均與CJ12、SW6有明顯差異。三萜含量連續(xù)2a相對(duì)較穩(wěn)定，與CJ12、SW6比較，“吉芝1號(hào)”子實(shí)體三萜含量較高，在0.05水平上達(dá)到顯著水平，在0.01水平均達(dá)到極顯著水平。

表2 品比試驗(yàn)中子實(shí)體品質(zhì)指標(biāo)

3 討論與結(jié)論

靈芝(赤芝)具有較高的藥用價(jià)值和保健價(jià)值，其子實(shí)體產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響栽培戶的經(jīng)濟(jì)收益。而靈芝產(chǎn)量與菌株性狀穩(wěn)定性緊密相關(guān)，靈芝多糖、三萜含量的高低與藥用價(jià)值有直接關(guān)系。因此，觀察“吉芝1號(hào)”菌株栽培中的性狀穩(wěn)定性和品質(zhì)極為重要。通過(guò)2020年和2021年連續(xù)2a的栽培比較，可以發(fā)現(xiàn)“吉芝1號(hào)”在栽培中產(chǎn)生的性狀變化。

“吉芝1號(hào)”是CJ12、SW6 2個(gè)菌株選育的新赤芝品種，在農(nóng)藝性狀上，“吉芝1號(hào)”具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、品質(zhì)高的特點(diǎn)，且子實(shí)體蓋厚、直徑大。在2020年和2021年連續(xù)的穩(wěn)定性試驗(yàn)中，該菌株產(chǎn)量表現(xiàn)穩(wěn)定，產(chǎn)量間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明“吉芝1號(hào)”產(chǎn)量性狀能夠穩(wěn)定遺傳，無(wú)性狀分離等不穩(wěn)定性狀現(xiàn)象。在2020年、2021年2a的品比試驗(yàn)中，“吉芝1號(hào)”的粗多糖和三萜含量也較其它2個(gè)菌株高，經(jīng)過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)分析，差異達(dá)到顯著水平。因此，“吉芝1號(hào)”具有農(nóng)藝性狀穩(wěn)定性特征，且三萜含量較高，為相關(guān)深加工提供了可靠的菌種資源。